CN109632425A - 一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，包括如下步骤：1)截取芍药的根茎，将其固定和软化；2)将所述根茎组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片。本发明的芍药地下根茎石蜡切片制作方法可切出结构完整、清晰的芍药地下根茎组织结构，可为芍药地下根茎开发利用及发育研究提供可靠的基础技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及芍药地下根茎显微组织切片观察技术领域，具体涉及一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法。
背景技术
芍药(Paeonia lactiflora)为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉，是我国的一种重要传统名花，具有重要的药用和观赏价值，备受我国和世界人民的喜爱。芍药的根茎是茎的变态短缩结构，是向上可以发芽，向下可以生根的结构，是芍药进行无性分株繁殖的基础，其生长发育的好坏直接决定了芍药的生长状况。了解根茎的发育和形成规律对芍药发育生物学基础研究及产业扩繁生产实践具有重要意义，目前对芍药根茎的研究少有报道。
石蜡切片技术是开展植物发育生物学及组织化学研究的基础技术方法，其基本步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和封片等一系列操作步骤，其中的每一个步骤对制成高质量的切片均十分重要，需要针对不同植物植株组织结构及同一植物不同组织部位和不同发育时期进行摸索，如能找到一种植物组织不同发育时期、不同品种间通用的组织切片方法，必将极大地促进与之相关研究的发展。在芍药中，此前的组织切片研究主要围绕芍药的地下芽、地上茎与地下根，且技术繁杂不统一，而对地下根茎特别是多年生根茎的石蜡组织切片研究很少涉及，同时，芍药不同品种群品种地下根茎生长、发育状况差异较大，木质部、形成层和韧皮部等组织软硬程度不一，目前对其形成发育规律缺乏必要的了解，因此，发明一种可靠通用的芍药根茎石蜡组织切片制作方法很有必要。
综上所述,如果能找到芍药地下根茎的石蜡切片的通用制备方法,能为芍药根茎发育相关的显微组织学研究提供基础技术支撑，对揭示芍药根茎发育调控机理研究及开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，针对芍药不同品种群品种、不同生长年限地下根茎木质部、形成层、韧皮部三者硬度不一而导致切片过程中组织结构撕裂、易碎等技术问题，找到一种操作简易且通用的芍药地下根茎组织石蜡切片制备方法，使制作的切片组织结构完整、清晰，易于观察。
为实现上述目的，一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取芍药发育正常的地下根茎，将其固定和软化；
(2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，即得。
本发明提供了完整的芍药地下根茎组织的石蜡切片制作的具体流程，利用该方法能获得结构完整、清晰的组织切片，切片结果稳定、可靠，为芍药根茎发育相关基础科学研究及开发利用提供了一种参考方法。
在上述技术方案中，步骤(1)中，所述芍药地下根茎的获取，具体为：用不锈钢叉在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，在土球松动后，于另一侧在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，保证能将根茎全部挖出而不损伤根茎。将土球外围的大块土层去除后将其搬运至阴凉处自然晾晒10-20min后，手提茎秆基部，将根茎上剩余的土小心抖落，保证根茎全部露出，利于后续切割操作。用美工刀沿根茎横轴方向将根茎切下，去除多余的肉质根，用不锈钢双面刀片(使用时将其对折成两半，用其中任意一半进行切割)沿根茎横轴将根茎切割成厚约0.2mm的薄片，迅速放入装有FAA固定液(50％乙醇：冰醋酸：甲醛＝90:5:5，体积比)的离心管中浸泡保存带至实验室备用，不锈钢双面刀片韧性好、强度大，且质薄均匀，可以保证所切割根茎质地均匀、完整，迅速放入固定液中保存可防止切割下来的根茎薄片与空气接触而导致褐化。
优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述地下根茎发育正常，具体为：根茎组织结构完好、色泽鲜艳、无明显病虫害。
进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述将根茎固定，具体为：将离心管中的FAA溶液倒除后加入等体积的FAA试剂，以去除试剂中的泥土等杂质，抽真空后常温固定保存24h以上，抽真空有利于加速组织内的空气排出及FAA固定液向组织内渗透的过程，缩短固定时间。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述将根茎软化，具体为：固定处理完毕后，向离心管中加入五分之一FAA体积的甘油，手动颠倒混匀，抽真空后常温软化处理10d以上备用，加入甘油有利于防止芍药根茎因木质部、形成层及韧皮部等因软硬程度不一而导致切片过程中组织碎裂，抽真空可以加速具有软化作用的甘油较快地渗入组织内，缩短软化时间。
