CN105492015A

CN105492015A - 治疗炎症疾病的方法和无细胞组合物

Info

Publication number: CN105492015A
Application number: CN201480027178.3A
Authority: CN
Inventors: J·E·伍德尔-马伊; J·C·希金斯; M·D·利奇; K·欧肖内西
Original assignee: Biomet Biologics LLC
Current assignee: Biomet Biologics LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2016-04-13
Also published as: WO2014149266A2; AU2014238363A1; US9758806B2; EP2968433A2; US20140274893A1; CA2906310A1; AU2014238363B2; WO2014149266A3

Abstract

用于治疗炎症的无细胞组合物，包含IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-lRII中的两种或多种。所述无细胞组合物的组分可来源于生物学材料，如血液凝块以及尿液。组分也可从细胞培养物中获得。

Description

治疗炎症疾病的方法和无细胞组合物

介绍

本技术涉及一种治疗炎性疾病，包括骨关节炎的方法。特别是，方法包括使用含细胞因子的无细胞溶液。

炎症是一个复杂的细胞和生化过程，其发生在受影响的血管和邻近组织中，以应答由物理、化学或生物制剂，例如病原体、过敏原或刺激物，引起的损伤或异常刺激。炎症过程包括局部反应和在组织中产生的形态变化；破坏或去除致病物；以及导致修复和愈合的应答。在大多数情况下，炎症是一种有益的且短暂的过程，当机体攻击和克服了传染原或其他有害物质，就会消退。然而，在某些情况下，炎症能够是慢性自我延续的过程，例如，作为正在进行的退化过程(如关节炎)或自身免疫性疾病的部分，导致组织破坏。慢性炎症与多种疾病相关，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、牙周炎、结肠炎和一些癌症。

炎症应答由许多生化反应组成，涉及局部血管系统和免疫系统，以及受损组织内的各种细胞。该过程涉及释放许多来源于细胞的介质，包括组胺、γ干扰素、白介素8、白三烯、一氧化氮、前列腺素、肿瘤坏死因子α和白介素-1。尤其是，白介素-1(IL-1)包括细胞因子家族，其能刺激淋巴细胞和巨噬细胞，活化噬菌细胞，增加前列腺素的产生，有助于骨关节退化，提高骨髓细胞的增殖，并参与许多慢性炎性病症。IL-1可由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞产生，并且可以是抗感染的炎性应答的部分。

IL-1的作用模式可以通过白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1ra；也称为“IRAP”)来介导。IL-1ra与IL-1结合细胞表面上相同的受体，从而阻止IL-1发送信号到该细胞。IL-1ra分泌自白细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、多形核细胞(PMN)和其他细胞，并且可以调节各种IL-1相关的免疫和炎性应答，如ArendWP,MalyakM,GuthridgeCJ,GabayC(1998)"Interleukin-1receptorantagonist:roleinbiology"Annu.Rev.Immunol.16:27-55所述。IL-1ra的产生是由一些物质刺激的，所述物质包括粘附免疫球蛋白G(IgG)、其他细胞因子以及细菌或病毒组分。IL-1ra，以及其它细胞因子，如可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNF-R1)、可溶性肿瘤坏死因子受体2(sTNF-R2)和可溶性白介素受体II(sIL-lRII)，是关节炎、结肠炎、和肉芽肿性肺病中的重要的天然抗炎蛋白。

IL-1ra可以用于治疗类风湿性关节炎，一种自身免疫性疾病，其中IL-1起着关键的作用，减轻与所述疾病相关的炎症和软骨退化。例如，Kineret^TM(anakinra)是重组的、非糖基化形式的IL-1ra(AmgenManufacturing,Ltd.,ThousandOaks,California)。各种重组白介素-1抑制剂和治疗方法描述于美国专利号6599873，Sommer等人，公开于2003年7月29日；美国专利号5075222，Hannum等人，公开于1991年12月24日；美国申请公开号2005/0197293，Mellis等人，公开于2005年9月8日。另外，从体液产生IL-1ra，包括使用自体的液体的方法，描述于美国专利号6623472，Reinecke等人，公开于2003年9月23日；美国专利号6713246，Reinecke等人，公开于2004年3月30日；美国专利号6759188，Reinecke等人，公开于2004年7月6日。

