CN104480061A - 一种获取植物韧皮部的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获取植物韧皮部的方法。本发明公开一种获取植物韧皮部的方法，是将含有韧皮部的植物组织的石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的韧皮部。本发明通过石蜡切片和激光显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)相结合，成功的分离到番茄的纯的韧皮部组织。本发明公开的方法相比于前人的韧皮部细胞获得方法定位更加精确，细胞同质性较高，为进一步研究韧皮部的分子生物学及基因组学研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种获取植物韧皮部的方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物韧皮部筛分子中存在各类RNA分子，作为植物新的信号调控模式能够通过韧皮部进行长距离运输，这是植物界一个突破性的发现。韧皮部作为维管植物的运输组织，主要负责将光合作用的产物，由进行光合作用的源器官(source)运输到其他部位，即库(sink)部位。前人的研究已证明韧皮部存在上千种RNA，但是只有一小部分被验证其功能，对于有些RNA能长距离运输的调控机制还尚不明确，利用细胞学和分子生物学的方法研究韧皮部的物质运输及基因表达与调控是科学家近年来努力解决的科学问题。
番茄是一年生草本植物，茎中韧皮部较少。随着生长发育逐步出现次生生长，木质化程度增大，细胞和分子生物学的研究难度也增大。传统的细胞和分子生物学研究的韧皮部取材往往分析数量较多的几类细胞的综合值，难将番茄韧皮部完整而清晰分离,科学家对番茄韧皮部的研究还相当有限。如何提高取材部位的准确性，是研究番茄韧皮部分子机理的关键所在。
随着显微操作术的发展，最初应用于医学的激光显微切割技术(Laser CaptureMicrodissection,LCM)被应用于植物学领域的研究，植物细胞与动物细胞相比有很大的差异，具有细胞壁和液泡，尤其是双子叶植物有次生生长特征，存在细胞壁的次生加厚生长，更加增加了组织样品制备的难度。
激光显微切割技术能够快速准确地将目标细胞或细胞群从活体植物组织中分离出来，用于后续的研究或进一步的活体培养。因此应用该技术往往是深入研究工作的重要基础。另外，激光显微切割技术与各种细胞和分子生物学研究方法的结合，使得我们对植物的生长发育过程中细胞功能和分化研究更加准确易行。
发明内容
本发明的目的是提供一种获取植物韧皮部的方法。
本发明提供一种获取植物韧皮部的方法，是将含有韧皮部的植物组织的石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的韧皮部；
所述激光显微切割方法具体按照ArcturusXT激光捕获显微切割仪说明书进行操作；
所述ArcturusXT激光捕获显微切割仪购自Life technologies公司，产品型号为Laser Capture Microdissection Systems。
上述方法中，所述石蜡切片在所述用激光显微切割方法获取其中的韧皮部之前还包含将所述石蜡切片进行烘干、脱蜡、脱水和晾干的步骤。
上述任一所述的方法中，所述烘干的条件为在DEPC水上37℃-45℃烘干，具体为37℃烘干。
上述任一所述的方法中，所述脱蜡为二甲苯脱蜡；
所述脱蜡的方法具体为二甲苯脱蜡两次，每次10min。
上述任一所述的方法中，所述脱水为100％的乙醇脱水；
所述脱水的方法具体为100％的乙醇脱水两次，每次10min。
上述任一所述的方法中，所述石蜡切片的厚度为8-10μm。
上述任一所述的方法中，所述韧皮部为所述植物的茎的韧皮部。
上述任一所述的方法中，所述植物为番茄。
本发明通过石蜡切片和激光显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)相结合，成功的分离到番茄的纯的韧皮部组织。本发明提供的方法相比于前人的韧皮部细胞获得方法定位更加精确，细胞同质性较高，为进一步研究韧皮部的分子生物学及基因组学研究奠定基础。
附图说明
图1为材料的取样部位。
图2为固定液的配制。
图3为冰上抽真空。
图4为摇晃低温固定过夜。
图5为石蜡浸透过程。
图6为样品包埋。
