CN109813796B - 一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法 - Google Patents

一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法，属于质谱成像技术领域。该成像方法包括以下步骤：将甜瓜组织冷冻后切片，将组织切片粘附在导电载玻片上，自然风干；采集风干的甜瓜组织切片的光学图像；将风干后的甜瓜组织切片蒸镀CHCA，再喷涂色谱级纯甲醇；将涂覆基质后的甜瓜组织切片激光解析电离；通过数据处理软件处理获得目标物质氯吡脲在甜瓜组织切片上相应质谱图像并与光学图像重合进行比较分析，得到氯吡脲在甜瓜组织中的空间分布情况。该方法快速简便，无需复杂前处理技术，将光学图像和质谱信息整合为一体，既观察到高分辨率的形态图像，又能对氯吡脲分子鉴定和可视化分布分析，为研究氯吡脲在甜瓜果实的空间分布提供新方法。

Description

一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法
技术领域
本发明属于属于质谱成像技术领域，具体涉及一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法。
背景技术
甜瓜(Cucumis melon L.)是全世界重要的园艺作物，因其果实甘甜，香气浓郁，富含蛋白质、碳水化合物、维生素等多种营养素，在我国果蔬生产和消费中占据重要地位。氯吡脲是一种具有细胞分裂素活性的苯基脲类植物生长调节剂，由于甜瓜自身复杂的性型及栽培环境条件的限制，在设施甜瓜种植中氯吡脲作为坐果剂被广泛应用，给广大果农和企业带来了巨大的经济效益，同时氯吡脲的使用也给农产品安全带来了严峻的挑战与威胁。目前，关于氯吡脲在农作物中的时间分布规律研究已经很多，氯吡脲在黄瓜、西甜瓜中的消解较快，半衰期为1.4～7.1d，药后14d时氯吡脲的母体消解达到80％以上，而氯吡脲在农作物中的空间分布规律研究相对却很少。
成像质谱显微镜(iMScope TRIO)在前端搭配高分辨的光学显微镜，后端质谱采用基质辅助激光解析电离源加离子阱和飞行质谱串联质谱(MALDI-IT-TOF-MS)，将光学显微镜和质谱仪整合为一体，既可以观察到高分辨率的形态图像，又可以对特定的分子进行多级鉴定和可视化分布分析。同时基质辅助激光解析电离是一项快速、高通量检测未知物质的新兴技术，该技术能有效地通过生物分子的离子化，检测其在组织样品中的准确位置。但是辅助基质易对目标物产生干扰，造成目标物响应较低，不能实现精准定位。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法，通过提高氯吡脲离子化响应，直接得到甜瓜组织上氯吡脲分子的空间分布情况，而且实现有效去除传统质谱中基质的干扰，准确成像。
本发明提供的一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法，包括以下步骤：
1)将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别进行冷冻切片，将得到的两种组织切片转移至导电载玻片上，自然风干；
2)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别用带有激光的成像质谱仪采集光学图像，得到施药组甜瓜组织切片光学图像和空白对照组甜瓜组织切片光学图像；
3)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸，再喷涂色谱级纯甲醇，得到施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片；
4)将步骤3)中所述施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片在质谱仪中进行激光解析电离，得到施药组甜瓜组织切片质谱图像和空白对照组甜瓜组织切片质谱图像；
5)通过数据处理软件处理获得氯吡脲在甜瓜组织切片上相应质谱图像，并与步骤2)中所述施药组甜瓜组织切片光学图像重合比较分析，根据空白对照组甜瓜组织质谱图像与光学图像重合比较分析结果，去除甜瓜组织自身基质干扰，得到氯吡脲在甜瓜组织中的空间分布情况。
优选的，步骤4)中所述激光解析电离包括一级质谱和二级质谱；
所述一级质谱的条件如下：测定模式为正离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为45Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件如下：测定模式为正离子模式，前体离子为248.05，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为51Hz，激光径为25μm。
