CN112903677A - 一种快速检测葡萄花芽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测葡萄花芽的方法，包括以下步骤：S1采集葡萄木质化后到冬季修剪前的生长健壮且无病虫害的枝条；S2葡萄花芽枝条的保湿；S3将待测葡萄枝条用剪刀按节位剪成4‑5cm长的茎段，将剪好的带有芽体的茎段用湿润的纱布包裹待测；S4从茎段上取下芽体，取芽体时刀切开方向与芽体垂直并使芽体底部光滑平整；将取下的芽体用刀横切，横切面与芽体底部平面平行；横切后放到体式显微镜下观测横切面，观测倍数为2‑4倍；以横切面上嫩绿色中心点为生长点，若生长点周围鳞片分布层数不均且观察到明显不规则径向突起即为花序原基，判断为花芽；反之，判断为叶芽。本发明具有“判断准确可靠、快速高效、安全无毒、成本低操作简单、适于大批量进行快速检测”的特点。

Description

一种快速检测葡萄花芽的方法

技术领域

本发明涉及果树花芽检测方法，尤其涉及一种快速检测葡萄花芽的方法。

背景技术

葡萄是我国重要的果树之一，其花芽品质和数量直接关系到葡萄的第二年产量。葡萄花芽分化整体分为两个阶段，第1阶段是花序分化阶段，在新梢生长当年完成，这是决定葡萄有无花芽的关键阶段；第二节阶段是花器官分化阶段，于第二年春天萌芽前后至开花前完成，分化阶段集中且短，这是决定花芽质量的关键阶段。在葡萄生产上，如何快速准确判断花芽对指导葡萄周年生产和预测葡萄产量具有重要作用。很多果农由于冬季修剪时对葡萄花芽判断不当，导致将含花芽的结果母枝大量去除，造成第二年产量大幅度降低。除此之外，通过判定葡萄树体上花芽的比例，可以采取相应的管理措施(施肥、浇水等)来平衡树体营养生长和生殖生长，确保葡萄的高产和稳产。

关于花芽的判断，一般采用外部形态观测法(肉眼观测)，花芽芽体肥大饱满，顶端圆钝，鳞片多；叶芽则芽体较小，顶端细长，鳞片数少。葡萄的芽为一个芽眼，一般包含2-4个单芽。由于芽眼包含单芽数量不一样，导致外部形态大小不一，用外部形态观测法时，虽然简便快捷，但对于葡萄花芽鉴定存在较大误差，造成结果不准确。此外，石蜡切片法能准确判定葡萄花芽，但该方法操作繁琐，需要经过固定、浸蜡、包埋、修块、染色和脱色过程，耗时较长，一个流程下来约15-20天，对试验操作人员技术要求较高，操作不熟练，不易得到切片；此外所用试剂多，有致癌物质(甲醛)和有毒物质(二甲苯)，对环境造成污染且不利于实验人员的身体健康。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种快速检测葡萄花芽的方法，该方法简便易行、判断结果准确，安全无污染，成本较低，可以快速准确判定花芽。该方法可用于判定葡萄树体花芽的比例。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

本发明一种快速检测葡萄花芽的方法，包括以下步骤：

S1采集葡萄枝条：采集葡萄木质化后到冬季修剪前的生长健壮且无病虫害的枝条；

S2葡萄花芽枝条的保湿；

S3葡萄花序采集：将待测葡萄枝条用剪刀按节位剪成4-5cm长的茎段，在芽的上方2-3cm处平剪，在芽下方留2-3cm平剪，将剪好的带有芽体的茎段用湿润的纱布包裹待测；

S4体式显微镜下观察：用刀从茎段上取下芽体，取芽体时刀切开的方向与芽体垂直并使芽体底部光滑平整；将取下的芽体用刀横切，横切面与芽体底部平面平行；横切后立即放到体式显微镜下观测横切面，观测倍数为2-4倍；以横切面上嫩绿色中心点为生长点，若生长点周围鳞片分布层数不均且观察到明显不规则径向突起即为花序原基，判断为花芽；反之，判断为叶芽。

上述判断方法解释为：以横切面上嫩绿色中心点(生长点)为参照，生长点周围鳞片的分布层数不均匀且若在其周围观察到明显不规则径向向外的突起，向外的突起部分的径向方向的鳞片层数较少，则该突起即为花序原基，而此芽体被判断为花芽；反之，生长点周围无明显不规则状径向突起，且由多层嫩绿色鳞片均匀包围，则此芽判断为叶芽。

