CN109115573B - 文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：取材固定，冲洗，软化，脱水，透明，浸蜡和包埋，切片、粘片和展片，脱蜡和染色，以及封固；冲洗的具体方法为：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次；软化的具体方法为：将冲洗后的茎段依次在质量分数为5％的氢氟酸、50℃的质量分数为50％的丙三醇和软化液中浸泡处理一定时间；其中，软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。本发明方法，易操作、结果稳定性好、便于做大量的基础研究、切片完整、厚度均匀、组织结构清晰、染色对比度好、细胞形态完整、获得的文冠果愈伤组织切片具有很好的连续性，可永久保存。

Description

文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法
技术领域
本发明涉及石蜡切片技术领域，特别涉及一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法。
背景技术
石蜡制片是观察植物组织结构的重要而最常用的一种方法，尤其是观察植物愈伤组织的重要技术手段之一，石蜡制片的主要优点，容易操作，切片均匀且极薄、蜡带的连续性易于做连续切片、可永久保存。文冠果(Xanthoceras sorborifolia bunge)属无患子科文冠果属，落叶乔木或大灌木，其扦插繁殖属于难生根树种，利用石蜡制片的方法观察文冠果生根过程中愈伤组织和插穗基部茎组织结构变化，从理论上阐明不定根的发生部位及不定根的发育的机理和过程，为开发这类具有地方特色的种质资源，提供理论和实践指导。
文冠果是高度木质化的材料，然而产生的愈伤组织属于较为幼嫩的部位，要想获得二者均完整的组织切片极其困难。高度木质化的组织试剂进入比较困难，但又不能以单纯延长试剂浸泡时间来达到目的，因为浸泡时间过长，容易造成愈伤组织发生形变和撕裂。浸泡时间过短往往脱水不彻底，制作过程中经常出现切片空洞的问题，浸泡时间过长容易造成材料变硬，要想获得完整的组织结构相当困难。
鉴于上述描述，亟待开发一种可同时获得文冠果扦插枝条及其愈伤组织完整的组织切片的石蜡制片方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其能够同时获得文冠果扦插枝条及其愈伤组织完整的组织切片。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：取材固定，冲洗，软化，脱水，透明，浸蜡和包埋，切片、粘片和展片，脱蜡和染色，以及封固；
所述冲洗的具体方法为：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
所述软化的具体方法为：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理3～5小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4～6小时，最后转入软化液中浸泡24～48小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
优选的是，所述冲洗的具体方法为：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间50-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
所述软化的具体方法为：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理4.5～5小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4～4.5小时，最后转入软化液中浸泡24～28小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
优选的是，所述取材固定的具体方法为：
自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.4-0.6cm；
将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.5～0.8个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶12～1∶1∶1∶17充分混合后制得。
优选的是，所述取材固定的具体方法为：
自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.5cm；
将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.5～0.6个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶16～1∶1∶1∶17充分混合后制得。其中5％的丙三醇能够有效防止愈伤组织的收缩。
优选的是，所述脱水的具体方法为：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水60～120分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水60～90分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水60～80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水50～60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水30～40分钟，且2次浸泡脱水之间间隔5～10秒。
优选的是，所述脱水的具体方法为：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水60～80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水60～70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水60～70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水55～60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水30～35分钟，且2次浸泡脱水之间间隔5～6秒。
优选的是，所述透明的具体方法为：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡50～70分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡50～70分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡30～60分钟，且2次浸泡之间间隔15～25秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
优选的是，所述透明的具体方法为：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡50～60分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡50～60分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡30～40分钟，且2次浸泡之间间隔15～20秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
优选的是，所述浸蜡的具体方法为：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理90～120分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理90～120分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理120～160分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为56℃～60℃。
优选的是，所述浸蜡的具体方法为：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理110～120分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理110～120分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理120～130分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为58℃～60℃。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明方法中，选用合适的软化剂、软化方法和软化流程，进而有效缩短了软化时间，且软化效果好，使得木质部和愈伤组织可同时出现在切片中，便于观察；