优选的，步骤3)中蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸的时间为20min。
优选的，步骤3)中喷涂色谱级纯甲醇的体积为1mL/导电载玻片。
优选的，步骤1)中所述冷冻切片前，将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别置于液氮中冷冻。
优选的，步骤1)中所述切片采用冷冻切片机进行；所述冷冻切片机的温度设置为-18℃。
优选的，步骤1)中所述切片时每次切片的厚度为35μm。
优选的，所述氯吡脲溶液处理的甜瓜组织是将甜瓜幼果开花当日用氯吡脲溶液处理，处理后2h摘取获得。
优选的，步骤1)中所述氯吡脲溶液的浓度为20mg/L；所述氯吡脲溶液处理的时间为3～5s。
优选的，所述未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织是甜瓜幼果开花后当天进行人工授粉，授粉后2h摘取获得。
本发明提供一种植物生长调节剂氯吡脲在甜瓜组织中质谱成像方法，选用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为基质，可提高氯吡脲离子化的响应，同时在涂覆时先蒸镀CHCA后，再喷涂色谱级纯甲醇的两步式涂覆方法，可进一步提高氯吡脲离子化响应。在激光解析电离后采用电离质谱成像技术直接对甜瓜组织上氯吡脲分子的空间分布情况，根据空白对照组甜瓜质谱图像去除甜瓜组织自身干扰，得到的质谱图像再与同组获得的光学图像重合比较分析，可较好的去除传统质谱中基质的干扰，准确成像。
同时，本发明提供的成像方法，切片制样方法简单，无需使用其他物质对样品进行固定及包裹，可直接切片且切片完整度较高，目标物保留较好。
附图说明
图1为在9-氨基吖啶(9AA)、二羟基苯甲酸(DHB)、CHCA三种不同基质下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲得到的质谱图，其中图1-1为9AA基质下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲得到的质谱图；图1-2为DHB基质下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲得到的质谱图；图1-3为CHCA基质下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲得到的质谱图；
图2为在9AA、DHB、CHCA三种基质涂覆下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲得到的质谱成像图；
图3为采用蒸镀、喷涂与喷涂加酸三种涂覆方式下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测母离子及子离子响应值柱状图，其中图3-1为氯吡脲标准品；图3-2为施药组甜瓜中氯吡脲；
图4为采用蒸镀、蒸镀后喷涂CHCA、蒸镀后喷涂甲醇三种涂覆方式下，利用激光解析后电离飞行时间质谱仪检测氯吡脲母离子及子离子响应值柱状图，其中，图4-1为氯吡脲标准品；图4-2为施药组甜瓜中氯吡脲；
图5为实施例4中空白对照组与施药组甜瓜组织切片光学图像，其中图5-1为空白对照组甜瓜组织切片光学图像，图5-2为施药组甜瓜组织切片光学图像；
图6为空白对照组与施药组甜瓜组织切片中氯吡脲二级离子质谱成像图，其中图6-1为空白对照组甜瓜组织切片中氯吡脲二级离子质谱成像图；图6-2为施药组甜瓜组织切片中氯吡脲二级离子质谱成像图。
具体实施方式
本发明提供的一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法，包括以下步骤：
1)将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别进行冷冻切片，将得到的两种组织切片转移至导电载玻片上，自然风干；
2)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别用带有激光的成像质谱仪采集光学图像，得到施药组甜瓜组织切片光学图像和空白对照组甜瓜组织切片光学图像；
3)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸，再喷涂色谱级纯甲醇，得到施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片；
4)将步骤3)中所述施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片在质谱仪中进行激光解析电离，得到施药组甜瓜组织切片质谱图像和空白对照组甜瓜组织切片质谱图像；
5)通过数据处理软件处理获得氯吡脲在甜瓜组织切片上相应质谱图像，并与步骤2)中所述施药组甜瓜组织切片光学图像重合比较分析，根据空白对照组甜瓜组织质谱图像与光学图像重合比较分析结果，去除甜瓜组织自身基质干扰，得到氯吡脲在甜瓜组织中的空间分布情况。