再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，将根茎组织脱水，具体为：将软化处理完毕的材料中的FAA试剂倒除，先后依次加入等体积的浓度50％乙醇、浓度70％乙醇、浓度85％乙醇、浓度95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为1.5h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理1.5h,更换无水乙醇再浸泡处理1.5h,梯度脱水可以保证根茎组织脱水彻底，利于后续操作。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述透明，具体为：脱水完成后，加入等体积的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡处理2h，然后更换纯二甲苯浸泡2h，再次更换纯二甲苯浸泡处理2h，梯度透明可以保证根茎组织中乙醇完全排出，透明彻底，利于后续操作。
进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述浸蜡和包埋，具体为：将熔点为60℃的固体石蜡在烘箱中融化成蜡液，待材料透明完成后，加入等体积的体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液，60℃烘箱中保温处理4h以上，之后将混合液倒除，加入等体积的纯石蜡液，60℃烘箱中保温浸蜡，每隔4h以上更换一次纯蜡液，重复3-4次后进行常规石蜡包埋，以保证组织中二甲苯被置换干净，确保浸蜡质量。包埋时将根茎组织横截面朝上水平放置在包埋盒的中间，保证根茎纵轴与包埋盒边缘留有2mm以上的间距，以保证根茎组织完整包于石蜡中，防止材料边缘石蜡过少而影响切片。将根茎组织横截面朝上摆放有利于调整材料在包埋盒中的位置，减少包埋所需时间。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述切片，具体为：根据根茎组织在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成矩形，以保证在切片时蜡带平直而不弯曲。将蜡块粘上方形木制蜡台，保证根茎横截面与木质蜡台粘贴面平行，将蜡台安装到旋转式手动切片机上进行切片，切片厚度16-25μm，以保证蜡带结构连续且完整。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述粘片及展片，具体为：用回形针制作“L”型粘蜡钩，粘蜡钩的短边长约3cm，以使其尽量与载玻片宽度基本一致，利于后续操作。将粘蜡钩的长边固定于直径约为0.5cm的圆柱形竹签上。在干净的载玻片上用塑料滴管滴约20-50ul粘片剂(1g明胶+100ml蒸馏水+15ml甘油+1g苯酚，60℃加热溶解)，用戴乳胶手套的右手食指将其抹匀，使其覆盖整个载玻片的光滑面，加入约500ul蒸馏水。用钩的短边将载玻片上的水涂抹均匀，并将载玻片上的杂质去除后用其将蜡带粘至载玻片上，再加入约500ul蒸馏水，使蜡带充分伸展，将载玻片倾斜30°，将多余的水分用吸水纸吸收后，将载玻片置于组织烤片机上，设置温度42℃使蜡带伸展，烤片时间约20-30min,之后自然干燥，保存备用。用“L”型粘蜡钩的短边涂抹载玻片一方面可以将上面的多余的水和杂质去除，另一方面可以利用其粘有的水分方便地将蜡带粘起移动至载玻片上。
再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述脱蜡和染色，具体为：将切片置于染色架上，放入装有纯二甲苯的染色缸中室温(26℃左右)浸泡脱蜡40min，脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、无水乙醇、浓度为95％乙醇、浓度为85％乙醇、浓度为70％乙醇、浓度为50％乙醇中分别浸泡3min，然后放入蒸馏水中浸泡3min，之后用1％番红浸泡染色2-4h，若番红染色时间过长，易使颜色红色过深而导致组织结构区分不明显。番红染色后的切片先放入蒸馏水中浸泡1min后，依次放入浓度为50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇中浸泡脱水处理1min，之后用0.4％的固绿染色1-3min,随后经两次无水乙醇浸泡透明处理，每次1min，以利于去除玻片上的固绿，防止颜色过深影响组织结构区分。将切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、纯二甲苯、纯二甲苯中进行透明浸泡处理各2min。
又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述封片，具体为：在通风橱中用镊子将切片从二甲苯中取出平放，在载玻片中央滴一滴约100-200ul体积的中性树胶，将盖玻片一侧先接触树胶，慢慢放下盖玻片使树胶顺着盖玻片放下的方向蔓延并将空气完全排除，待盖玻片全部放下后，将其慢慢推向另一侧以使盖玻片将组织完全覆盖，将封片完成的切片通风橱中室温干燥，制成永久切片。