许多炎症治疗是已知的现有技术。本领域中已知的治疗，可针对去除引起的炎症反应的潜在刺激物或物质，或通过介导炎性应答的一个或多个方面。实例包括糖皮质类固醇(例如氢化可的松、可的松、泼尼松和倍氯米松)、非类固醇抗炎药(例如阿司匹林、布洛芬和萘普生)和免疫选择性抗炎药。然而，许多治疗存在副作用，特别是在长期施用期间，或者具有限制其使用的药理学特性。例如，虽然使用IL-1ra的组合物和方法是本领域已知的，它们可能与IL-1ra的稳定性和半衰期相关，以及与所供IL-Lra的量和速率有关。此外，许多治疗无助于解决炎症过程的潜在原因。因此，需要治疗炎症的改进的方法，提供提高的功效，降低的副作用，以及改进的给药特性的一种或多种。

概要

本技术提供生成包含抗炎性细胞因子的无细胞组合物的方法，所述组合物用于治疗由白介素-1和肿瘤坏死因子α介导的炎症和其他疾病。此类组合物包含下列组分：

(a)白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；和

(b)可溶性肿瘤坏死因子受体I(sTNF-r1)；

其中，至少一个组分源于尿液、血液凝块或组织培养物。在各种实施方案中，IL-1ra的浓度至少约10,000pg/ml，sTNF-RI的浓度至少约1200pg/ml。该组合物可进一步包含可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNF-RII)、来源于血小板的生长因子AB和BB(PDGF-AB和PDGF-BB)、表皮生长因子(EGF)和其混合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含肝细胞生长因子(HGF)或可溶性白介素-1受体II(sIL-lRII)中的至少一种。

还提供了生产组合物的方法，包括制备用于治疗由IL-1介导的疾病的无细胞组合物的方法，包括：

(a)在生长培养基中培养细胞，所述细胞生产IL-1ra以及，任选地，其它细胞因子，如肿瘤坏死因子-α；

(b)分离培养基；和

(c)冷冻干燥组合物。

培养可以单层培养的形式、在生物反应器中或以非贴壁培养的形式来进行，所述培养使用经基因工程化以过量生产IL-1ra的培养的细胞。

方法还可以包括将细胞置于电磁场。

所述无细胞组合物的组分也可源于生物学材料，例如血液凝块和尿液。

附图说明

图1是用于产生血液凝块的装置的示意图。

图2显示用于浓缩血液凝块提取物以产生抗炎性细胞因子的装置，离心前(图2A)和离心后(图2B)。

相应的参照数字表明整个附图的几个视图中相应的部分。应当指出的是，这里所阐述的附图旨在举例说明本技术中的材料、组合物、装置和方法的一般特征，目的在于描述某些实施方案。这些图可能不会精确地反映任一给定实施方案的特征，且未必意在完全定义或限制该技术的范围内的具体的实施方案。

发明详述

以下技术的描述仅仅示例一个或多个发明的组合物及其制备和使用的特性，并且无意限制本申请或要求本申请优先权的其他申请或由其获得的专利中要求保护的任何特定的发明的范围、应用或使用。在此发明详述的结尾处提供旨在帮助理解本技术的术语和短语的非限制性的讨论。

本技术涉及组合物，制备组合物的方法，以及使用组合物治疗炎性疾病，以及由白介素-1介导的其他疾病的方法。组合物包括两种或多种细胞因子，其中至少一种来源于尿液、凝结的血液或组织培养物。

蛋白质组合物

本技术提供用于治疗人或其他哺乳动物对象的炎性疾病，以及由白介素-1介导的其他疾病的方法，所述方法使用包含生理学上可接受的培养基中溶解、悬浮或另外为输送到哺乳动物对象而携带的蛋白质的组合物(本文中称为“蛋白质溶液”)。在各种实施方案中，这样的组合物包含原产于正常哺乳动物对象的全血中的蛋白质(例如，细胞因子)。