图7为冷冻切片下番茄茎的横切结构。
图8为石蜡切片下番茄茎结构。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
ArcturusXT激光捕获显微切割仪购自Life technologies公司，产品型号为Laser Capture Microdissection Systems。
实施例1、石蜡切片和激光显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)相结合精确获取番茄茎的韧皮部
一、石蜡切片的制备
1、材料种植：番茄种子经浸种催芽处理，2～3天左右，当60％种子“破嘴露白”，即露出胚根时，播种于育苗盘中，育苗基质为高温消毒的草炭：蛭石(质量比1:1)。番茄育苗期间置于温室，培养温度25-28℃，16hr光照/8hr黑暗，土壤湿度保持在50-60％。每两周供应一次MS营养液。当幼苗长至2-3叶时，将幼苗移植到8×8cm营养钵育苗。
2、取生长旺盛的番茄幼苗，剪去叶，只留茎段，取距离茎尖3cm以下的健壮茎段(如图1)，用锋利的双面刀片切成长度为4-5mm的小段，得到样品，将样品立即投入固定液(冰醋酸：乙醇体积比为1:3，如图2)。
取材过程中严格控制用具是RNAase-free或是经过RNAase away清洗过的，尽力减少实验过程中存在的RNAase。取材过程要迅速，固定液事先在冰上预冷，固定液的体积是样品体积的20倍以上。
3、冰上抽真空10min×3次，缓慢平衡真空瓶内的气压，使固定液尽快深入样品内(如图3)。
4、更换一次固定液后4℃摇晃固定过夜(如图4)。
5、将步骤4得到的样品依次在由乙醇和二甲苯按体积比3:1,1:1,1:3,0:1,0:1和0:1混匀得到的各溶液中进行室温梯度脱水，每级梯度脱水1.5h，各级溶液的使用体积为60mL。
6、在步骤5最后脱水的60mL二甲苯溶液中加入石蜡液到80mL(石蜡和二甲苯的体积比为1：3)，转移到60℃恒温箱，1h后上下颠倒。30min后倒出40mL溶液，加石蜡液到60mL(石蜡和二甲苯的体积比为1：1)，打开瓶盖挥发二甲苯。4h后更换纯石蜡，4h重复更换一次，浸透过夜(如图5)。
7、更换一次新的石蜡液，浸透4h后进行样品包埋，得到包埋的样品(如图6)。将包埋的样品用锡箔纸包好避光4℃保存。
8、石蜡切片机刀架附近及其他用具经过RNAase away清洗，包埋块(包埋的样品)修切面修整成梯形，切片厚度8-10μm(Leica RM2235,Leica Microsystems,Nussloch,Germany)。
9、挑选完整条带的切片整齐排列于载玻片上的DEPC水上，37℃(37℃-45℃均可)烘片至干燥。
10、将烘干的切片置于真空干燥器中4℃保存过夜(此步可选择保存，后续试验要求尽快完成)。
11、将步骤10得到的样品载玻片拿出放置至室温，依次进行10min×2次的二甲苯脱蜡，2min×2次的100％乙醇脱水，室温晾干载玻片。
二、激光显微切割样品及样品的观察
按照ArcturusXT激光捕获显微切割仪的说明书进行操作。
主要步骤如下：
1、点击软件右侧工具栏Setup项目中的Present Stage按钮，使载物台移动到可以放置玻片的位置，将步骤一得到的载玻片和Cap(在激光切取组织后，需要用cap将切下来的组织粘走，后续切割组织再使用此cap的其他部位粘，最后cap上会得到累加的韧皮部组织)放置到载物台上。
2、在软件右下角的Load Caps和Slide的栏目中，选择所使用Cap的类型和数量，以及每个位置所放置玻片的类型。
3、选择Slide栏目里选择要观察的玻片，载物台将会移动，使载玻片移动到显微镜的观察范围内。
4、在软件下方中间的导航图栏中点击鼠标右键，在弹出的窗口中选择ReacquireOverview Image，为载玻片拍摄导航图。
5、在Imspect栏目中选择所要使用倍数的显微镜，调整亮度和焦距，使看到的画面清晰。
6、观察玻片，找到所要捕获的细胞所在的区域。
7、在软件下方中间的导航图栏中点击鼠标右键，在弹出的窗口中选择Place Cap atRegion Center，仪器将会把Cap放到所要捕获的细胞所在的区域。
8、利用Select栏目中的画图工具圈定所捕获的细胞。
9、点击Microdissect栏目中切割捕获的按钮，捕获所选的细胞。