本发明将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别进行冷冻切片，将得到的两种组织切片转移至导电载玻片上，自然风干。
在本发明中，所述氯吡脲溶液处理的甜瓜组织优选是将甜瓜幼果开花当日用氯吡脲溶液处理，处理后2h摘取获得。所述氯吡脲溶液的浓度优选为20mg/L；所述氯吡脲溶液处理的时间优选为3～5s。所述未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织优选是甜瓜幼果开花后当天进行人工授粉，授粉后2h摘取获得。摘取甜瓜后，优选用锡箔纸包裹。将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别置于液氮中冷冻，然后放置-80℃冰箱中冻存备用。
在本发明中，所述切片优选采用冷冻切片机进行；所述冷冻切片机的温度设置优选为-18℃。所述切片时每次切片的厚度优选为35μm。本发明对所述冷冻切片机的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的冷冻切片机即可。在本发明实施例中，所述冷冻切片机为Leica CM1950冷冻切片机。
在本发明中，将切片后的甜瓜组织切片转移至导电载玻片，将甜瓜组织切片平铺粘附于导电载玻片上。所述导电载玻片的规格优选为25mm×75mm。所述甜瓜组织切片为完整甜瓜果实纵切截面，所述完整甜瓜果实纵切截面的长度优选为2～3cm，所述完整甜瓜果实纵切截面的宽度优选为1～1.5cm。
自然风干后，本发明将两种风干后的甜瓜组织切片分别用带有激光的成像质谱仪采集光学图像，得到施药组甜瓜组织切片光学图像和空白对照组甜瓜组织切片光学图像。
在本发明中，所述采集光学图像的倍数为1倍～2.5倍目镜。
得到两组光学图像后，本发明将两种风干后的甜瓜组织切片分别蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸，再喷涂色谱级纯甲醇，得到施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片。
在本发明中，所述蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸用仪器优选为采用蒸镀装置(iMLayer)。所述蒸镀装置采用自动设定模式进行。蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸的时间优选为20min。
在本发明中，喷涂色谱级纯甲醇用仪器优选为手持式喷枪。喷涂色谱级纯甲醇的体积优选为1mL/导电载玻片。所述色谱级纯甲醇购自从Fisher公司。
涂覆基质后，本发明将所述施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片在质谱仪中进行激光解析电离，得到施药组甜瓜组织切片质谱图像和空白对照组甜瓜组织切片质谱图像。
在本发明中，所述激光解析电离优选包括一级质谱和二级质谱；
所述一级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为45Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，前体离子为248.05，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为51Hz，激光径为25μm。
通过空白对照组与施药组质谱成像图可以看出，氯吡脲在施药组甜瓜组织中有较明显分布，同时在施药组中氯吡脲子离子响应较高，其中子离子129.02的响应为5×103，子离子155.00的响应为2.5×103；在对照组中氯吡脲子离子响应较低，子离子129.02的响应为400，子离子155.00的响应为50，且无明显分布，基本可排除甜瓜组织自身干扰。
得到施药组甜瓜组织切片质谱图像和空白对照组甜瓜组织切片质谱图像后，本发明根据空白对照组甜瓜组织切片质谱图像，去除施药组甜瓜组织切片质谱图像中甜瓜组织自身干扰，再通过数据处理软件处理获得氯吡脲在甜瓜组织切片上相应质谱图像，并与所述施药组甜瓜组织切片光学图像重合比较分析，得到氯吡脲在甜瓜组织中的空间分布情况。
在本发明中，对空白对照组采用与施药组相同的前处理方法及质谱条件，根据空白对照组甜瓜组织切片质谱图像中的分布响应，排除施药组甜瓜组织切片质谱图像是由甜瓜组织自身基质干扰而产生的可能。所述数据处理软件优选为成像MS SolutionVersion1.30软件(Shimadzu，Tokyo，Japan)。质谱图像和光学图像重合分析的方法采用所述软件常规处理即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