本技术的组合物是无细胞。这样的“无细胞”的组合物不包含，或基本上不含，活的白细胞、血小板或其它细胞。优选地，虽然组合物可含有细胞来源的蛋白，但所述组合物不包含能够在哺乳动物对象中引起免疫原性应答的细胞碎片。

在各种实施方案中，所述蛋白质溶液包含选自IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII(可溶性肿瘤坏死因子受体2)、IGF-I(胰岛素样生长因子1)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、PDGF-AB(来源于血小板的生长因子AB)、PDGF-BB(来源于血小板的生长因子BB)、VEGF(血管内皮生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)和sIL-lRII(可溶性白介素受体II)的至少两种蛋白质，其中组合物中每种蛋白的浓度大于其在正常血液中的浓度。为了清楚起见，蛋白质溶液可以含有所列举的三个或多个蛋白质。虽然组合物中的每一个蛋白的浓度有可能大于正常血液中它们各自的浓度，但没有必要多于两个蛋白质的浓度大于正常的血液它们各自的浓度。

在各种实施方案中，蛋白质溶液包括以下组分。

表1蛋白质溶液示范组分

蛋白质浓度可以使用本领域中已知的方法来测量。例如，可以根据制造商的说明用Quantikine人免疫测定(R&&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)来测定IL-1ra、IL-1β、IL-8、sTNF-RI、TNF-α、IL-6、sTNF-RII、IL-10、IL-13和IL-4。免疫测定可测定肝细胞生长因子和可溶性IL-1RII。

在各种实施方案中，蛋白质溶液中的一种或多种蛋白质或其它组分的浓度大于其在正常血液中的浓度。(较高浓度组分的组合物被说成是“富含”这些组分。)如本文所述，在“正常”血液或其它组织中的组分的浓度是在哺乳动物对象的一般群体，例如，在正常的全血中发现的浓度。应该理解的是，该浓度是物种特异的。

因此，在各种实施方案中，蛋白质溶液的一种或多种组分的浓度大于正常血液中的成分的浓度高于大约1.5倍、约2倍或约3倍。例如，相对于正常(全)血，组合物中的组分浓度更高，具体如下：

·IL-1ra，其浓度高至少约2.5倍，或至少约3倍，或至少约5倍；

·sTNF-RI，其浓度高至少约2倍，或至少约2.5倍，或至少约3倍；

·sTNF-RII，其浓度高至少约2倍，或至少约2.5倍，或至少约3倍；

·sIL-lRII，其浓度高至少约1.5倍，或至少约1.8倍，或至少约2倍；

·EGF，其浓度高至少约2倍，或至少约3倍，或至少约5倍；

·HGF，其浓度高至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍；

·PDGF-AB，其浓度高至少约2倍，或至少约3倍，或至少约5倍；

·PDGF-BB，其浓度高至少约2倍，或至少约3倍，或至少约5倍；

·TGF-β1，其浓度高至少约3倍，或至少约4倍，或至少约6倍；

·IGF-1，其浓度高至少约1.2倍，或至少约1.4倍，或至少约1.5倍；

和

·VEGF，其浓度高至少约2倍，或至少约2.5倍，或至少约3倍。

例如，蛋白质溶液可包括：

(a)至少约10,000pg/mlIL-1ra；

(b)至少约1,200pg/mlsTNF-RI；和

(c)选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-lRII及其混合物的蛋白质，其中所述蛋白质的浓度高于正常血液中的所述蛋白质的基线浓度。在另一实例中，蛋白质溶液包含：

(a)白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，其浓度比正常血液中IL-1ra浓度高至少3倍；

(b)可溶性组织坏死因子-r1(sTNF-r1)，其浓度比正常血液中IL-1ra的浓度高至少2倍。

制备蛋白质溶液的方法：

蛋白质溶液可通过各种方法制成，包括单个组分的混合，和其中一个或多个组分来源于从源物质的方法。在各种实施方案中，蛋白质溶液通过从天然或合成来源得到的组分的混合制成。不限制本技术的范围，机制或功能，这样的无细胞抗炎性细胞因子的组合物可能在某些应用中提供优势，只要它们不引起被施用的对象的免疫原性应答。

