CN110926851B - 一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用，所述的方法将含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的维管形成层。本发明通过石蜡切片和激光显微切割技术的有机结合，成功分离得到木本植物黄梁木的纯的形成层组织。本发明优化了石蜡切片流程，调试LMD参数，建立了黄梁木实生苗维管组织细胞的激光显微切割技术体系，获得了高质量的维管形成层。本发明公开的方法在木本植物同类组织中应用未见报道，该方法获得的组织器官细胞同质性较高，细胞结构完整，为进一步研究形成层的分子生物学及基因组学研究奠定基础。

Description

一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获取木本植物维管形成层的方法及其应用。

背景技术

木材的径向生长是维管形成层向内分化为次生木质部和向外分化为次生韧皮部的结果，维管形成层对于木本植物的生长至关重要，它是林木区别于其他一年生或多年生草本植物的主要组织，形成层活性导致了茎的增厚，并且伴随着生物量的增加。除此之外，维管形成层还能在植物的受伤部位形成愈伤组织从而进行自我保护，在恶劣的生长环境中休眠以避免细胞受到伤害。因此研究维管形成层基因表达特性和形成层细胞的分裂与分化的分子遗传机制，将为木本植物生物量遗传改良及抗性筛选奠定重要基础。但由于传统的方法很难将影响木材形成的关键活性组织区域形成层完整清晰地分离处理，人们对形成层的认识还相当有限。如何提高取材部位的准确性，是研究形成层区细胞分化分子机理的关键所在。

激光显微切割技术(Laser Microdissection，LMD)是一种从异质细胞群中分离目标细胞的有效技术。LMD常与冷冻切片和石蜡切片相结合，收获的细胞可以提取DNA、RNA和蛋白质，用于分析来自各种细胞类型的基因组特征、基因表达和蛋白质谱。冷冻切片由于制片流程简单，可减少RNA损失并提高质量，但冷冻切片难以稳定植物组织中的液泡细胞，以及冷冻、解冻引起的组织完整性的丧失，这使得靶细胞的鉴定变得困难(Nelson et al.,2006)。而石蜡切片能更好地保留细胞结构，与LMD结合广泛应用于草本植物细胞材料，如拟南芥胚胎表皮细胞，玉米籽粒早期胚乳细胞等(Sakai et al.,2018；Zhang et al.,2018)。基于LMD的植物组织RNA分离过程中的主要困难是由于细胞壁的存在，次生细胞壁的木质化，完全分化的细胞中存在大的液泡，以及存在大的细胞间隙(Nakazono et al.,2003；Jyske et al.,2015；)，使得LMD应用于木本植物植物细胞成为挑战，需要保持组织切片和细胞收获期间组织学完整性和稳定的细胞内容物非常困难。目前，LMD结合石蜡切片应用在木本植物的相关报道较少，主要还是木本植物的非木质化组织，例如柑橘珠心胚起始细胞，苹果芽分生组织等(贾慧慧，2016；Verma et al.,2019)。LMD结合石蜡切片应用于木本植物维管组织未见报道。

黄梁木(Neolamarckia cadamba)是热带亚热带地区广泛分布的茜草科团花属速生阔叶树种，不仅生长十分迅速而且材质致密，它也是胶合板工业、纸浆和纸张生产的最佳原材料之一。黄梁木因其快速增长而被世界林业大会于1972年称为“奇迹之树”，其快速生长依赖于维管形成层细胞高活性的发生与分裂，因此，解析黄梁木维管形成层细胞发生与分裂的分子调控机制对于促进热带亚热带阔叶树种的遗传改良与应用具有重要作用。然而，在木本植物中尤其是速生树种中如何获得高质量的维管形成层仍然是一道技术难题，对于木本植物维管形成层发生与细胞分裂的分子调控机制也是知之甚少。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种获取木本植物维管形成层的方法。

本发明的另一目的在于提供所述的获取木本植物维管形成层的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种获取木本植物维管形成层的方法，将含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的维管形成层。