根据本发明的较佳实施例，S1中，采集葡萄落叶后冬季修剪前的枝条，修剪为长度70-90cm，将枝条打捆，每捆50-70根。

根据本发明的较佳实施例，S1中，采集在9-10月份进行。采集时间过早，比如4月份，葡萄花芽的花序分化阶段未完成，对于处于生理分化期的花芽易造成错误判断。而当9-10月份采集时，葡萄树体生理活动降低，花芽的花序分化阶段基本完成；芽体鳞片绒毛为褐色，生长中心和鳞片为嫩绿色，色差明显，易于判断。

根据本发明的较佳实施例，S2中，用湿润纱布包裹枝条，放于室内冷凉处，避免阳光照射，保持在18～20℃下保存1-3天(放置过程中及时用补充水分保持纱布湿润状态)；或者用湿纱布包裹枝条保存在0～4℃的冰箱中，保存4-7天；或者将枝条置于温度为-5℃～5℃、湿度为5％-7％的沙子中储藏，保持一定量通风，保存7天以上。

根据本发明的较佳实施例，S2中，将枝条置于温度为-5℃～5℃、湿度为5％-7％的沙子中储藏，该沙子中掺入10％-15％的锯末以增加透气性，保持一定量通风，保存7天以上；在检测前，先用600-750倍的甲基托布津溶液浇灌后，晾晒，待完全干后，备用。

其中，步骤S1修剪下来的枝条应及时保湿(执行步骤S2)，防止采集枝条失水，花芽死亡。

根据本发明的较佳实施例，S4中，用镊子去除外层一些包裹芽眼的开裂鳞片，有利于进一步观察。

根据本发明的较佳实施例，S4中，从芽体顶部起算，横切位置在整个芽体的40％-60％的位置。横切位置是检测的关键步骤。因不同葡萄品种和节位有一定差异，一般来说，在整个芽体40％-60％的位置横切即可满足要求。

具体而言，当芽体本身比较饱满时，横位位置相对靠近顶部，在整个芽体的40％-50％的位置；当芽体比较干瘪时，横切位置相对靠近底部，在整个芽体的50％-60％的位置。

根据本发明的较佳实施例，S4中，横切时要一次快速切过。由于葡萄芽体内存在大量的绒毛，切忌反复回刀而导致横切面不平，导致绒毛将覆盖观测位置。

S4中，在判断花芽/叶芽时，采用以下特点之一进行辅助判断：

生长点一般位于芽体横切面的中心位置，颜色一般为浅嫩绿色；

生长点周围嫩绿色鳞片层数因不同葡萄品种而异；

花序原基的大小一般大于中心生长点大小；

花序原基中心部位的颜色为绿色，花序原基边缘部位的颜色为浅白绿色。

根据本发明的较佳实施例，S4中，花序原基的位置，可在横切面上浅嫩绿色中心点径向周围的各个方向观察到，一个单芽可以包含几个花序生长点；同时由于一个芽眼有可能包含几个单芽，因此一个芽眼可能同时存在几个花芽。

根据本发明的较佳实施例，S4中，在判断花芽/叶芽时，使用已有软件或仪器设备对体式显微镜图片上生长点和周围部分的颜色进行定量化，并将定量化的数值与花芽判断结果或叶芽判断结果形成关联，通过计算机程序的自我学习能力，实现对芽体的体式显微镜图片进行自动判断。

(三)有益效果

本发明检测方法与现有技术相比，具有“判断准确可靠、快速高效、安全无毒、成本低操作简单、适于大批量的对花芽进行快速检测和判定，快速获取某批次葡萄树体花芽的比例”的特点。具体分析如下：

(1)本发明的方法简便易行，可以快速准确的对葡萄花芽进行判断。目前葡萄生产上，关于花芽的快速判定主要依赖外观形态法，但这种判断多依赖人为经验，由于一个葡萄芽眼可有多个单芽，导致仅通过外观大小和形态的判断，其结果不准确可靠性差，与实际存在较大误差。石蜡切片法可以准确判定花芽，但程序十分繁琐，需要专业的试验人员进行从固定到染色等多个程序的操作，对一个芽体的鉴定至少需要15-20天，此外芽体内部存在大量绒毛，使得石蜡切片成功率大大降低，因此石蜡切片法不适宜大批量的对花芽进行快速检测和判定，不利于快速获取某一批次葡萄树体花芽的比例。而本发明的方法从芽体取下到鉴定完成仅需3-5min,十分高效且准确率很高。

