CN107655731A - 针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，包括取材与固定、清洗和染色、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、展片和贴片、脱蜡与封片等步骤。采用本发明提供的方法，能有效处理因香石竹外植体叶芽和花芽材料过大，切片不完整、不连续、存在空洞的问题。可以良好的固定组织发育的各个时期，能够观察到叶芽和花芽发育的整个过程，且操作简单，具有很好的开发应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物石蜡切片的方法，尤其是针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法。
背景技术
石蜡切片是用于观察细胞组织的形态结构的主要方法，而且也已相当广泛地用于许多学科领域的研究中。石蜡切片制作程序及环节繁多，周期长，每个环节都会影响切片质量，常见的问题如材料破碎、切片不完整、不连续、存在空洞。
材料破碎的原因追溯到石蜡制作过程的许多步骤，包括脱水、透明、透蜡、包埋、切片、脱蜡及封片等等，只要其中一个步骤出错，都可能导致材料破碎。其中脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等步骤涉及试剂浓度、成分比例、浸泡时间等因素，切片和染色等过程涉及实际的技术问题。
香石竹叶芽和花芽由于材料特别大，芽的长度可达2～3厘米左右，制作过程就会带来相当大的困难。首先，脱水过程较不容易，由于材料过大而脱水不彻底，会形成空洞蜡片，其次，透明过程会出现问题，二甲苯进入组织比较困难，但又不能以单纯延长二甲苯浸泡时间来达到目的，因为浸泡时间过长，会给材料带来不利的影响，会造成材料脆性增大，组织易碎等。所以较大的芽石蜡切片制作常会出现材料破碎，导致切片制作失败。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法。
本发明通过下列技术方案实现：一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，包括以下步骤：
（1）取材与固定：
取不同发育时期的香石竹叶芽或花芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液（福尔马林:冰醋酸:70％乙醇＝1:1:18）中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；
（2）清洗和染色：
将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次2～5min；再置于2mL离心管内，以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次2～5min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；
（3）脱水：
以浓度为70v/v%的乙醇脱水12～24h，弃乙醇，将材料放入2mL离心管内以2000～3000转/分钟进行离心分离1～2min，换新的2mL离心管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，将材料放入10mL离心管内；
（4）透明：
加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯后浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；
（5）浸蜡与包埋：
用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的适量蜡屑投入盛有材料的青霉素小瓶中，于35℃下置于恒温箱过夜，再加入蜡屑至饱和，于42℃下置于恒温箱过夜，然后全部换纯蜡，于60℃下置于恒温箱12小时，再次全部换纯蜡，于60℃置于恒温箱12小时；
包埋前1小时打开包埋机预热，将熔好的蜡倒入预先折好的小纸盒中用镊子或解剖针将材料夹到纸盒中，并摆好位置，包埋后将纸盒移入冷台上，使石蜡逐渐凝固；
（6）切片：
将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8～10μm，得到蜡带；
（7）展片和贴片：
在清洁的载玻片上滴2～3滴蒸馏水，用小镊子夹取切好的蜡带，放在水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干1～2d；
（8）脱蜡与封片：
将材料依次放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡45～60min，再进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。
所述无水乙醇和二甲苯均为市购分析纯。
所得切片在光学显微镜下观察并记录，在显微摄影装置下显微拍照。
与传统石蜡制片方法相比，本发明具有以下突出优点：
（1）脱水程序采用乙醇脱水，并辅以离心脱水，使较大的芽脱水更彻底同时又不损害芽的结构和形态。
（2）透明程序的确定，由于材料比较大，二甲苯透入比较困难，采取二甲苯和乙醇的不同比例（体积比）溶液作过渡，再纯二甲苯透明，同时辅以离心方法，使残留的乙醇更容易渗出组织细胞，同时又保证芽的结构和细胞形态完整。
（3）延长浸蜡时间，浸蜡时间延长至3d，目的是使石蜡充分进入组织，保证切片完整、连续、切出的组织不存在空洞。
（4）贴片：不使用粘片剂，直接将蜡片放到滴有清水的水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干。
采用本发明提供的方法，能有效处理因香石竹外植体叶芽和花芽材料过大，切片不完整、不连续、存在空洞的问题。可以良好的固定组织发育的各个时期，能够观察到叶芽和花芽发育的整个过程，且操作简单，具有很好的开发应用价值。
附图说明
图1为实施例1叶芽的石蜡切片；
图2为实施例2花芽的石蜡切片；
图3为采用传统方法制备叶芽的石蜡切片；
图4为采用传统方法制备花芽的石蜡切片。
具体实施方式
以下详细介绍本发明采用的方法。
实施例1
（1）取材与固定：
取不同发育时期的香石竹叶芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液（福尔马林:冰醋酸:70％乙醇＝1:1:18）中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；
（2）清洗和染色：
将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次2min；再置于2mL离心管内，以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次2min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；
（3）脱水：
以浓度为70v/v%的乙醇脱水12h，弃乙醇，将材料放入2mL离心管内以2000转/分钟进行离心分离1min，换新的2mL离心管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水1.5h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1min，换新的2mL离心管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水1.5h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1min，将材料放入10mL离心管内；
（4）透明：
加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯（分析纯）浸泡50min，以3000转/分钟离心分离1min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯（分析纯）后浸泡50min，以3000转/分钟离心分离1min，除去液体，再加入2mL二甲苯（分析纯）浸泡50min，以3000转/分钟离心1min，除去液体，再加入2mL二甲苯（分析纯）浸泡50min，以3000转/分钟离心分离1min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；