本发明方法中，选用新型组织透明剂蓖麻油酸，蓖麻油酸属于植物油的一种类型，将其应用在透明过程中不会产生毒性，相较原有透明剂二甲苯更安全；综上，本发明方法容易操作、结果稳定性好、便于做大量的基础研究、切片完整、厚度均匀、组织结构清晰、染色对比度好、细胞形态完整、组织没有收缩现象、获得的文冠果愈伤组织切片具有很好的连续性，可永久保存。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法获得的×50文冠果愈伤组织发育茎横切面照片，其中，A部分为茎段的木质部，B部分为愈伤组织；
图2为本发明的一个实施例中所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法获得的×100文冠果愈伤组织发育不定根横切面照片；
图3为对照组中所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法获得的×50文冠果的愈伤组织发育茎横切面照片，其中，无木质部的茎段。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本发明提供一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：
1)取材固定：自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.4cm；将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.5个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶12充分混合后制得。
2)冲洗：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
3)软化：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理3小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4小时，最后转入软化液中浸泡36小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
4)脱水：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水55分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水30分钟，且2次浸泡脱水之间间隔5秒。
5)透明：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡50分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡50分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡30分钟，且2次浸泡之间间隔15秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
6)浸蜡和包埋：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理90分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理90分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理120分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为56℃。
包埋：浸蜡完毕便可采用通常的石蜡包埋并修成蜡块。
7)切片、粘片和展片：将修好的蜡块固定在载蜡器上，通过轮转式切片机将蜡快切成厚度为8μm蜡带，蜡带经显微镜检查合格后，即可用郝伯特粘贴剂将蜡带粘贴在载玻片上。粘贴时，先在洁净的载玻片上滴上一滴甲液，用小指涂抹均匀，用解剖针将蜡带放在液面上，然后加上两滴溶液乙，之后带有蜡带的载玻片放在摊片台上即可，待蜡带受热后慢慢伸展，烤干后放入37℃的烘箱进行烘干。
8)脱蜡和染色：带有蜡带的载玻片放入37℃的烘箱一天，完全干燥后，即可进行脱蜡。脱蜡采用二甲苯，为避免材料的收缩，必须逐步过渡。染色用具采用十片卧式染色缸，方法是将载玻片两个背对背，使有蜡带的一面朝外，染色缸的排列如下：
蜡带→100％二甲苯(30min)→100％二甲苯(30min)→50％二甲苯(1/2二甲苯+1/2乙醇100％)(10min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→70％酒精(5min)→1％番红(240min)→50％酒精(5min)→70％酒精(5min)→85％酒精(5min)→95％酒精(5min)→0.5％固绿(20～30s)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→1/2二甲苯(5min)→纯二甲苯(5min)→纯二甲苯(封固时再取出)。
9)封固：带有蜡带的载玻片从二甲苯中取出后用中性树胶封固。
用OLYMPUS显微镜观察、拍照，照片如图1、2所示。
实施例2
本发明提供一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：
1)取材固定：自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.6cm；将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.8个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶14充分混合后制得。
2)冲洗：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
3)软化：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理4小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡5小时，最后转入软化液中浸泡48小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
4)脱水：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水120分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水90分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水40分钟，且2次浸泡脱水之间间隔10秒。
5)透明：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡70分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡70分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡60分钟，且2次浸泡之间间隔25秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
6)浸蜡和包埋：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理120分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理120分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理160分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为60℃。
包埋：浸蜡完毕便可采用通常的石蜡包埋并修成蜡块。
7)切片、粘片和展片：将修好的蜡块固定在载蜡器上，通过轮转式切片机将蜡快切成厚度为8μm蜡带，蜡带经显微镜检查合格后，即可用郝伯特粘贴剂将蜡带粘贴在载玻片上。粘贴时，先在洁净的载玻片上滴上一滴甲液，用小指涂抹均匀，用解剖针将蜡带放在液面上，然后加上两滴溶液乙，之后带有蜡带的载玻片放在摊片台上即可，待蜡带受热后慢慢伸展，烤干后放入37℃的烘箱进行烘干。
8)脱蜡和染色：带有蜡带的载玻片放入37℃的烘箱一天，完全干燥后，即可进行脱蜡。脱蜡采用二甲苯，为避免材料的收缩，必须逐步过渡。染色用具采用十片卧式染色缸，方法是将载玻片两个背对背，使有蜡带的一面朝外，染色缸的排列如下：