(2)本发明的方法十分安全，对环境无污染。实验室中常用石蜡切片法对葡萄花芽进行判定，该过程中涉及到试验药品甲醛和二甲苯等毒性试剂，不仅污染环境，同时不利于实验测试人员的身体健康。本发明的方法中未使用毒性药剂，十分安全。

(3)本发明成本较低。石蜡切片整个实验乙醇、石蜡、二甲苯、树胶和甲醛等试剂，并配合通风橱、恒温箱、切片机、烤片机和显微镜等仪器，检测成本较高；而本发明的方法无需多种试剂和仪器，成本较低。

附图说明

图1为本发明中用刀片从茎段上取下芽体和横切芽体的示意图。

图2为四种芽体的横切片在体式显微镜下观察到的图片。

图3为本发明方法的检测结果-石蜡切片法检测结果的线性关系。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

试验材料由河北省农林科学院昌黎果树研究所葡萄栽培基地提供。选用田间栽培的夏黑、宝光、蜜光三个葡萄品种，对枝条4-5、5-6以及10-11节位花芽比例进行统计。按照如下“花芽快速检测方法”(又称解剖观察法)和石蜡切片法进行对比试验。两种方法均为3次重复，每次重复包含10根枝条(20个芽)。具体地，花芽检测方法如下：

(1)于10月初，随机采集生长健壮且无病虫害的枝条180根(冬季修剪前10天的枝条)，其中包括60根夏黑枝条(分成2组)、60根宝光枝条(分成2组)、60根蜜光枝条(分成2组)，一组用解剖观察法(实验组)，另一组用石蜡切片法(对照组)。

(2)将枝条置于温度为-2℃～0℃、湿度为5％的沙子中储藏，该沙子中掺入15％的锯末以增加透气性，保持一定量通风，保存7天以上；在检测前，先用600倍的甲基托布津溶液浇灌后，晾晒，待完全干后，备用。

(3)将待测葡萄枝条用剪刀按节位剪成4-5cm长的茎段，在芽的上方2.5cm处平剪，在芽下方留2.5cm平剪，将剪好的带有芽体的茎段用湿润的纱布包裹待测。

(4)用刀从茎段上取下芽体，取芽体时操作如图1所示：刀切开的方向与芽体垂直并使芽体底部光滑平整；将取下的芽体用刀横切，横切面与芽体底部平面平行，横切位置在整个芽体的50％的位置。横切时要一次快速切过。

横切后，正式在体式显微镜下观测之前，用镊子去除外层一些包裹芽眼的开裂鳞片，然后放到体式显微镜下观测横切面，观测倍数为4倍。

判断方法解释为：以横切面上嫩绿色中心点(生长点)为参照，生长点周围鳞片的分布层数不均匀且若在其周围观察到明显不规则径向向外的突起，向外的突起部分的径向方向的鳞片层数较少，则该突起即为花序原基，而此芽体被判断为花芽；反之，生长点周围无明显不规则状径向突起，且由多层嫩绿色鳞片均匀包围，则此芽判断为叶芽。

如图2所示，图中箭头A为生长点，箭头B为花序原基。a图中有1个花序原基；b图中有2个花序原基；c图中未见明显花序原基。其中，a和b芽体可判断为花芽，而c判断为叶芽。

检测结果如下：

表1两种花芽判定方法比较试验

用石蜡切片法(对照组)和解剖观察法同时对不同葡萄品种不同节位的花芽比例进行了测定。从表1以看出，葡萄的成花能力与品种和节位相关，不同品种间成花能力有差异；节位越高，成花能力相对越弱。

从比较结果来看，不论对于测定成花比例高的组合还是测定成花能力低的组合，用石蜡切片法和解剖观察法测定结果无显著性差异，相对误差在5％以内，说明解剖观察法与石蜡切片法有较好的一致性；本发明的解剖观察法判定花芽具有可靠性。此外，还对两种方法测定结果进行相关性分析(如图3所示)，结果表明：解剖观察法花芽比例(％)与石蜡切片法花芽比例(％)呈正相关关系，且R²达到0.9955，说明两种方法存在极强的线性关系，进而说明解剖观察法可以对花芽进行准确的判断。

