CN110954384A - 一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,所述方法步骤包括:一、取材及固定;二、软化;三、脱水、透明及浸蜡;四、渗蜡与包埋;五、切片、粘片及展片;六、脱蜡、番红染色及复水;七、固绿染色及封片,所述步骤二软化包括:将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂HF的离心管中,茎段软化为时间为200‑280 h,针叶软化时间为90‑140 h。采用本发明的技术方案,比传统石蜡切片更高效,制作的切片组织结构清晰完整、细胞界限清楚,易于观察,取得了很好的使用效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种马尾松,尤其涉及一种马尾松脂道石蜡切片的制备方法,属于石蜡切片制备方法技术领域。
背景技术
马尾松(Pinus massoniana Lamb)属于松科(Pinaceae)、松属(Pinus),裸子植物,常绿乔木广泛分布于湖南、贵州及广西等17 个省、自治区、直辖市,是针叶树种中利用程度及经济效益都非常高的优势树种,更是主要的采脂树种。松属树种分泌的化学防御物质-松脂是由萜类物质组成的混合物,呈透明、无色粘液状,储藏在树脂道中,主要含松节油和松香,广泛应用于香料、医药、机械、造纸、油墨等众多行业,是我国重要的工业原料及可再生环保资源。树脂道与松脂产量紧密相关,由于市场对松脂资源的需求日益增长,为了提高松脂的产量,从解剖结构上阐明马尾松高产脂树脂道结构特征,具有重要意义。
石蜡切片是植物组织结构学研究中的重要技术手段,其传统制作步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、渗蜡、包埋、切片、粘片、展片、脱蜡、番红染色、复水、固绿染色、封片等一系列操作。整个过程步骤多而复杂,很难制作出完整清晰的马尾松树脂道组织结构的切片,目前,尚未有使用软化剂HF来克服现有马尾松树脂道切片技术的不足。马尾松茎段与针叶材质较硬,细胞壁厚,需观察的树脂道结构也是由1-2层厚壁细胞围绕而成,因此,亟需对传统的石蜡切片方法进行改进,建立一种适合于马尾松坚硬树脂道显微结构观察的石蜡切片方法,从解剖结构上阐明马尾松高产脂的形成机制,为优异种质的早期选择和定向培育提供理论参考。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提供一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,本发明克服现有技术的不足,针对马尾松茎段与针叶材质硬、组织细胞壁厚,树脂道结构均由厚壁细胞围绕,切片不完整、不清晰等问题,它是一种易于观察并适合马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,解决了传统石蜡切片在硬度较高的材料中,切片易破、易碎等问题。
本发明的技术方案为:一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,所述方法步骤包括:一、取材及固定;二、软化;三、脱水、透明及浸蜡;四、渗蜡与包埋;五、切片、粘片及展片;六、脱蜡、番红染色及复水;七、固绿染色及封片,所述步骤二软化包括:将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂HF的离心管中,茎段软化时间为200-280 h,针叶软化时间为90-140 h。
所述步骤一为:选取长势一致,生长健壮的马尾松无性系枝条,将每条枝条截取为2 cm茎段,并将采集的针叶束剪去顶部 1/3 和基部 1/3,留取针叶中部 1/3,用蒸馏水洗净后放入配好的 FAA 固定液中,进行抽真空处理,使固定液完全浸入样品中,固定48 h以上,并在4℃下保存。
所述步骤三为:将步骤二中软化后的马尾松针叶与茎段,先用70%乙醇冲洗2-3次后,放入70%乙醇溶液中脱水3次,每次处理2 h,样品可在第三次脱水的70%乙醇溶液中长久放置保存;次日,将取出样品依次放入85%乙醇、95%乙醇继续进行每梯度各2 h脱水,再放入100%乙醇溶液进行2次各50 min脱水;脱水结束后,将样品放入体积比为1:1,且已加入0.5g番红的 100%乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡2 h;再将样品放入纯二甲苯浸泡2 h,期间每小时换一次纯二甲苯;最后将浸泡在纯二甲苯中的样品取出,放入体积比为1:1的纯二甲苯溶液和石蜡屑中,并再放置到温度40℃的恒温箱中过夜。
所述步骤四为:将步骤三中的样品放置在60℃恒温箱中,并分4次换样品中的纯石蜡溶液,第一次换的时间间隔为4 h,第二次、第三次、第四次纯石蜡溶液间隔时间为2 h,在最后一次换石蜡溶液的样品中间隔两小时后,将样品从石蜡溶液中取出并进行包埋。
所述步骤五为:将步骤四所得的蜡块修整为正梯形后,放置在切片机上进行切片,切片厚度为8 μm,将切好的蜡带轻放到涂有粘贴液的载玻片上,然后将载玻片放置40℃烘片机上烘40 min后,最后将含有蜡带的载玻片放入40℃恒温箱直到蜡带展开。
所述步骤六为:将步骤五所得的烘干切片放入二甲苯溶液30-50 min,取出后再放入新的二甲苯溶液30 min脱蜡,之后将切片依次放入体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、85%乙醇溶液、70%乙醇溶液、50%乙醇溶液中,间隔时间均为3 min,最后将切片放入1%番红溶液中染色,染色时间大于12h。