所述的木本植物优选为黄粱木。

所述的木本植物优选为木本植物试管苗移栽后四月龄幼苗。

所述的木本植物组织优选为木本植物的茎。

所述的含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片的厚度优选为12～14μm。

所述的含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片的制作方法包括固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、脱蜡的步骤。

所述的固定所用的固定剂优选为由卡诺固定液与丙酮的混合溶液；所述的卡诺固定液与丙酮优选按体积比(8:2)～(6:4)进行配比。

所述的卡诺固定液优选为乙醇与冰乙酸按体积比3:1组成的混合溶液。

所述的固定的具体操作优选为：将木本植物组织置于固定液中，抽真空至木本植物组织沉于固定液底部并且不再有密集气泡冒出后，更换固定液后固定过夜。

所述的抽真空优选在冰上进行；抽真空的次数优选为2次，每次优选处理10min，每次更换新的固定液。

所述的脱水所用的脱水剂优选为正丁醇。

所述的脱水的条件优选为65℃处理30分钟；脱水的次数优选为2次。

所述的透明所用的透明剂优选为正丁醇。

所述的透明的条件优选为65℃处理30分钟。

所述的渗蜡的具体操作优选为：先采用50％石蜡进行第一次渗蜡，再采用100％石蜡进行第二次～第四次渗蜡。

所述的50％石蜡优选为由正丁醇与石蜡按体积比1:1组成。

所述的渗蜡的温度优选为65℃。

所述的第一次渗蜡的条件优选为65℃下处理1h；第二次渗蜡的条件优选为65℃下处理1h～1.5h；第三次渗蜡和/或第四次渗蜡的条件优选为65℃下处理2h～2.5h。

所述的包埋的具体操作优选为：采用100％石蜡包埋。

所述的脱蜡的脱蜡剂优选为二甲苯；脱蜡的次数优选为2次，每次10min。

所述的激光显微切割优选采用Leica AS LMD 7000激光显微切割系统；在保证能有效切割的情况下，尽量降低激光能量，以免灼烧细胞影响RNA质量。优选的，在10～20倍物镜下，所使用的激光参数体系为：power(激光能量)40～44，Aperture(激光孔径)4～8，Speed(切割速度)15～16，Head Current(发射强度)100％，Pulse Frequency(脉冲频率)1891。

当通过所述的方法获得的木本植物维管形成层后续需用于RNA的研究时，所述的各步骤操作中注意避免RNAase的污染。

所述的获取木本植物维管形成层的方法在植物生物学领域中的应用。

所述的植物生物学领域包括植物分子生物学领域、植物代谢组学领域；具体的，例如木本植物的RNA、DNA、蛋白质和细胞代谢产物等的提取分析研究。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过石蜡切片和激光显微切割技术相结合，成功的分离到黄梁木纯的维管形成层组织；通过所述的方法获得的木本植物维管形成层材料的质量可以满足后续实验的要求。本发明公开的方法在木本植物中同类组织应用未见报道，该方法获得的组织器官细胞同质性较高，细胞结构完整，为进一步研究形成层的分子生物学及基因组学研究奠定基础。

附图说明

图1是黄粱木幼苗茎段取材示意图。

图2是不同固定剂处理茎段后组织形态图；其中，丙酮为固定剂是100％丙酮固定处理的第二茎节材料；卡诺：丙酮＝8:2为固定剂是卡诺(乙醇：冰乙酸＝3:1，v/v)与丙酮的体积比为8:2混合固定处理的第二茎节材料；卡诺：丙酮＝6:4为固定剂是卡诺(乙醇：冰乙酸＝3:1，v/v)与丙酮的体积比为6:4混合固定处理的第四茎节材料；对照为刚切下的第二茎节茎段图，未经固定剂处理(未经固定剂处理的第二茎节与第四茎节的外观基本一致)。

图3是从正丁醇进行脱水和透明后的材料提取得到RNA的琼脂糖凝胶电泳胶图，其中，条带分别对应28s，18s；泳道1～3是第二茎节材料用固定剂卡诺：丙酮＝8:2固定，再用正丁醇进行脱水和透明后的提取的RNA；泳道4～6是第四茎节材料用固定剂卡诺：丙酮＝6:4固定，再用正丁醇进行脱水和透明后的提取的RNA。