特别是，通过示例的方式，除了上述的方法，蛋白质溶液可以包含合成或重组的，或从自体、同种异体或异种的血液或其他生物来源分离的白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)。例如，Kineret^TM(阿那白滞素)是重组的、非糖基化形式的IL-1ra，由AmgenManufacturing,Ltd.销售(ThousandOaks,California)。各种重组白介素-1抑制剂和治疗方法描述于美国专利号6599873，Sommer等人，公开于2003年7月29日；美国专利号5075222，Hannum等人，公开于1991年12月24日；美国申请公开号2005/0197293，Mellis等人，公开于2005年9月8日。另外，从体液产生IL-1ra的方法，包括使用自体的液体，描述在美国专利号6623472，Reinecke等人，公开于2003年9月23日；美国专利号6713246，Reinecke等人，公开于2004年3月30日；美国专利号6759188，Reinecke等人，公开于2004年7月6日。当要产生同种异体的抗炎性细胞因子，可合并来自多个对象的多种IL-1ra来源。

无细胞蛋白质溶液的组分也可来源于生物材料，例如血液凝块和尿液。组分也可从细胞培养物中获得。

从血液凝块获得组分

具体地，方法包括从血液凝块中锁住的液体(“凝块提取物”)获得一种或多种蛋白质溶液组分。液体(细胞释放物)可以通过压缩(“挤压”)、血块破坏或离心得到。用于产生凝块的血液可以是自体的(即，要使用蛋白质溶液进行治疗的对象获得的)，或同种异体来源的(即来自与溶液将被施用的对象同物种的对象)，或异种的(即，来自与溶液将被施用的对象不同物种的动物来源)。在一些实施方案中，同种异体血液从多个供体获得的。

血液凝块可用或不用抗凝血剂，用或不用外源性凝血酶，通过将血液或血液组分与凝血剂联用来制备。合适的凝血剂包括凝血酶(例如，牛源、重组人源、合并的人源或自体源)、自体凝血蛋白和聚乙二醇。钙可以是钙盐的形式，例如氯化钙。

在一些实施方案中，凝血剂包含凝血蛋白。合适的凝血部分可以通过以下方法来获得：将全血或血浆与钙溶液(例如，乙醇中的氯化钙)加载进入血液分离装置；加热全血或血浆至少约20分钟，温度至少约20℃；以及分离凝固部分。分离可以通过离心加热的全血或血浆完成。合适的分离装置是市面有售的，如Clotalyst^TM自体凝血酶采集系统(以下简称“Clotalyst系统”)，由BiometBiologiesLLC,Warsaw,Indiana,USA销售。

用于生产凝血剂的示例性装置100示于图1。制备凝血剂的方法开始于将含有氯化钙和乙醇试剂通过第一端口110注射进入主腔室105。玻璃珠也放置在主腔室105中。在试剂已经注入后，第一端口110使用第一替换帽115关闭。血液与抗凝剂通过第二端口120注入到主腔室105。在血液注入后，第二端口120使用第二替换帽125关闭。任选地，注射器和血液分离装置400被预热到约25℃的温度。

装置100中的内容物可通过反复反转装置100混合，例如大约12次，以便使血液与玻璃珠接触。混合后，将设备温育。温育过程可以是在一定温度下进行，在此期间允许设备100的内容物在约25℃被加热约15分钟。一旦温育完成，凝块的红细胞、血浆和玻璃珠在主腔室105的第二端106形成。温育完成后，设备100被充分摇晃以去除和破碎任何可能存在的凝胶。

凝块提取物可与一种固相提取材料接触以产生含蛋白质的液体。然后从固相提取材料分离该液体，作为本技术的蛋白质溶液。不限制本技术的范围、机制或功能，本发明中的固相提取的材料可用于浓缩凝块提取物中的细胞因子或其他蛋白质。