本发明的优点：
本发明的芍药根茎石蜡切片方法可切出结构完整、清晰的芍药地下根茎结构，适用于不同芍药品种群品种及不同生长年限的芍药地下根茎的组织切片观察，实验结果稳定、可靠，该技术方法的基本原则方法对芍药科木本植物牡丹地下根茎的切片制作同样适用，可为芍药地下根茎开发利用及发育研究提供可靠的基础技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例中的芍药‘大富贵’一年生根茎组织切片示意图；
图2为本发明实施例中的芍药‘大富贵’一年生根茎组织切片局部放大图；
图3为本发明实施例中的芍药‘大富贵’三年生根茎组织切片示意图；
图4为本发明实施例中的芍药‘大富贵’三年生根茎组织切片局部放大图；
图5为本发明实施例中的芍药‘粉玉奴’一年生根茎组织切片示意图；
图6为本发明实施例中的芍药‘粉玉奴’一年生根茎组织切片局部放大图；
图7为本发明实施例中的芍药‘粉玉奴’三年生横根茎组织切片示意图；
图8为本发明实施例中的芍药‘粉玉奴’三年生横根茎组织切片局部放大图；
图9为本发明实施例中的杂种芍药‘Coral Sunset’根茎组织切片示意图；
图10为本发明实施例中的杂种芍药‘Coral Sunset’根茎组织切片局部放大图；
图11为本发明实施例中的杂种芍药‘Cream Delight’根茎组织切片示意图；
图12为本发明实施例中的杂种芍药‘Cream Delight’根茎组织切片局部放大图；
图13为本发明实施例中的伊藤芍药‘Goning Banana’根茎组织切片示意图；
图14为本发明实施例中的伊藤芍药‘Goning Banana’根茎组织切片局部放大图；
图15为本发明实施例中的伊藤芍药‘Lemon Dream’根茎组织切片示意图；
图16为本发明实施例中的伊藤芍药‘Lemon Dream’根茎组织切片局部放大图；
图17为本发明实施例中的牡丹地下根茎组织切片示意图；
图18为本发明实施例中的牡丹地下根茎组织切片局部放大图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下附图用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
于2017年4月底至2018年10月下旬，采集芍药不同品种群品种(中国芍药品种群品种‘粉玉奴’、中国芍药品种群品种‘大富贵’、杂种芍药品种群品种‘Coral Sunset’、杂种芍药品种群品种‘Cream Delight’、伊藤芍药品种群品种‘Goning Banana’、伊藤芍药品种群品种‘Lemon Dream’不同发育时期的根茎及牡丹地下根茎。供试材料种植于国家花卉工程中心小汤山种质资源圃(北京，昌平区，小汤山镇)。
实施例中所涉及的芍药植株发育正常，地下根茎生长健壮，无明显病虫害。但本发明的保护范围不限于这些实施例。
实施例1
本实施例涉及一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，包括如下步骤：本实施例中所涉及的芍药品种为‘大富贵’，
1)获取芍药发育正常的地下根茎，将其固定和软化，具体为：用不锈钢叉在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，在土球松动后，于另一侧在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm。将土球外围的大块土层去除后将其搬运至阴凉处自然晾晒10-20min后，手提茎秆基部，将根茎上剩余的土小心抖落，保证根茎全部露出。用美工刀沿根茎横轴方向将根茎切下，去除多余的肉质根，用不锈钢双面刀片(使用时将其对折成两半，用其中任意一半进行切割)沿根茎横轴将根茎切割成厚约0.2mm的薄片，迅速放入装有FAA固定液(50％乙醇：冰醋酸：甲醛＝90:5:5，体积比)的离心管中浸泡保存带至实验室备用，随后将离心管中的FAA溶液倒除后加入等体积的FAA试剂，以去除试剂中的泥土等杂质，抽真空后常温固定保存24h以上，固定处理完毕后，向离心管中加入五分之一FAA体积的甘油，手动颠倒混匀，抽真空后常温软化处理10d以上备用。
2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，具体为：将软化处理完毕的材料中的FAA试剂倒除，先后依次加入等体积的浓度50％乙醇、浓度70％乙醇、浓度85％乙醇、浓度95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为1.5h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理1.5h,更换无水乙醇再浸泡处理1.5h。脱水完成后，加入等体积的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡处理2h，然后更换纯二甲苯浸泡2h，再次更换纯二甲苯浸泡处理2h。