图4是采用卡诺/丙酮(80/20；v/v)为固定剂，正丁醇为脱水、透明剂处理的第二茎节材料的石蜡切片显微结构图。

图5是采用卡诺/丙酮(60/40；v/v)为固定剂，正丁醇为脱水、透明剂处理的第四茎节材料的石蜡切片显微结构图。

在图4和图5中，Pi代表髓部(pith)，Pa代表薄壁细胞(parenchymn)，Xy代表木质部(xylem)，Cz代表形成层区域(cambium zone)，Ph代表韧皮部(phloem)。

图6是激光显微切割收集黄梁木第二茎节维管形成层细胞结果图；其中，A:切割前；B:切割后留下的路径；C:收集到的组织；

图7是激光显微切割收集黄梁木第四茎节维管形成层细胞结果图，其中，A:切割前；B:切割后留下的路径；C:收集到的组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。

实施例1.石蜡切片和激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木第二茎节维管形成层

一、石蜡切片的制备

1、材料准备：将生长一个月后的黄梁木无菌试管苗，移栽到土中，在温室中继续培养四个月后作为实验材料。温室培养生长条件为：光照强度1000～1500lx，昼夜时间12h/12h，培养温度(25±2)℃。

2、取生长良好的黄梁木移栽四个月幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第二茎节，每个茎节均切成2～4mm的小段，立即投入到固定液中。取材过程尽力减少实验过程中存在的RNAase，取材过程要迅速，固定液事先在冰上预冷，固定液的体积是样品体积的20倍以上。比较各种固定剂的固定效果，发现使用100％丙酮固定时，组织严重皱缩，如图2所示；使用卡诺固定液或者FAA固定液时，材料RNA降解；所述的卡诺为乙醇与冰乙酸的体积比3:1的混合溶液，FAA为甲醛：冰乙酸：70％乙醇体积比＝5:5:90。当使用乙醇稀释丙酮作固定剂时(例如，乙醇与丙酮分别按体积比5:5、6:4、8:2混合后进行固定剂实验研究)，切片髓部出现空洞，无法识别维管束各细胞形态。最后采用卡诺稀释丙酮作为固定剂，筛选出最佳固定剂为卡诺：丙酮体积比为8:2，经过该固定剂固定的茎段，细胞组织形态完整，没有出现皱缩，如图2，材料提取的RNA也不降解。采用卡诺：丙酮体积比为6:4混合固定处理的第二茎节材料也获得了类似的良好固定效果。

3、冰上抽真空(98kPa)处理10min，共2次，每次更换新的固定液，直到全部茎段沉入管底并且不再有密集气泡冒出。最后更换固定液后4℃固定过夜。

4、材料固定后，进行组织脱水处理，将材料取出，放置于100％正丁醇中，65℃处理30分钟，处理两次。

与常规石蜡切片相比，使用正丁醇脱水步骤简单且缩短了石蜡切片制作时间，避免了RNA降解。一般石蜡切片流程脱水剂为乙醇梯度脱水，将材料依次经50％、70％、85％、95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇(新开瓶)脱水各1～2h。该方法脱水步骤繁琐且耗时较长，在本发明的研究中也尝试了该方法，检测发现材料RNA已降解。

5、材料脱水后，进行组织透明处理，透明剂为100％正丁醇，65℃处理30分钟。采用正丁醇脱水和透明后，提取组织RNA，RNA质量较好，没有出现降解，进行三个重复实验，结果如图3中的泳道1～3所示。本发明所采用正丁醇既是脱水剂也是透明剂，脱水和透明的时间都较短，避免了RNA降解，透明在65℃处理，高温促进试剂穿透组织，且后续浸蜡也是65℃，与蜡有机相融，有助于石蜡浸透组织。而常规石蜡切片中透明剂一般为二甲苯，二甲苯是有毒挥发试剂，且使用二甲苯透明过程至少需要6个小时，后续的浸蜡过程需要过夜处理，步骤越繁琐，耗时越长，RNA越易降解。