固相提取材料可包括提供特定表面以积接触细胞的各种材料。固相提取材料可以是连续的材料，也可以是不连续的，并且包括多个单独的颗粒的材料。例如，固相提取材料可以是多个珠、纤维、粉末、多孔材料或包含所述凝块提取物的容器的表面。固相提取材料可包含具有各种横截面形状的几何形状，例如球形、椭圆形或多边形，等等。固相提取材料还可以包括连续多孔网络，类似海绵，或者可以包括多个单独的多孔颗粒。固相提取材料还可以由多孔提供与非多孔材料相比更大的表面积。

在一些实施方案中，固相提取材料包括具有大纵横比的颗粒，例如，颗粒是针状的。固相提取材料也可由长纤维形成以及可以是或采取类似玻璃棉的形式。

在一些情况下，固相提取材料可包含容纳包含白细胞的液体的容器的内壁。例如，固相提取材料可包含注射器的内腔，所述注射器含有凝块提取物。其他容器包括管，如离心管，或血液分馏装置或浓缩器组件，如本文别处所述。

在固相提取材料是一种连续材料，例如多孔海绵状材料时，固相提取材料使用的量应足以将整个凝块提取物基本上吸收或吸收或包括在固相提取材料的孔隙或空隙内。在固相提取材料是不连续的材料，例如多个粒子时，固相提取材料可以与含有细胞的液体联用以形成浆状组合物。该浆稠度上可从具有高比例固体部分的膏状，到具有低比例固体部分的易流动浆状变化。

固相提取材料可以提供与凝块提取物接触的大表面积。然而，在一些情况下，固相提取材料可以进一步处理以增加它的表面积，例如，通过物理或化学蚀刻或侵蚀固相提取材料的表面。就化学蚀刻而言，腐蚀剂可以用来根据材料的性质修饰固相提取材料的表面。修饰的表面可通过使用碱或酸产生，例如氯磺酸，特别是强度上约20％-80％，优选约50％的氯磺酸。固相提取材料可以与腐蚀剂温育约5-30分钟，以便化学蚀刻表面，并增加表面积。随后可以洗涤固相提取材料除去腐蚀剂。例如，固相提取材料可包括用于盛放凝块提取物的容器的内壁，其中内壁被蚀刻随后增加与凝块提取物接触的表面积。

各种聚合物、金属、陶瓷和玻璃可以用作固相提取的材料。在一些实施方案中，固相提取材料包括吸湿材料。合适的固相提取材料的实例包括玻璃、矿物、聚合物、金属和多糖。矿物包括刚玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯酰胺。金属包括钛。多糖包括葡聚糖和琼脂糖。如下进一步描述，优选的固相提取材料包含聚丙烯酰胺，或基本上由其组成。

固相提取材料可以包含，例如，玻璃的连续固相提取的材料或多个玻璃颗粒、玻璃棉，连续的金属，例如钛的固相提取的材料，多个金属珠，金属粉，以及它们的组合。金属的连续固相提取材料可以包括具有开孔结构的多孔金属或金属合金构成的块或其他三维形状。固相提取材料可以包括各种尺寸的各种珠或颗粒，包括基本上球形的珠。珠包括聚苯乙烯珠、聚丙烯酰胺珠、玻璃珠、金属(例如，钛)珠，或任何其它合适的珠。珠可以是对所使用的容器和包含白细胞的液体的量合适的任何尺寸。在一些情况下，珠的尺寸范围为直径约0.001毫米到约3毫米。如珠尺寸足够小，珠更像是粉末。