原料处理：采用甜瓜样品于2018年7月至10月在中国农业科学院试验基地的温室进行，分为施药组甜瓜及对照组甜瓜，施药组甜瓜为甜瓜幼果开花当天使用20mg/L氯吡脲药液对其进行浸蘸3-5s，2h后摘取；空白对照组甜瓜为甜瓜幼果开花后当天进行人工授粉，2h后摘取；甜瓜果实摘取后用锡纸包裹置于液氮中迅速冷冻后置于-80℃冰箱中储存至使用。
本发明提供的甜瓜组织中氯吡脲的质谱成像方法，包括以下步骤：
(1)将备用的甜瓜果实冷冻后使用冷冻切片机切片，冷冻切片机温度设置为-18℃，切片厚度为35μm，切片后将组织切片粘附在导电载玻片上，自然风干；
(2)在甜瓜组织切片上滴加100mg/mL氯吡脲标准溶液，使用移液枪在空白对照组甜瓜组织切片上进行滴加，滴加量为1μL，每个浓度平行滴加三次，并静置30s使其扩散均匀并干燥；
(3)将甜瓜组织切片放置于成像质谱仪中，分别获得施药组完整甜瓜组织切片光学图像及空白对照组滴加氯吡脲标准品部位光学图像；
(4)在甜瓜组织切片上采用蒸镀的方式进行基质的涂覆辅助激光解析电离基质CHCA20min；
(5)将涂覆基质后甜瓜组织切片根据步骤(3)中拍照定位的光学图像位置在质谱仪中进行电离；所述激光解析电离优选包括一级质谱和二级质谱；所述一级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为45Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，前体离子为248.05，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为51Hz，激光径为25μm；
(6)通过数据处理软件处理获得目标物质氯吡脲在甜瓜组织切片上相应质谱图像，并与光学图像重合进行比较分析。
对比例1
采用对比例1的方法实施，不同之处在于涂覆基质为9-氨基吖啶(9AA)。
所述一级质谱的条件优选如下：测定模式为负离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为50Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件优选如下：测定模式为负离子模式，前体离子为246.04，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为50Hz，激光径为25μm。
对比例2
采用对比例1的方法实施，不同之处在于涂覆基质为二羟基苯甲酸(DHB)。
所述一级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为55Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件优选如下：测定模式为正离子模式，前体离子为248.05，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为50Hz，激光径为25μm。
由实施例1和对比文件1～2可知，分别获得氯吡脲标准品一级及二级质谱图。三种基质对氯吡脲母离子均存在较强干扰，因此对其二级质谱响应做出比较，二级质谱图如图1所示。
根据三种基质下的最佳质谱条件，分别使用三种基质对同一施药组甜瓜样品中氯吡脲的分布做出检测，氯吡脲在施药组甜瓜样品分布如图2所示。
通过比较可得，在甜瓜样品中，三种基质对氯吡脲母离子都存在一定干扰，但在二级质谱中，使用CHCA基质氯吡脲可获得较好的响应，且无基质干扰，因此最终选用辅助激光解析电离基质为CHCA。
对比例3
采用对比例1的方法实施，不同之处在于涂覆的方法选用喷涂法进行，具体使用甲醇将CHCA配制为15mg/mL溶液，取1mL加入到手动喷枪中对样品进行喷涂。喷雾中含有机溶剂可对目标物进行一定萃取，也可加酸加盐提高目标物响应，同时也因操作者个人问题易出现结晶颗粒大，喷涂不均匀等现象。
实施例1中蒸镀法采用蒸镀装置(iMLayer)进行实现，与喷雾法相比，无需有机试剂，但具有结晶颗粒小而均匀的特点，重现性较好。本发明首先对喷涂及蒸镀两种涂覆方式进行比较，同时为提高目标物响应，同时比较喷涂液中加入0.1％甲酸的方式，以氯吡脲标准品及施药组甜瓜样品中氯吡脲母子及子离子响应值大小为判断依据，结果如图3，通过比较可得，蒸镀方式响应值较高，因此选用蒸镀的方式对基质进行涂覆。
实施例2
按照实施例1中甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法实施例，不同之处在于：步骤(4)中选用基质CHCA，使用蒸镀的方式对基质进行涂覆，为提高氯吡脲的响应，也可使用两步法对基质进行涂覆，即蒸镀基质CHCA后再使用1mL甲醇溶液进行喷涂。
对比例4
按照实施例2中甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法实施例，不同之处在于：使首先采用蒸镀装置(iMLayer)蒸镀CHCA 20min，蒸镀后用1mL浓度为15mg/mL的CHCA溶液进行喷涂。