6、将透明的材料进行渗蜡处理，先用透明剂正丁醇与融化的石蜡按照体积比1:1的比例(50％正丁醇：50％石蜡)，65℃处理1h；再用100％的纯蜡替换3次，处理温度及时间分别是65℃，1h～1.5h；65℃，2h～2.5h，2次。

7、包埋：将含有样品的石蜡迅速倒入用牛皮纸折叠好的包埋盒内，牛皮纸提前高压灭菌且用RNA-zap擦拭，去除RNases污染；用干净且高温的镊子将样品在包埋盒里定位，待石蜡冷却凝固后，放入4℃冰箱保存。

8、切片：将包埋好的蜡块用刀片修成规整的矩形，粘在小木块上，上机切片。切片使用到的毛刷，镊子，刀片等均经过高压灭菌和RNA-zap擦拭，去除RNases污染；石蜡切片机，烤片机等先用70％乙醇灭菌，再用RNA-zap擦拭。不同厚度的切片直接影响实验的成败，黄梁木幼苗第二茎节组织石蜡切片厚度设定为14μm，切片效果最佳。切好的蜡带放在42℃DEPC水(1％焦炭酸二乙酯)上伸展，用载玻片将蜡带从DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片机42℃烘烤，直到水分蒸发完全。

9、脱蜡：将烘干后的组织玻片经过2次二甲苯脱蜡，每次10min；脱蜡完成后，将组织玻片于通风橱中至二甲苯完全挥发，并进行形态学观察。石蜡切片显微结构如图4所示，组织结构完整，可清晰识别各细胞类型，供下一步激光显微切割用。

二、激光显微切割样品及样品的观察

主要步骤按照Leica LMD7000说明书进行操作，主要步骤如下：

1、依次打开显微镜控制箱的开关和PC机，该系统在开机后会进行自检，等自检结束后打开软件LMD V7.5.1。在放置切片和收集管前，用RNaseZap(Ambion)对切片架和收集器进行擦拭。

2、将铺有样品的玻片朝下卡入切片架后，点击“Unload High”，将切片架插入载物台上，保证玻片的位置放置准确并且切片架顺畅卡入载物台。

3、安装收集管时，将管盖至收集架的末尾处，直至完全固定不能随意移动，收集管则向后折卡到收集器的别针处，点击“Unload Down”，将收集架放入载物台下方收集分离样品，并在收集管盖中加入60μL的RNA裂解保护液。点击软件界面中“10×”物镜对切片进行对焦直至画面清晰，选择收集管，载物台上的校准孔会自动转换至相应的收集管位置。

4、在软件界面右侧的菜单栏点击“Draw+Cut”后，选择切割目标图形，移动鼠标光标圈选目标切割部分，该轨迹显示在屏幕上，可在Shape List中选择切割目标后，点击“Start Cut”后开始切割，或者点击“Erase”键删除后重新勾选切割图形。若一次不能完全切割下来可选择“Move+Cut”对未切断部分进行边画边切。可根据切割效果，调整激光显微切割激光参数，包括以下几个方面：激光能量(power)、激光孔径(aperture)、切割速度(speed)、发射强度(Head Current)、脉冲频率(Pulse Frequency)。在保证能有效切割的情况下，尽量降低激光能量，以免灼烧细胞影响RNA质量。

5、切割完成后，分离的样品会掉落到收集管盖中。为确保成功收集样品，在界面的上面点击“Collector”，视野便自动从载玻片转换到收集管盖，对焦后可观察是否有样品。

6、收集完一张玻片后，点击“Unload Down”，取出收集管，轻轻盖上管帽，防止裂解液溅出，如果不能直接进行实验，可以放入-80℃冰箱保存。点击“Unload High”将载物台上的载玻片夹弹出，取下玻片。在关闭软件之前，将“Light Intensity”调到最小，把物镜转换到5倍，将载物台降至最低。与开机相反的顺序依次关闭软件、显微镜控制器和激光器，待仪器散热后轻轻盖上保护罩。