将熔点为60℃的固体石蜡在烘箱中融化成蜡液，待材料透明完成后，加入等体积的体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液，60℃烘箱中保温处理4h以上，之后将混合液倒除，加入等体积的纯石蜡液，60℃烘箱中保温浸蜡，每隔4h以上更换一次纯蜡液，重复3-4次后进行常规石蜡包埋，包埋完成后，根据根茎组织在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成矩形，将蜡块粘上方形木制蜡台，保证根茎横截面与木质蜡台粘贴面平行，将蜡台安装到旋转式手动切片机上进行切片，切片厚度16-25μm。用回形针制作“L”型粘蜡钩，粘蜡钩的短边长约3cm。将粘蜡钩的长边固定于直径约为0.5cm的圆柱形竹签上。在干净的载玻片上用塑料滴管滴约20-50ul粘片剂(1g明胶+100ml蒸馏水+15ml甘油+1g苯酚，60℃加热溶解)，将其抹匀，使其覆盖整个载玻片的光滑面，加入约500μl蒸馏水，用粘蜡钩的短边将载玻片上的水涂抹均匀，并将载玻片上的杂质去除后用其将蜡带粘至载玻片上，再加入500ul蒸馏水，使蜡带充分伸展，将载玻片倾斜30°，将多余的水分用吸水纸吸收后，将载玻片置于组织烤片机上，设置温度42℃使蜡带伸展，烤片时间约20-30min,之后自然干燥，保存备用。随后将切片置于染色架上，放入装有纯二甲苯的染色缸中室温(26℃左右)浸泡脱蜡40min，脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、无水乙醇、浓度为95％乙醇、浓度为85％乙醇、浓度为70％乙醇、浓度为50％乙醇中分别浸泡3min，然后放入蒸馏水中浸泡3min，之后用1％番红浸泡染色2-4h。番红染色后的切片先放入蒸馏水中浸泡1min后，依次放入浓度为50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇中浸泡脱水处理1min，之后用0.4％的固绿染色1-3min,随后经两次无水乙醇浸泡透明处理，每次1min。随后将切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、纯二甲苯、纯二甲苯中进行透明浸泡处理各2min。在通风橱中用镊子将切片从二甲苯中取出平放，在载玻片中央滴一滴约100-200μl体积的中性树胶，将盖玻片一侧先接触树胶，慢慢放下盖玻片使树胶顺着盖玻片放下的方向蔓延并将空气完全排除，待盖玻片全部放下后，将其慢慢推向另一侧以使盖玻片将组织完全覆盖，将封片完成的切片通风橱中室温干燥，制成永久切片。
本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图1-4。
实施例2
与实施例1相比，其区别在于，本实施例中所涉及的芍药品种为‘粉玉奴’。本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图5-8。
实施例3
与实施例1和实施例2相比，其区别在于，本实施例中所涉及的芍药品种为‘CoralSunset’。本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图9-10。
实施例4
与实施例1、实施例2及实施例3相比，其区别在于，本实施例中所涉及的是芍药品种为‘Cream Delight’。本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图11-12。
实施例5
与实施例1、实施例2、实施例3及实施例4相比，其区别在于，本实施例中所涉及的是芍药品种为‘Goning Banana’。本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图13-14。
实施例6
与实施例1、实施例2、实施例3、实施例4及实施例5相比，其区别在于，本实施例中所涉及的是芍药品种为‘Lemon Dream’。本实施例芍药地下根茎的石蜡切片图示请见图15-16。
实施例7
与实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5及实施例6相比，其区别在于本实施例中所涉及的是牡丹的地下根茎，本实施例牡丹地下根茎的石蜡切片图示请见图17-18。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于固定前未将根茎切割成约2mm厚的根茎薄片，直接进行固定、软化及后续操作，结果切片时因组织碎裂、蜡带不成形而导致部分切片失败。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于在脱水前未在FAA试剂中加入甘油对根茎组织进行软化处理，直接进行脱水、透明及后续操作，结果切片时因组织碎裂、蜡带不成形而导致部分切片失败。
对比例3
与实施例1相比，其区别在于番红染色时间超过4h，导致根茎组织红色染色过深而组织细胞结构区分不明显，影响观察和识别。
对比例4
与实施例1相比，其区别在于固绿染色时间超过3min，导致根茎组织绿色染色过深而组织细胞结构区分不明显，影响观察和识别。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均属于本发明要求保护范围。
Claims (10)
1.一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取芍药的地下根茎，将其固定和软化；
(2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，即得。