用作固相提取材料的聚丙烯酰胺珠可以通过聚合丙烯酰胺单体形成，所述聚合使用本领域已知的生产相对均匀的由聚丙烯酰胺凝胶形成的珠的受控和标准化的方案。在一般情况下，聚丙烯酰胺通过将丙烯酰胺用合适的双官能交联剂聚合形成，最常用的交联剂是Ν,Ν'亚甲基双丙烯酰胺(双丙烯酰胺)。凝胶聚合通常以过硫酸铵开始，反应速率通过加入催化剂加速，如Ν,Ν,Ν',Ν'四甲基乙二胺(TEMED)。在各种实施方案中，聚丙烯酰胺珠包含0.5微摩尔羧基/毫升珠，赋予轻微的阴离子特性(负电荷)。珠也通常耐pH值的变化，并且在许多水性溶液和有机溶液里是稳定的。通过调节总的丙烯酰胺浓度，可以形成宽范围孔径大小的聚丙烯酰胺凝胶。此外，聚丙烯酰胺珠可以形成多种尺寸，并且可以具有相对均匀的尺寸分布。珠大小可以从几微米的直径到几毫米的直径。例如，各种类型的Bio-Gel^TMP聚丙烯酰胺凝胶珠(Bio-RadLaboratories,Hercules,California,USA)的颗粒尺寸范围从小于约45μm到高达180μm。聚丙烯酰胺珠也可购自SNFFLOERGER(Riceboro,Georgia,USA)，PierceBiotechnology,Inc.(Rockford,Illinois,USA)和Polymers,Inc.(Fayetteville,Arkansas,USA)。

一旦聚合，聚丙烯酰胺珠可以进行干燥并以粉末状的形式储存。干燥的珠是不溶于水，但一旦被再水合，能大大膨胀。再水合使聚丙烯酰胺珠回复凝胶稠度，可以是干燥状态大约2-3倍的的大小。因此，干燥的聚丙烯酰胺珠(即，干燥剂聚丙烯酰胺珠)可用于吸收部分的液体的体积，包括比珠孔小的溶质，并可以用于浓缩IL-1ra和由白细胞产生的其它蛋白质。例如，干聚丙烯酰胺珠与血液和/或富含血小板的血浆联用，激活白细胞产生IL-1ra，并因为干珠重新水合和溶胀降低总液体体积。

优选地，固相提取材料使用本领域中已知的技术进行灭菌，以防止凝块提取物的污染。例如，可以根据固相提取材料的特定组成而使用加热和压力灭菌法，如高压灭菌。当固相提取材料在高压灭菌过程中会受到不利影响时，可使用替代方法，如化学灭菌或辐射。

在一些实施方案中，凝块提取物与固相提取材料一起温育一定时间，以有效去除部分液体。例如，温育可以是24小时或更短，10个小时或更短，5小时或更短，2小时或更短，1小时或更短，30分钟或更短，15分钟或更短，10分钟或更短，5分钟或更短，4分钟或更短，3分钟或更短，2分钟或更短。温育可最少为约15秒，约30秒，约1分钟，约90秒，约2分钟，约10分钟，或约30分钟。在一些实施方案中，温育从约1-3分钟。在一些实施方案中，温育在约37℃进行。在一些实施方案中液体不与固相提取材料温育，但接触仅为了后续处理所需的时间。接触可发生在常温条件下，例如，在约20-25℃的温度下进行。

在一些实施方案中，凝块提取物和固相提取材料搅拌，使在接触的过程中更彻底混合这些成分。搅拌可通过反转、摇动、摇晃、搅动或涡旋液体和固相提取材料来完成。搅拌可以增加凝块提取物与固相提取材料接触。搅拌可以进行一次、重复多次、周期性地重复或是连续进行。关于使用聚丙烯酰胺珠和其它固相提取材料生产富含蛋白质的溶液的其他方面和特征描述于：美国专利申请公开号2009/0220482，Higgins等，公开于2009年9月3日；美国专利申请公开号2010/0055087，Higgins等，公开于2010年3月4日；美国专利申请公开2011/0052561，Hoeppner，公开于2011年3月3日；国际申请公开号2012/030593，Higgins等，公开于2012年3月8日；美国专利申请号2012/0172836，Higgins等，公开于2012年7月5日。