（5）浸蜡与包埋：
用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的适量蜡屑投入盛有材料的青霉素小瓶中，于35℃下置于恒温箱过夜，再加入蜡屑至饱和，于42℃下置于恒温箱过夜，然后全部换纯蜡，于60℃下置于恒温箱12小时，再次全部换纯蜡，于60℃置于恒温箱12小时；
包埋前1小时打开包埋机预热，将熔好的蜡倒入预先折好的小纸盒中用镊子或解剖针将材料夹到纸盒中，并摆好位置，包埋后将纸盒移入冷台上，使石蜡逐渐凝固；
（6）切片：
将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8～10μm，得到蜡带；
（7）展片和贴片：
在清洁的载玻片上滴2滴蒸馏水，用小镊子夹取切好的蜡带，放在水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干1d；
（8）脱蜡与封片：
将材料依次放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯（分析纯）浸泡15min→二甲苯浸泡15min→二甲苯浸泡45min，再进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。
所得切片在光学显微镜下观察并记录，在显微摄影装置下显微拍照，如图1。
实施例2
（1）取材与固定：
取不同发育时期的香石竹花芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液（福尔马林:冰醋酸:70％乙醇＝1:1:18）中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；
（2）清洗和染色：
将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次5min；再置于2mL离心管内，以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次5min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；
（3）脱水：
以浓度为70v/v%的乙醇脱水24h，弃乙醇，将材料放入2mL离心管内以3000转/分钟进行离心分离2min，换新的2mL离心管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离2min，换新的2mL离心管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离2min，将材料放入10mL离心管内；
（4）透明：
加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯（分析纯）浸泡70min，以3000转/分钟离心分离2min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯（分析纯）后浸泡70min，以3000转/分钟离心分离2min，除去液体，再加入2mL二甲苯（分析纯）浸泡70min，以3000转/分钟离心2min，除去液体，再加入2mL二甲苯（分析纯）浸泡70min，以3000转/分钟离心分离2min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；
（5）浸蜡与包埋：
用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的适量蜡屑投入盛有材料的青霉素小瓶中，于35℃下置于恒温箱过夜，再加入蜡屑至饱和，于42℃下置于恒温箱过夜，然后全部换纯蜡，于60℃下置于恒温箱12小时，再次全部换纯蜡，于60℃置于恒温箱12小时；
包埋前1小时打开包埋机预热，将熔好的蜡倒入预先折好的小纸盒中用镊子或解剖针将材料夹到纸盒中，并摆好位置，包埋后将纸盒移入冷台上，使石蜡逐渐凝固；
（6）切片：
将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8～10μm，得到蜡带；
（7）展片和贴片：
在清洁的载玻片上滴3滴蒸馏水，用小镊子夹取切好的蜡带，放在水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干2d；
（8）脱蜡与封片：
将材料依次放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯（分析纯）浸泡30min→二甲苯浸泡30min→二甲苯浸泡60min，再进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。
所得切片在光学显微镜下观察并记录，在显微摄影装置下显微拍照，如图2。
对比图3和图4可知，采用本发明制备的香石竹叶芽和花芽石蜡切片，切片连续，完整，无裂缝，无空洞，显微下观察的材料完整，结构清晰可见。而采用传统方法制备的香石竹叶芽和花芽石蜡切片切片不连续，不完整，有空洞，显微下观察的材料破裂，不完整，结构不清晰。
Claims (2)
1.一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取材与固定：
取不同发育时期的香石竹叶芽或花芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；
（2）清洗和染色：
将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次2～5min；再以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次2～5min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；
（3）脱水：
以浓度为70v/v%的乙醇脱水12～24h，弃乙醇，将材料以2000～3000转/分钟进行离心分离1～2min，换管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，将材料放入10mL离心管内；
（4）透明：
加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯后浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；
（5）浸蜡与包埋：
常温下将削好的适量蜡屑投入盛有材料的青霉素小瓶中，于35℃下恒温过夜，再加入蜡屑至饱和，于42℃下恒温过夜，然后全部换纯蜡，于60℃下恒温12小时，再次全部换纯蜡，于60℃恒温12小时；包埋前1小时打开包埋机预热，再将熔好的蜡倒入预先折好的小纸盒中用镊子或解剖针将材料夹到纸盒中，并摆好位置，包埋后将纸盒移入冷台上，使石蜡逐渐凝固；
（6）切片：
将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8～10μm，得到蜡带；
（7）展片和贴片：
在清洁的载玻片上滴2～3滴蒸馏水，用小镊子夹取切好的蜡带，放在水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干1～2d；
（8）脱蜡与封片：
将材料依次放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡45～60min，再进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。
2.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其特征在于：所述无水乙醇和二甲苯均为市购分析纯。
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