适合的激光参数是在规定时间内提高激光显微切割效率以获得尽可能多目标细胞的关键因素。但是，激光显微切割的参数具有物种和组织特异性。黄梁木不同发育状态的维管形成层细胞具有不同属性，第二茎节组织部位形成层细胞中存在大的液泡，细胞间隙也较大，经反复试验，得到了切割处于第二茎节的维管形成层细胞的最佳参数，在20倍物镜下切割，激光显微切割的参数为：激光能量40、激光孔径4、切割速度16、发射强度100％、脉冲频率1891。第二茎节维管形成层细胞切割前、切割后以及切割收集到的形成层细胞如图6所示。

在激光显微切割实验中，根据切片厚度和收集的靶细胞不同，对应的激光参数有较大的改变。其中激光能量(Power)和激光切割孔径(Aperture)影响最大。激光能量大，孔径小，穿过的能量会减弱，不利于切割；激光能量小，孔径大，能量不够，组织不易于切割下来；能量固定，孔径越大，对组织的灼烧程度越大，且容易被周边焦炭的细胞污染。所以针对不同的材料不同的组织部位，能量和孔径之间需要反复摸索取得最佳平衡。

三、RNA质量检测

用Rneasy Micro kit(Qiagen)RNA提取试剂盒对上述第二茎节收集的形成层细胞提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit检测RNA的完整性，第二茎节的形成层RIN＝6.1，rRNA ratio[25s/18s]＝1.4，所获得的形成层细胞样品能够满足构建cDNA文库的要求。

实施例2.石蜡切片和激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木第四茎节维管形成层

一、石蜡切片的制备

1、材料准备：将生长一个月后的黄梁木无菌试管苗，移栽到土中，在温室中继续培养四个月后作为实验材料。温室培养生长条件为：光照强度1000～1500lx，昼夜时间12h/12h，培养温度(25±2)℃。

2、取生长良好的黄梁木移栽四个月幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第四茎节，每个茎节均切成2～4mm的小段，立即投入到固定液中。取材过程尽力减少实验过程中存在的RNAase，取材过程要迅速，固定液事先在冰上预冷，固定液的体积是样品体积的20倍以上。比较各种固定剂的固定效果，在使用100％丙酮固定时，同样出现了类似图2中的组织严重皱缩情况。筛选出最佳固定剂为卡诺：丙酮体积比为6:4，经过该固定剂固定的茎段，细胞组织形态完整，没有出现皱缩，RNA不降解，如图2所示。采用卡诺：丙酮体积比为8:2混合固定处理的第四茎节材料也获得了类似的良好固定效果。

3、冰上抽真空(98kPa)处理10min，共2次，每次更换新的固定液，直到全部茎段沉入管底并且不再有密集气泡冒出。最后更换固定液后4℃固定过夜。

4、材料固定后，进行组织脱水处理，将材料取出，放置于100％正丁醇中，65℃处理30分钟，处理两次。

5、材料脱水后，进行组织透明处理，透明剂为100％正丁醇，65℃处理30分钟。采用正丁醇脱水和透明后，提取组织RNA，RNA质量较好，没有出现降解，进行三个重复实验，结果如图3中的泳道4～6所示。

6、将透明的材料进行渗蜡处理，先用透明剂正丁醇与融化的石蜡按照体积比1:1的比例(50％正丁醇：50％石蜡)，65℃处理1h；再用100％的纯蜡替换3次，处理温度及时间分别是65℃，1h～1.5h；65℃，2h～2.5h，2次。

7、包埋：将含有样品的石蜡迅速倒入用牛皮纸折叠好的包埋盒内，牛皮纸提前高压灭菌且用RNA-zap擦拭，去除RNases污染；用干净且高温的镊子将样品在包埋盒里定位，待石蜡冷却凝固后，放入4℃冰箱保存。