凝块提取物与固相提取材料的接触，可使用影响接触的合适的容器或其它装置来执行。接触可以在连续过程中进行，其中源源不断的凝块提取物或绕过，或通过固相提取材料，或凝块提取物和固相提取材料可以被放置于一个容器中。如上讨论，该容器可包含固相提取材料，或者可以仅仅作为容器容纳珠或其它形式的材料。在本技术有用的容器包括那些本领域中已知的，如PLASMAX^TMPlusPlasmaConcentrator，购自BiometBiologies,LLC(Warsaw,Indiana,USA)，以及可包括如美国专利No.7,553,413，Dorian等人，公开于2009年6月30日；美国专利号No.7,694,828，Swift等人，公开于2010年4月13日的所述那些设备和使用方法。

这样的装置如图2A和2B所示，为示范性用途，用聚丙烯酰胺凝胶珠固相提取材料。装置200具有上腔室205和下腔室210。上腔室205具有端壁215，凝胶珠搅拌器225的搅拌器阀杆220延伸穿过端壁215。装置200还有入口230，其延伸穿过端壁215并进入上腔室205。装置200也包括出口235，其与血浆浓缩液导管240连通。上腔室205的基底包括过滤器245，它的上表面支持干燥的浓缩聚丙烯酰胺珠250。

在使用过程中，将含有凝块提取物的液体255经由入口230注射入上腔室205，与聚丙烯酰胺珠250混合。流体255和聚丙烯酰胺珠250可通过旋转搅拌器阀杆220和凝胶珠搅拌器225被混合，以帮助流体255和聚丙烯酰胺珠250混合。然后，混合的流体255和聚丙烯酰胺珠250在所需的温度温育所需的时间。然后离心装置200以使液体被传到下腔室210，而聚丙烯酰胺珠250由过滤器245保留，由此可从所得的IL-1ra和其他蛋白质的溶液260分离聚丙烯酰胺珠250，所述溶液260在下腔室210中收集。溶液260可以经由出口235从该设备移除。

从组织培养物中获得组分

用于制备无细胞蛋白质溶液的方法可包括以细胞培养物的形式培养细胞，所述细胞天然产抗炎性细胞因子，如IL-1ra，或者细胞经工程化以产生这样的细胞因子。非限制性的自然产生抗炎性细胞因子的细胞的实例包括脂肪组织的细胞、脂肪细胞、脂肪来源的干细胞、基质细胞、骨髓细胞、间充质干细胞和血细胞。

在各种实施方案中，细胞系可经工程化以过量产生抗炎性细胞因子。抗炎性细胞因子的非限制性实例包括VEGF、TNF-a、IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII、PGDF-AB、PDGF-BB、IGF-I、EGF、TGF-β1、sIL-lRII和HGF。通过用含有编码抗炎性细胞因子和选择标记基因的重组DNA转染真核细胞，如哺乳动物细胞，生成稳定的真核细胞系，以过量表达抗炎性细胞因子。可替代地，用含有编码抗炎性细胞因子和选择标记基因的重组DNA转化原核生物和酵母，以过量表达抗炎性细胞因子。转化和转染用包含编码抗炎性细胞因子，如IL-1ra，和选择性标记的DNA序列的重组DNA分子进行。真核和原核细胞可经工程化以组成型或诱导型过表达抗炎性细胞因子。在真核和原核细胞中表达抗炎性细胞因子，如IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII和sILl-RII的方法描述于，美国专利No.6337072，Ford等人，公开于2002年1月8日；美国申请公开号2001/0053764，Sims等人，公开于2001年12月20日。

当IL-1ra在人体内转录，mRNA被剪接成四种变体，导致翻译的IL-1ra的四种同种型。SEQIDNO:1、3、5、7分别是IL-1ra同种型1-4的cDNA，SEQIDNO:2，4，6，8分别是IL-1ra同种型1-4的氨基酸序列。总的来说，IL-1ra的同种型统称“IL-1ra”。SEQIDNO:9是sTNF-RI的cDNA序列，SEQIDNO:10是sTNF-RI的氨基酸序列。SEQIDNO:11是sTNF-RII的cDNA序列，SEQIDNO:12是sTNF-RII的氨基酸序列。SEQIDNO:13是sIL-lRI的cDNA序列，SEQIDNO:14是sIL-lRI的氨基酸序列。SEQIDNO:15和17分别是sIL-lRIIvl和sIL-lRIIv3的cDNA，SEQIDNO:16和18分别是lRIIvl和sIL-lRIIv3的氨基酸序列。IL-1RIIV2的cDNA是非编码序列；因此，未包括在内。