2.根据权利要求1所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(1)中所述根茎的获取，具体为：用不锈钢叉在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，在土球松动后，于另一侧在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，将土球外围的大块土层去除后将其搬运至阴凉处自然晾晒10-20min后，手提茎秆基部，将根茎上剩余的土小心抖落，用美工刀沿根茎横轴方向将根茎切下，去除多余的肉质根，用不锈钢双面刀片沿根茎横轴将根茎切割成约0.2mm的薄片，迅速放入装有FAA固定液(50％乙醇：冰醋酸：甲醛＝90:5:5，体积比)的离心管中浸泡保存带至实验室备用。
3.根据权利要求1-2所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(1)中，所述将根茎进行固定和软化，具体为：将离心管中的FAA溶液倒除后加入等体积的FAA试剂，以去除试剂中的泥土等杂质，抽真空后常温固定保存24h以上，随后向离心管中加入五分之一FAA体积的甘油，手动颠倒混匀，抽真空后常温软化处理10d以上备用。
4.根据权利要求1-3所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织脱水，具体为：将软化处理完毕的材料中的FAA试剂倒除，先后依次加入等体积的浓度50％乙醇、浓度70％乙醇、浓度85％乙醇、浓度95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为1.5h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理1.5h,更换无水乙醇再浸泡处理1.5h,以保证脱水彻底。
5.根据权利要求1-4所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织透明，具体为：脱水完成后，加入等体积的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡处理2h，然后更换纯二甲苯浸泡2h，再次更换纯二甲苯浸泡处理2h。
6.根据权利要求1-5所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织浸蜡和包埋，具体为：将熔点为60℃的固体石蜡在烘箱中融化成蜡液，待材料透明完成后，加入等体积的体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液，60℃烘箱中保温处理4h以上，之后将混合液倒除，加入等体积的纯石蜡液，60℃烘箱中保温浸蜡，每隔4h以上更换一次纯蜡液，重复3-4次后进行常规石蜡包埋，包埋时将根茎组织横截面水平放置在包埋盒的中间，保证根茎纵轴与包埋盒边缘留有2mm以上的间距。
7.根据权利要求1-6所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述切片，具体为：根据根茎组织在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成矩形，将蜡块粘上方形木制蜡台，保证根茎横截面与木质蜡台粘贴面平行，将蜡台安装到旋转式手动切片机上进行切片，切片厚度16-25μm。
8.根据权利要求1-7所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述粘片及展片，具体为：用回形针制作“L”型粘蜡钩，粘蜡钩的短边长约3cm，将粘蜡钩的长边固定于直径约为0.5cm的圆柱形竹签上，在干净的载玻片上用塑料滴管滴约20-50ul粘片剂(1g明胶+100ml蒸馏水+15ml甘油+1g苯酚，60℃加热溶解)，将其抹匀，使其覆盖整个载玻片的光滑面，加入约500μl蒸馏水，用粘蜡钩将载玻片上的水涂抹均匀后用其将蜡带粘带至载玻片上，再加入约500ul蒸馏水，使蜡带充分伸展，将载玻片倾斜30°，将多余的水分用吸水纸吸收后，将载玻片置于组织烤片机上，设置温度42℃使蜡带伸展，烤片时间约20-30min,之后自然干燥，保存备用。
9.根据权利要求1-8所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述脱蜡和染色，具体为：将切片置于染色架上，放入装有纯二甲苯的染色缸中室温(26℃左右)浸泡脱蜡40min，脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、无水乙醇、浓度为95％乙醇、浓度为85％乙醇、浓度为70％乙醇、浓度为50％乙醇中分别浸泡3min，然后放入蒸馏水中浸泡3min。之后用1％番红浸泡染色2-4h。番红染色后的切片先放入蒸馏水中浸泡1min后，依次放入浓度为50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇中浸泡脱水处理1min，之后用0.4％的固绿染色1-3min,随后经两次无水乙醇浸泡透明处理，每次1min。将切片依次放入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液、纯二甲苯、纯二甲苯中进行透明浸泡处理各2min。