在上述检测过程中，对体式显微镜进行精密度检验。结果如下所示：

表2解剖观察法测定结果的精密度

处理	标准差	变异系数(％)
			组合1(蜜光4-5节)	2.89	3.09
组合2(宝光4-5节)	2.81	3.02
			组合3(夏黑4-5节)	2.89	3.69
组合4(蜜光6-7节)	3.43	4.82
			组合5(宝光6-7节)	5.94	8.56
组合6(夏黑6-7节)	2.89	4.33
			组合7(蜜光10-11节)	0.67	2.63
组合8(宝光10-11节)	2.89	5.77
			组合9(夏黑10-11节)	2.55	13.89
均值	3.00	5.53

标准差和变异系数可以反映数据的离散程度，进而可以说明结果的精密度。标准差和变异系数越小，精密度越高。在进行数据统计分析时，如果变异系数大于15％，则要考虑该数据可能不正常，应该剔除。从表2可以看出，组合的标准差均值为3.00，均变异系数为5.53％，解剖观察法测定结果具有比较好的重复性和比较高的稳定性。

采用本发明的方法和传统的石蜡切片法，单人以测定100份样品所耗费时间和成本进行比较如下：

组别	耗时	材料成本
			本发明	1-2天	100-150元
石蜡切片法	40天-50天	1000-1200元

由上表可以看出，本发明的检测葡萄花芽的方法，在对大批量芽体进行检测时，具有多快好省的优点，与传统石蜡切片法相比优势明显。本发明尤其适宜大批量的对花芽进行快速检测和判定，能快速获取某一批次葡萄树体花芽的比例。

实施例2

按照实施例1相同的方法获得不同芽体在体式显微镜下的原始图片，但在判断花芽/叶芽时，使用已有软件(如PS软件或java开发的ImageJ)或仪器设备(色差仪)对体式显微镜图片上生长点和周围部分的颜色进行数值转化(定量化)，并将定量化的数值与花芽判断结果或叶芽判断结果形成关联，对计算机程序进行训练，通过计算机程序的自我学习能力，使用计算机程度直接读取体式显微镜图片，并实现对芽体的体式显微镜图片进行自动判断。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种快速检测葡萄花芽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1采集葡萄枝条：采集葡萄木质化后到冬季修剪前的生长健壮且无病虫害的枝条；

S2葡萄花芽枝条的保湿；

S3葡萄花序采集：将待测葡萄枝条用剪刀按节位剪成4-5cm长的茎段，将剪好的带有芽体的茎段用湿润的纱布包裹待测；

S4体式显微镜下观察：用刀从茎段上取下芽体，取芽体时刀切开的方向与芽体垂直并使芽体底部光滑平整；将取下的芽体用刀横切，横切面与芽体底部平面平行；横切后立即放到体式显微镜下观测横切面，观测倍数为2-4倍；以横切面上嫩绿色中心点为生长点，若生长点周围鳞片分布层数不均且观察到明显不规则径向突起即为花序原基，判断为花芽；反之，判断为叶芽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，采集葡萄落叶后冬季修剪前的枝条，修剪为长度70-90cm，将枝条打捆，每捆50-70根。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1中，采集在9-10月份进行。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2中，用湿润纱布包裹枝条，放于室内冷凉处，避免阳光照射，保持在18～20℃下保存1-3天；或者用湿纱布包裹枝条保存在0～4℃的冰箱中，保存4-7天；或者将枝条置于温度为-5℃～5℃、湿度为5％-7％的沙子中储藏，保持一定量通风，保存7天以上。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中，将枝条置于温度为-5℃～5℃、湿度为5％-7％的沙子中储藏，该沙子中掺入10％-15％的锯末以增加透气性，保持一定量通风，保存7天以上；在检测前，先用600-750倍的甲基托布津溶液浇灌后，晾晒，待完全干后，备用。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中，用镊子去除外层一些包裹芽眼的开裂鳞片，有利于进一步观察。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中，从芽体顶部起算，横切位置在整个芽体的40％-60％的位置。

8.根据权利要求1所述的方法，S4中，横切时要一次快速切过。

9.根据权利要求1所述的方法，S4中，在判断花芽/叶芽时，采用以下特点之一进行辅助判断：生长点位于芽体横切面的中心位置，颜色为浅嫩绿色；花序原基中心部位的颜色为绿色，花序原基边缘部位的颜色为浅白绿色；生长点周围嫩绿色鳞片层数因不同葡萄品种而异。

10.根据权利要求1所述的方法，S4中，在判断花芽/叶芽时，使用已有软件或仪器设备对体式显微镜图片上生长点和周围部分的颜色进行定量化，并将定量化的数值花芽判断结果或叶芽判断结果相关联，通过计算机程序的自我学习能力，实现对芽体的体式显微镜图片进行自动判断。

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