蜡带→100％二甲苯(30min)→100％二甲苯(30min)→50％二甲苯(1/2二甲苯+1/2乙醇100％)(10min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→70％酒精(5min)→1％番红(240min)→50％酒精(5min)→70％酒精(5min)→85％酒精(5min)→95％酒精(5min)→0.5％固绿(20～30s)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→1/2二甲苯(5min)→纯二甲苯(5min)→纯二甲苯(封固时再取出)。
9)封固：带有蜡带的载玻片从二甲苯中取出后用中性树胶封固。
实施例3
本发明提供一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：
1)取材固定：自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.5cm；将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.6个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶17充分混合后制得。
2)冲洗：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
3)软化：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理5小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4小时，最后转入软化液中浸泡24小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
4)脱水：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水60分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水60分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水60分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水35分钟，且2次浸泡脱水之间间隔7秒。
5)透明：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡60分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡60分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡55分钟，且2次浸泡之间间隔20秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
6)浸蜡和包埋：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理110分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理110分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理130分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为58℃。
包埋：浸蜡完毕便可采用通常的石蜡包埋并修成蜡块。
7)切片、粘片和展片：将修好的蜡块固定在载蜡器上，通过轮转式切片机将蜡快切成厚度为8μm蜡带，蜡带经显微镜检查合格后，即可用郝伯特粘贴剂将蜡带粘贴在载玻片上。粘贴时，先在洁净的载玻片上滴上一滴甲液，用小指涂抹均匀，用解剖针将蜡带放在液面上，然后加上两滴溶液乙，之后带有蜡带的载玻片放在摊片台上即可，待蜡带受热后慢慢伸展，烤干后放入37℃的烘箱进行烘干。
8)脱蜡和染色：带有蜡带的载玻片放入37℃的烘箱一天，完全干燥后，即可进行脱蜡。脱蜡采用二甲苯，为避免材料的收缩，必须逐步过渡。染色用具采用十片卧式染色缸，方法是将载玻片两个背对背，使有蜡带的一面朝外，染色缸的排列如下：
蜡带→100％二甲苯(30min)→100％二甲苯(30min)→50％二甲苯(1/2二甲苯+1/2乙醇100％)(10min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→70％酒精(5min)→1％番红(240min)→50％酒精(5min)→70％酒精(5min)→85％酒精(5min)→95％酒精(5min)→0.5％固绿(20～30s)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→1/2二甲苯(5min)→纯二甲苯(5min)→纯二甲苯(封固时再取出)。
9)封固：带有蜡带的载玻片从二甲苯中取出后用中性树胶封固。
实施例4
本发明提供一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：
1)取材固定：自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.4-0.6cm；将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.7个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶16充分混合后制得。
2)冲洗：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
3)软化：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理4.2小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡5.5小时，最后转入软化液中浸泡30小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
4)脱水：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水100分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水75分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水58分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水37分钟，且2次浸泡脱水之间间隔6秒。
5)透明：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡65分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡65分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡50分钟，且2次浸泡之间间隔25秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
6)浸蜡和包埋：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理100分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理100分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理140分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为60℃。
包埋：浸蜡完毕便可采用通常的石蜡包埋并修成蜡块。
7)切片、粘片和展片：将修好的蜡块固定在载蜡器上，通过轮转式切片机将蜡快切成厚度为8μm蜡带，蜡带经显微镜检查合格后，即可用郝伯特粘贴剂将蜡带粘贴在载玻片上。粘贴时，先在洁净的载玻片上滴上一滴甲液，用小指涂抹均匀，用解剖针将蜡带放在液面上，然后加上两滴溶液乙，之后带有蜡带的载玻片放在摊片台上即可，待蜡带受热后慢慢伸展，烤干后放入37℃的烘箱进行烘干。
8)脱蜡和染色：带有蜡带的载玻片放入37℃的烘箱一天，完全干燥后，即可进行脱蜡。脱蜡采用二甲苯，为避免材料的收缩，必须逐步过渡。染色用具采用十片卧式染色缸，方法是将载玻片两个背对背，使有蜡带的一面朝外，染色缸的排列如下：
蜡带→100％二甲苯(30min)→100％二甲苯(30min)→50％二甲苯(1/2二甲苯+1/2乙醇100％)(10min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→70％酒精(5min)→1％番红(240min)→50％酒精(5min)→70％酒精(5min)→85％酒精(5min)→95％酒精(5min)→0.5％固绿(20～30s)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→1/2二甲苯(5min)→纯二甲苯(5min)→纯二甲苯(封固时再取出)。