以氯吡脲标准品及施药组甜瓜样品中氯吡脲母子及子离子响应值大小为判断依据，结果如图4。通过比较可确定最终基质的涂覆方式为两步法，首先采用蒸镀装置(iMLayer)蒸镀CHCA，蒸镀后采用手持式喷枪在甜瓜组织切片上喷涂1mL甲醇溶液效果最佳。
实施例3
甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法中：
步骤(1)分别选取空白对照组及施药组甜瓜切片，并分别贴附于同一载玻片上。
步骤(2)不在对照组甜瓜上滴加标准品。
步骤(3)只分别获得对照组及施药组整体甜瓜组织切片的光学图像如图5所示。
步骤(4)使用基质为CHCA；基质涂覆方式为两步法，首先采用蒸镀装置(iMLayer)蒸镀CHCA，蒸镀后采用手持式喷枪在甜瓜组织切片上喷涂1mL甲醇溶液。
步骤(5)在对照组及施药组设置相同一级及二级质谱条件，进行激光照射。
步骤(6)通过数据软件对甜瓜组织中氯吡脲的二级成像图进行提取，将对照组与施药组进行对比，排除甜瓜组织自身干扰，结果如图6所示。
通过空白对照组与施药组质谱成像图可以看出，氯吡脲在施药组甜瓜组织中有较明显分布，同时在施药组中氯吡脲子离子响应较高，其中子离子129.02的响应为5×103，子离子155.00的响应为2.5×103；在对照组中氯吡脲子离子响应较低，子离子129.02的响应为400，子离子155.00的响应为50，且无明显分布，基本可排除甜瓜组织自身干扰，确定该质谱图像为氯吡脲在甜瓜组织中的分布，说明本发明在甜瓜中氯吡脲的质谱成像方法是可靠的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于甜瓜组织中氯吡脲质谱成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别进行冷冻切片，将得到的两种组织切片转移至导电载玻片上，自然风干；
2)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别用带有激光的成像质谱仪采集光学图像，得到施药组甜瓜组织切片光学图像和空白对照组甜瓜组织切片光学图像；
3)将步骤1)中两种风干后的甜瓜组织切片分别蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸，再喷涂色谱级纯甲醇，得到施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片；
蒸镀α-氰基-4-羟基肉桂酸的时间为20min；
4)将步骤3)中所述施药组涂覆基质的甜瓜组织切片和空白对照组涂覆基质的甜瓜组织切片在质谱仪中进行激光解析电离，得到施药组甜瓜组织切片质谱图像和空白对照组甜瓜组织切片质谱图像；
5)通过数据处理软件处理获得氯吡脲在施药组甜瓜组织切片上相应质谱图像，并与步骤2)中所述施药组甜瓜组织切片光学图像重合比较分析，根据空白对照组甜瓜组织质谱图像与光学图像重合比较分析结果，去除甜瓜组织自身基质干扰，得到氯吡脲在甜瓜组织中的空间分布情况。
2.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于，步骤4)中所述激光解析电离包括一级质谱和二级质谱；
所述一级质谱的条件如下：测定模式为正离子模式，质荷比扫描范围为200～300，激光能量为45Hz，激光径为25μm；
所述二级质谱的条件如下：测定模式为正离子模式，前体离子为248.05，质荷比扫描范围为50～300，激光能量为51Hz，激光径为25μm。
3.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于，步骤3)中喷涂色谱级纯甲醇的体积为1mL/导电载玻片。
4.根据权利要求1所述成像方法，其特征在于，步骤1)中所述冷冻切片前，将氯吡脲溶液处理的甜瓜组织和未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织分别置于液氮中冷冻。
5.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于，步骤1)中所述切片采用冷冻切片机进行；所述冷冻切片机的温度设置为-18℃。
6.根据权利要求1、4和5中任意一项所述的成像方法，其特征在于，步骤1)中所述切片时每次切片的厚度为35μm。
7.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于，所述氯吡脲溶液处理的甜瓜组织是将甜瓜幼果开花当日用氯吡脲溶液处理，处理后2h摘取获得。
8.根据权利要求1或7所述的成像方法，其特征在于，步骤1)中所述氯吡脲溶液的浓度为20mg/L；所述氯吡脲溶液处理的时间为3～5s。
9.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于，所述未经氯吡脲溶液处理的甜瓜组织是甜瓜幼果开花后当天进行人工授粉，授粉后2h摘取获得。
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