8、切片：将包埋好的蜡块用刀片修成规整的矩形，粘在小木块上，上机切片。切片使用到的毛刷，镊子，刀片等均经过高压灭菌和RNA-zap擦拭，去除RNases污染；石蜡切片机，烤片机等先用70％乙醇灭菌，再用RNA-zap擦拭。不同厚度的切片直接影响实验的成败，黄梁木幼苗第四茎节组织石蜡切片厚度设定为10μm，切片效果最佳。切好的蜡带放在42℃DEPC水(1％焦炭酸二乙酯)上伸展，用载玻片将蜡带从DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片机42℃烘烤，直到水分蒸发完全。

9、脱蜡：将烘干后的组织玻片经过2次二甲苯脱蜡，每次10min；脱蜡完成后，将组织玻片于通风橱中至二甲苯完全挥发，并进行形态学观察。石蜡切片显微结构如图5所示，组织结构完整，可清晰识别各细胞类型，供下一步激光显微切割用。

二、激光显微切割样品及样品的观察

主要步骤按照Leica LMD7000说明书进行操作，主要步骤如下：

1、依次打开显微镜控制箱的开关和PC机，该系统在开机后会进行自检，等自检结束后打开软件LMD V7.5.1。在放置切片和收集管前，用RNaseZap(Ambion)对切片架和收集器进行擦拭。

2、将铺有样品的玻片朝下卡入切片架后，点击“Unload High”，将切片架插入载物台上，保证玻片的位置放置准确并且切片架顺畅卡入载物台。

3、安装收集管时，将管盖至收集架的末尾处，直至完全固定不能随意移动，收集管则向后折卡到收集器的别针处，点击“Unload Down”，将收集架放入载物台下方收集分离样品，并在收集管盖中加入60μL的RNA裂解保护液。点击软件界面中“10×”物镜对切片进行对焦直至画面清晰，选择收集管，载物台上的校准孔会自动转换至相应的收集管位置。

4、在软件界面右侧的菜单栏点击“Draw+Cut”后，选择切割目标图形，移动鼠标光标圈选目标切割部分，该轨迹显示在屏幕上，可在Shape List中选择切割目标后，点击“Start Cut”后开始切割，或者点击“Erase”键删除后重新勾选切割图形。若一次不能完全切割下来可选择“Move+Cut”对未切断部分进行边画边切。可根据切割效果，调整激光显微切割激光参数，包括以下几个方面：激光能量(power)、激光孔径(aperture)、切割速度(speed)、发射强度(Head Current)、脉冲频率(Pulse Frequency)。在保证能有效切割的情况下，尽量降低激光能量，以免灼烧细胞影响RNA质量。

5、切割完成后，分离的样品会掉落到收集管盖中。为确保成功收集样品，在界面的上面点击“Collector”，视野便自动从载玻片转换到收集管盖，对焦后可观察是否有样品。

6、收集完一张玻片后，点击“Unload Down”，取出收集管，轻轻盖上管帽，防止裂解液溅出，如果不能直接进行实验，可以放入-80℃冰箱保存。点击“Unload High”将载物台上的载玻片夹弹出，取下玻片。在关闭软件之前，将“Light Intensity”调到最小，把物镜转换到10倍，将载物台降至最低。与开机相反的顺序依次关闭软件、显微镜控制器和激光器，待仪器散热后轻轻盖上保护罩。

适合的激光参数是在规定时间内提高激光显微切割效率以获得尽可能多目标细胞的关键因素。但是，激光显微切割的参数具有物种和组织特异性，黄梁木不同发育状态的维管形成层细胞具有不同属性，第四茎节的形成层向次生生长发育，次生细胞壁偏木质化，含有较多的纤维，激光更难切割，经反复试验，得到了切割处于第四茎节的维管形成层细胞的最佳参数，在10倍物镜下切割，激光显微切割的参数为：激光能量44、激光孔径8、切割速度15、发射强度100％、脉冲频率1891。第四茎节维管形成层细胞切割前、切割后以及切割收集到的形成层细胞如图7所示。