所述步骤七为:将步骤六中染色后的切片,依次放入50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液、95%乙醇溶液、1%固绿溶液、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、二甲苯溶液、二甲苯溶液中,切片浸泡在50%乙醇溶液、1%固绿溶液中时间均为10-20 s,其他溶液的间隔时间均为2 min,最后将浸泡在二甲苯溶液中的切片取出,并在载玻片上滴1滴中性树胶,由同一侧轻放盖玻片,将封好的片放置常温下晾干,即为永久切片。
所述步骤一中的FAA 固定液为体积比为5:5:90的甲醛、乙酸和70%乙醇的混合液。
所述步骤五中的粘贴液包括甲液与乙液,甲液组分为:1.5 g明胶、100 ml蒸馏水、15 ml甘油和2 g苯酚;乙液组分为:4 ml甲醛和100 ml蒸馏水,使用时,分别先滴1滴甲液再滴1滴乙液于载玻片上,并用牙签将载玻片上的混合液均匀展开,以能保证蜡带粘贴的牢固。
本发明的有益效果是:与现有技术相比,采用本发明的技术方案,比传统石蜡切片更高效,制作的切片组织结构清晰完整、细胞界限清楚,易于观察,取得了很好的使用效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的马尾松茎段木质部树脂道组织切片显微照片;
图2为本发明实施例1的马尾松针叶树脂道组织切片的显微照片。
图中:R为树脂道;X为木质部;P为髓。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将参照本说明书附图对本发明作进一步的详细描述。
实施例1:如附图1、2所示,一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,所述方法步骤包括:一、取材及固定;二、软化;三、脱水、透明及浸蜡;四、渗蜡与包埋;五、切片、粘片及展片;六、脱蜡、番红染色及复水;七、固绿染色及封片,所述步骤二软化包括:将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂HF的离心管中,茎段软化时间为200-280 h,针叶软化时间为90-140 h。将固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂HF的15ml离心管中,茎段材质比针叶硬,树脂道细胞的细胞壁厚。因此。茎段软化最佳时间为10天,针叶时间为5天。这比传统的切片方法对马尾松树脂道切片的组织结构更加完整。
所述步骤一为:选取长势一致,生长健壮的马尾松无性系枝条,将每条枝条截取为2 cm茎段,并将采集的针叶束剪去顶部 1/3 和基部 1/3,留取针叶中部 1/3,用蒸馏水洗净后放入配好的 FAA 固定液中,进行抽真空处理,使固定液完全浸入样品中,固定48 h以上,并在4℃下保存。
所述步骤三为:将步骤二中软化后的马尾松针叶与茎段,先用70%乙醇冲洗2-3次后,放入70%乙醇溶液中脱水3次,每次处理2 h,样品可在第三次脱水的70%乙醇溶液中长久放置保存;次日,将取出样品依次放入85%乙醇、95%乙醇继续进行每梯度各2 h脱水,再放入100%乙醇溶液进行2次各50 min脱水;脱水结束后,将样品放入体积比为1:1,且已加入0.5g番红的 100%乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡2 h;再将样品放入纯二甲苯浸泡2 h,期间每小时换一次纯二甲苯;最后将浸泡在纯二甲苯中的样品取出,放入体积比为1:1的纯二甲苯溶液和石蜡屑中,并再放置到温度40℃的恒温箱中过夜。
所述步骤四为:将步骤三中的样品放置在60℃恒温箱中,并分4次换样品中的纯石蜡溶液,第一次换的时间间隔为4 h,第二次、第三次、第四次纯石蜡溶液间隔时间为2 h,在最后一次换石蜡溶液的样品中间隔两小时后,将样品从石蜡溶液中取出并进行包埋。
所述步骤五为:将步骤四所得的蜡块修整为正梯形后,放置在切片机上进行切片,切片厚度为8 μm,将切好的蜡带轻放到涂有粘贴液的载玻片上,然后将载玻片放置40℃烘片机上烘40 min后,最后将含有蜡带的载玻片放入40℃恒温箱直到蜡带展开。一般需12h以上。粘贴液包括甲液与乙液,甲液(组分包括:1.5g明胶,100ml蒸馏水,15ml甘油,2g苯酚);乙液(组分包括:4ml甲醛,100ml蒸馏水)。
所述步骤六为:将步骤五所得的烘干切片放入二甲苯溶液30-50 min,取出后再放入新的二甲苯溶液30 min脱蜡,之后将切片依次放入体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、85%乙醇溶液、70%乙醇溶液、50%乙醇溶液中,间隔时间均为3 min,最后将切片放入1%番红溶液中染色,染色时间大于12h。1%番红溶液组分包括:100ml 50%乙醇溶液,1g番红。
所述步骤七为:将步骤六中染色后的切片,依次放入50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液、95%乙醇溶液、1%固绿溶液、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、二甲苯溶液、二甲苯溶液中,切片浸泡在50%乙醇溶液、1%固绿溶液中时间均为10-20 s,其他溶液的间隔时间均为2 min,最后将浸泡在二甲苯溶液中的切片取出,并在载玻片上滴1滴中性树胶,由同一侧轻放盖玻片,将封好的片放置常温下晾干,即为永久切片。1%固绿溶液组分包括:100ml 95%乙醇溶液,1g固绿。