10.根据权利要求1-9所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述封片，具体为：在通风橱中用镊子将切片从二甲苯中取出平放，在载玻片中央滴一滴约100-200μl体积的中性树胶，将盖玻片一侧先接触树胶，慢慢放下盖玻片使树胶顺着盖玻片放下的方向蔓延并将空气完全排除，待盖玻片全部放下后，将其慢慢推向另一侧以使盖玻片将组织完全覆盖，将封片完成的切片通风橱中室温干燥，制成永久切片。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109991063A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-07-09 | 广西壮族自治区药用植物园 | 重楼块根的石蜡切片方法 |
| CN113624580A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-09 | 四川农业大学 | 一种竹类植物叶脉的染色方法 |
| CN113692934A (zh) * | 2020-05-22 | 2021-11-26 | 中科农林科技有限公司 | 芍药繁殖方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103630421A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-12 | 沈阳农业大学 | 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法 |
| CN106525530A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-22 | 河南科技大学 | 一种树木茎干组织的石蜡切片方法 |
| CN107167350A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-15 | 云南省农业科学院园艺作物研究所 | 一种茄子根茎部组织的石蜡切片的制备方法 |
| CN108871842A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-11-23 | 北京林业大学 | 一种芍药根茎组织的徒手切片方法及其应用 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103630421A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-12 | 沈阳农业大学 | 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法 |
| CN106525530A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-22 | 河南科技大学 | 一种树木茎干组织的石蜡切片方法 |
| CN107167350A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-15 | 云南省农业科学院园艺作物研究所 | 一种茄子根茎部组织的石蜡切片的制备方法 |
| CN108871842A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-11-23 | 北京林业大学 | 一种芍药根茎组织的徒手切片方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘瑞芳主编: "《生命科学与工程实验》", 30 June 2016, 中国矿业大学出版社 * |
| 刘虹等主编: "《植物学实验》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 * |
| 张贞华等: "《生物标本和教具的制作》", 30 April 1984, 浙江科学技术出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109991063A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-07-09 | 广西壮族自治区药用植物园 | 重楼块根的石蜡切片方法 |
| CN113692934A (zh) * | 2020-05-22 | 2021-11-26 | 中科农林科技有限公司 | 芍药繁殖方法 |
| CN113692934B (zh) * | 2020-05-22 | 2022-12-23 | 中科农林科技有限公司 | 芍药繁殖方法 |
| CN113624580A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-09 | 四川农业大学 | 一种竹类植物叶脉的染色方法 |
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