三、RNA质量检测

用Rneasy Micro kit(Qiagen)RNA提取试剂盒对上述第四茎节收集的形成层细胞提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit检测RNA的完整性，第二茎节的形成层RIN＝6.6，rRNA ratio[25s/18s]＝1.6，所获得的形成层细胞样品能忙着构建cDNA文库的要求。因此，所建立的黄梁木实生苗茎段维管形成层切割体系所得到的目标产物可用于RNA-seq下游分析。

实施例3.冰冻切片和激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木维管形成层的研究

(1)冰冻切片速冻法

取生长良好的黄梁木移栽四个月幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第二茎节，每个茎节均切成2～4mm的小段，将小茎段放进1.5mL离心管后投进液氮速冻60秒，用镊子将离心管取出放进冰冻切片机箱回温20min左右，用OCT包埋剂对材料进行半包固定到样品陀上，切割厚度8～14μm。用镊子将切割下来的组织粘贴到载玻片上，并用移液枪将100％乙醇滴在载玻片上进行展片和脱水处理，将玻片放在装有二氧化硅的切片盒中进行干燥处理10min。最后进行显微观察。

显微观察冰冻切片，发现切片中间髓部出现空洞，木质部外圈细胞破碎，不能辨别细胞形态。这可能是因为鲜样细胞含水量大，速冻易形成冰晶刺破形成层细胞。因此无法利用此方法获得维管形成层细胞。

(2)材料固定和添加保护剂处理的冰冻切片改良法

取生长良好的黄梁木移栽四个月幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第二茎节，每个茎节均切成2～4mm的小段，将小茎段用卡诺(乙醇：乙酸＝3:1体积比)固定处理，冰上抽真空3次，每次20min且更换新的固定剂，最后用卡诺(乙醇：乙酸＝3:1体积比)固定剂4℃固定过夜。将固定后的材料分别用10％，15％，20％蔗糖保护剂梯度处理，冰上抽真空各半小时。取出茎段，液氮速冻60秒后放进冰冻切片机箱回温20min，用OCT包埋剂对材料进行半包固定到样品陀上，切割厚度8～14μm。用镊子将切割下来的组织粘贴到载玻片上，并用移液枪将100％乙醇滴在载玻片上进行展片和脱水处理，将玻片放在装有二氧化硅的切片盒中进行干燥处理10min。最后进行显微观察。

显微观察切片切割效果发现：材料进行前期固定和保护剂处理后，切片效果依然不佳，几乎不能成片，保护剂没有将固定剂完全替换，乙醇低温不结晶，导致组织没有被冰冻住。

综上所述，冰冻切片不适用于与激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木茎的维管形成层。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种获取木本植物维管形成层的方法，其特征在于：

将含有维管形成层的木本植物组织石蜡切片用激光显微切割方法获取其中的维管形成层；

所述的含有维管形成层的木本植物组织是黄梁木种子试管苗移栽后四月龄幼苗的茎节；

所述的石蜡切片，其制作包含将材料固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、脱蜡的步骤；

所述的固定所用的固定剂由卡诺固定液与丙酮按体积比(8∶2)～(6∶4)组成；

所述的脱水所用的脱水剂为正丁醇；

所述的透明所用的透明剂为正丁醇；

所述的渗蜡的具体操作为：先采用50％石蜡进行第一次渗蜡，再采用100％石蜡进行第二次～第四次渗蜡；

所述的脱蜡的脱蜡剂为二甲苯，脱蜡的次数为2次；

所述的包埋采用100％石蜡包埋2次

所述的切片，其厚度为12～14μm；

所述的激光显微切割采用Leica AS LMD 7000激光显微切割系统，在10～20倍物镜下，所使用的激光参数体系为：激光能量40～44，激光孔径4～8，切割速度15～16，发射强度100％，脉冲频率1891；

使用石蜡切片结合激光显微切割方法获取的维管形成层组织细胞结构完整，含有完整的RNA；

所述的使用石蜡切片结合激光显微切割方法获取的维管形成层可用于构建cDNA文库。

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