9)封固：带有蜡带的载玻片从二甲苯中取出后用中性树胶封固。
对比例
1)取材固定：取材固定：截取扦插枝条中带有愈伤组织的茎段1cm，之后用FAA固定液(70％的酒精90ml；冰醋酸5ml；甲醛(40％)5ml)固定；
2)软化：将茎段浸泡入软化液(50％的酒精与丙三醇等体积混合)中软化15d；
3)脱水：将茎段采用不同梯度酒精浸泡脱水处理，具体为：乙醇50％处理2小时，乙醇70％处理2小时，乙醇85％处理2小时，乙醇95％(1.5小时)乙醇100％(1小时)，乙醇100％(1小时)乙醇脱水；
4)透明：透明剂选用二甲苯，首先用50％二甲苯(1/2二甲苯+1/2乙醇100％)浸泡30min，100％二甲苯浸泡30min逐步透明；
5)浸蜡：将透明后的材料放入二甲苯与石蜡的混合液中(体积比2∶1)，浸蜡温度逐渐在37℃→43℃→47℃的温箱中，将切碎的石蜡块放入浸蜡小瓶中并用注射针筒抽出空气，逐渐使二甲苯与石蜡体积比由2∶1过渡到1∶1，直至过夜后打开瓶盖让透明剂(二甲苯)蒸发。经6小时后，在65℃的温箱中第一次换蜡，直至第二日更换第二次纯蜡。第二次更换纯蜡2小时后除尽透明剂即可包埋。
其他步骤：包埋，切片、粘片和展片，脱蜡和染色以及封固同实施例1。
统计以上实施例和对比例中切片成功率以及木质部与愈伤组织同片成功率，结果见下表1：
其中，木质部与愈伤组织同片成功率＝木质部与愈伤组织同片数/总切片数×100％
表1：
Figure BSA0000169619180000131
由上表1可知，应用本发明方法，不仅有效缩短了软化时间，而且有效提高了木质部与愈伤组织同片成功率，为文冠果扦插枝条及其愈伤组织制完整组织切片提供一种石蜡制片新方法。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离说明书及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，包括：取材固定，冲洗，软化，脱水，透明，浸蜡和包埋，切片、粘片和展片，脱蜡和染色，以及封固；其特征在于，
所述取材固定的具体方法为：
将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.5～0.8个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶12～1∶1∶1∶17充分混合后制得；
所述冲洗的具体方法为：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间30-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条，茎段的长度为0.4-0.6cm；
所述软化的具体方法为：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理3～5小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4～6小时，最后转入软化液中浸泡24～48小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
2.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述冲洗的具体方法为：将取材固定后的茎段用50％的乙醇反复冲洗三次，一次冲洗时间50-60秒，其中，茎段取自含有愈伤组织的文冠果扦插枝条；
所述软化的具体方法为：将冲洗后的茎段在质量分数为5％的氢氟酸中浸泡处理4.5～5小时，之后转入50℃的质量分数为50％的丙三醇中浸泡4～4.5小时，最后转入软化液中浸泡24～28小时；其中，所述软化液为质量分数为50％的酒精与质量分数为100％丙三醇等体积混合。
3.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述取材固定的具体方法为：
自文冠果扦插枝条上切割含有愈伤组织的茎段，茎段的长度为0.5cm；
将所述茎段浸于固定液中后抽真空至0.5～0.6个大气压后保持5分钟，再于4℃下静置24小时；
所述固定液为：将质量分数为38％的甲醛、质量分数为100％的冰醋酸、质量分数为100％的丙三醇、质量分数为50％的乙醇按照体积比1∶1∶1∶16～1∶1∶1∶17充分混合后制得。
4.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述脱水的具体方法为：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水60～120分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水60～90分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水60～80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水50～60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水30～40分钟，且2次浸泡脱水之间间隔5～10秒。
5.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述脱水的具体方法为：
将经软化的茎段首先经质量分数为50％的乙醇反复冲洗三次；
将经冲洗三次后的茎段转入质量分数为50％乙醇浸泡脱水60～80分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为70％乙醇浸泡脱水60～70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为85％乙醇浸泡脱水60～70分钟；
之后将所述茎段转入质量分数为95％乙醇浸泡脱水55～60分钟；
最后将所述茎段依次转入质量分数为100％乙醇浸泡脱水2次，每次浸泡脱水30～35分钟，且2次浸泡脱水之间间隔5～6秒。
6.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述透明的具体方法为：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡50～70分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡50～70分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡30～60分钟，且2次浸泡之间间隔15～25秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
7.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述透明的具体方法为：
将经所述脱水后的茎段转入透明液I中浸泡50～60分钟；
之后将所述茎段转入透明液II中浸泡50～60分钟；
之后将所述茎段转入透明液III中浸泡2次，每次浸泡30～40分钟，且2次浸泡之间间隔15～20秒；
其中，所述透明液I为按体积比1∶3的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液II为按体积比1∶1的比例混合的蓖麻油酸和乙醇；所述透明液III为蓖麻油酸；且所述蓖麻油酸的质量分数为100％，乙醇的质量分数为100％。
8.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述浸蜡的具体方法为：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理90～120分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理90～120分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理120～160分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为56℃～60℃。
9.如权利要求1所述的文冠果扦插枝条及其愈伤组织的石蜡制片方法，其特征在于，所述浸蜡的具体方法为：
将所述透明后的茎段转入混合液I中浸泡处理110～120分钟，其中，混合液I为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比2∶1混合制得；
之后将所述茎段转入混合液II中浸泡处理110～120分钟，其中，混合液II为真空中熔化的石蜡与融化的蓖麻油酸按体积比1∶1混合制得；
之后将所述茎段转入融化的石蜡中浸泡处理120～130分钟；
以上所述浸蜡的浸泡处理温度均为58℃～60℃。
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