所述步骤一中的FAA 固定液为体积比为5:5:90的甲醛、乙酸和70%乙醇的混合液。
所述步骤五中的粘贴液包括甲液与乙液,甲液组分为:1.5 g明胶、100 ml蒸馏水、15 ml甘油和2 g苯酚;乙液组分为:4 ml甲醛和100 ml蒸馏水,使用时,分别先滴1滴甲液再滴1滴乙液于载玻片上,并用牙签将载玻片上的混合液均匀展开,以能保证蜡带粘贴的牢固。
显微观察,可采用Olympus BX53显微镜观察切片。
参阅图1、图2、是本发明实施例的马尾松针叶与木质部树脂道的组织切片;可见本方法能够得到组织结构完整、清晰的、细胞界限清楚、美观的马尾松树脂道石蜡切片,用本方法制作马尾松树脂道石蜡切片比传统的石蜡切片技术更适合、效率更高。
本发明未详述之处,均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述方法步骤包括:一、取材及固定;二、软化;三、脱水、透明及浸蜡;四、渗蜡与包埋;五、切片、粘片及展片;六、脱蜡、番红染色及复水;七、固绿染色及封片,所述步骤二软化包括:将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂HF的离心管中,茎段软化时间为200-280 h,针叶软化时间为90-140 h。
2.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤一为:选取长势一致,生长健壮的马尾松无性系枝条,将每条枝条截取为2 cm茎段,并将采集的针叶束剪去顶部 1/3 和基部 1/3,留取针叶中部 1/3,用蒸馏水洗净后放入配好的 FAA固定液中,进行抽真空处理,使固定液完全浸入样品中,固定48 h以上,并在4℃下保存。
3.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤三为:将步骤二中软化后的马尾松针叶与茎段,先用70%乙醇冲洗2-3次后,放入70%乙醇溶液中脱水3次,每次处理2 h,样品可在第三次脱水的70%乙醇溶液中长久放置保存;次日,将取出样品依次放入85%乙醇、95%乙醇继续进行每梯度各2 h脱水,再放入100%乙醇溶液进行2次各50 min脱水;脱水结束后,将样品放入体积比为1:1,且已加入0.5g番红的100%乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡2 h;再将样品放入纯二甲苯浸泡2 h,期间每小时换一次纯二甲苯;最后将浸泡在纯二甲苯中的样品取出,放入体积比为1:1的纯二甲苯溶液和石蜡屑中,并再放置到温度40℃的恒温箱中过夜。
4.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤四为:将步骤三中的样品放置在60℃恒温箱中,并分4次换样品中的纯石蜡溶液,第一次换的时间间隔为4 h,第二次、第三次、第四次纯石蜡溶液间隔时间为2 h,在最后一次换石蜡溶液的样品中间隔两小时后,将样品从石蜡溶液中取出并进行包埋。
5.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤五为:将步骤四所得的蜡块修整为正梯形后,放置在切片机上进行切片,切片厚度为8 μm,将切好的蜡带轻放到涂有粘贴液的载玻片上,然后将载玻片放置40℃烘片机上烘40 min后,最后将含有蜡带的载玻片放入40℃恒温箱直到蜡带展开。
6.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤六为:将步骤五所得的烘干切片放入二甲苯溶液30-50 min,取出后再放入新的二甲苯溶液30min脱蜡,之后将切片依次放入体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、85%乙醇溶液、70%乙醇溶液、50%乙醇溶液中,间隔时间均为3 min,最后将切片放入1%番红溶液中染色,染色时间大于12 h。
7.根据权利要求1所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤七为:将步骤六中染色后的切片,依次放入50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液、95%乙醇溶液、1%固绿溶液、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、体积比1:1的二甲苯和100%乙醇混合溶液、二甲苯溶液、二甲苯溶液中,切片浸泡在50%乙醇溶液、1%固绿溶液中时间均为10-20 s,其他溶液的间隔时间均为2 min,最后将浸泡在二甲苯溶液中的切片取出,并在载玻片上滴1滴中性树胶,由同一侧轻放盖玻片,将封好的片放置常温下晾干,即为永久切片。
8.根据权利要求2所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤一中的FAA 固定液为体积比为5:5:90的甲醛、乙酸和70%乙醇的混合液。
9.根据权利要求5所述的马尾松树脂道石蜡切片的制备方法,其特征在于:所述步骤五中的粘贴液包括甲液与乙液,甲液组分为:1.5 g明胶、100 ml蒸馏水、15 ml甘油和2 g苯酚;乙液组分为:4 ml甲醛和100 ml蒸馏水,使用时,分别先滴1滴甲液再滴1滴乙液于载玻片上,并用牙签将载玻片上的混合液均匀展开,以能保证蜡带粘贴的牢固。
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