10、点击Microdissect栏目中的Move Cap to QC Station按钮，仪器将会把Cap放置到QC的位置。
11、观察Cap上面捕获到的细胞。如果捕获成功，重新点击Setup项目中的PresentStage按钮，使载物台推出。从仪器上取下Cap，进行后续的提取纯化操作(如根据实验的目的提取韧皮部的DNA，RNA或是蛋白质)。
石蜡切片下番茄茎结构如图8所示。
图8中，A为石蜡切片下番茄茎横切结构；B为激光显微切割韧皮部后剩余的番茄茎的横切结构；C为Cap上获取的番茄茎韧皮部组织。
图8A表明，番茄茎组织结构完整，能快速的分辨出韧皮部组织。
图8B表明，没有除韧皮部之外的其他组织在获取韧皮部过程中被取走。
图8C表明，获取的韧皮部单一，没有其他组织的污染，且能估测获取细胞的数量。
对比例、冷冻切片获取番茄茎的韧皮部
一、冰冻切片机条件设置
1、将Leica CM3050S冰冻切片机的机箱内温度(CT)调节到-22℃到-24℃之间，样品头温度(OT)为-22℃到-24℃之间。
2、设置修块厚度和切片厚度：一般修块厚度为50μm或100μm。切片厚度在10-16μm之间。
3、设置刀座角度：刀座角度在0-5°。
二、冷冻切片的制备
1、样品的固定同实施例1中步骤一的1-4，将得到的茎段样品用OCT包埋剂垂直粘在样品砣上，放在Leica CM3050S冰冻切片机的机箱内冷冻，包埋剂逐渐变白变硬，将茎段固定在样品砣上。然后，再在茎段周围涂上适量的包埋剂，使茎段完全被包在包埋剂中。
2、修块：手摇冰冻切片机的手动轮进行修块，使切面平整，且露出茎段横切面。将茎段横切面周围的包埋剂用单面刀片修成梯形，且底边平行正对刀口。再修，平整切面。
3、切片：放下防卷板，手摇或者自动切片。在切片过程中，可以调整刀座的角度，防卷板与刀片之间的间隙，以获得较好的切片。最理想的切片是：切片不卷曲，不破裂，组织完整，独立成片。
4、粘片：掀起防卷板，用常温下的载玻片轻轻接触切片，由于温差，切片就自动粘附在载玻片上。
5、脱水：切好的冰冻切片黏附在载玻片上，立即放入体积百分含量为70％的乙醇水溶液(-20℃)中2min，再放入体积百分含量为95％乙醇水溶液中2min，100％乙醇2min进行梯度脱水，自然风干。
脱水后的冷冻切片下番茄茎的横切结构结果如图7所示。
图7表明，由于幼嫩番茄苗的含水量较高，冰冻切片后1-5分钟之内，细胞结构非常清晰。但之后随着冰冻切片逐渐与室温平衡，细胞组织中的水分从固态逐渐变成液态，细胞涨破，使得切片观察到的结构特征与刚制作完成的切片有很大区别，不易进行后续试验。
如果将冰冻切片机的机箱内温度设在-25℃以下时，组织材料和包埋剂完全凝固，且质地坚硬，切片时，由于温度过低，容易出现切片撕裂的现象，影响效果。有时切片中的组织和包埋剂在过低的温度条件下会发生脱离。
综上所述，冷冻切片不适用于与激光显微切割技术相结合精确获取番茄茎的韧皮部。
Claims (8)
1.一种获取植物韧皮部的方法，是将含有韧皮部的植物组织的石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的韧皮部。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述石蜡切片在所述用激光显微切割方法获取其中的韧皮部之前还包含将所述石蜡切片进行烘干、脱蜡、脱水和晾干的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述烘干的条件为在DEPC水上37℃-45℃烘干，具体为37℃烘干。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述脱蜡为二甲苯脱蜡。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述脱水为100％的乙醇脱水。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述石蜡切片的厚度为8-10μm。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述韧皮部为所述植物的茎的韧皮部。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为番茄。
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