为在原核培养物中，例如在特定细菌中，表达IL-1ra、sTNF-RI或sTNF-RII(统称为目的蛋白)，将cDNA序列(SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17)克隆到适于细菌的表达载体里。该表达载体应包含强启动子和可选择标记，如抗生素抗性。能够杀死细菌细胞的抗生素的非限制性实例包括氨苄西林、四环素、卡那霉素和氯霉素。表达载体应进一步包含导致组成型或诱导型表达目的蛋白的元件。任选地，考虑到鉴定和纯化该蛋白质，载体上与目的蛋白质的基因相邻的位置可存在对应于与目的蛋白质功能性偶联的标签的DNA序列。例如，N端或C端His标签可用于用抗His抗体检测蛋白质，并且它们可在镍柱上纯化。当制备了包含表达目的蛋白基因的表达载体，细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，可用表达载体转化。可选择的标记确保只有用该载体转化的细胞在补充有与选择标记相应的抗生素的LB培养基中存活。然后细菌可在补充有用于表达和纯化的抗生素的LB培养基中成长。表达载体，用于克隆目的蛋白到表达载体的方法，用于转化原核细胞的方法，用于从转化的原核细胞中表达蛋白的方法，以及蛋白纯化的方法是本领域的普通技术人员的常识。

为在真核培养物中，例如在哺乳动物细胞中，表达目的蛋白，将cDNA序列(SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15，或17)克隆到适合特定哺乳动物细胞的表达载体上。表达载体包含强启动子和可选择标记，例如抗生素抗性。能够杀死哺乳细胞的抗生素的非限制性实例包括遗传霉素和庆大霉素。表达载体应进一步包含导致组成型或诱导型表达目的蛋白的元件。任选地，，考虑到鉴定和纯化该蛋白质，载体上与目的蛋白质的基因相邻的位置可存在对应于与目的蛋白功能性偶联的标签的DNA序列。当制备了包含表达目的蛋白基因的表达载体，哺乳动物细胞，例如人体细胞，可用表达载体转染。转染的细胞可在补充有与选择标记相应的抗生素的细胞培养基中成长。抗生素的存在允许稳定细胞系的分离。然后稳定细胞系可在补充有用于表达和纯化的抗生素的细胞培养基中成长。表达载体，用于克隆目的蛋白到表达载体的方法，用于转染真核细胞和发展稳定细胞系的方法，用于从转染的真核细胞中表达蛋白的方法，以及蛋白纯化的方法是本领域的普通技术人员的常识。

可替代地，没有被DNA转染而遗传改变的真核细胞可被培养。真核细胞可是原代培养物，即所培养的细胞直接来自真核供体，如人，或者真核细胞也可以是已建立的细胞系。许多已建立的细胞系可购自AmericanTypeCultureCollection,Inc.(Manassas,VA,USA)。可以用或外源信号，如重组蛋白，培养细胞。真核细胞常培养于含细胞培养基的培养瓶中。细胞培养基可从瓶中回收，并离心以除去任何非贴壁细胞。

细胞培养可是单层培养、非贴壁培养或生物反应器。单层培养包含贴壁细胞，在合适的基底上培养，如细胞培养瓶和细胞培养皿，使得细胞粘附和扩散。非贴壁培养包含悬浮细胞。适合的细胞要么是不贴壁细胞，要么是适于在悬浮液中培养的贴壁细胞。许多细胞系，如许多昆虫细胞，可单层培养或悬浮液中生长。生物反应器是能支持生物学活性环境的装置，其中进行化学过程和/或获得生化活性物质。生物反应器可包括悬浮或固定化的细胞。单层培养、非贴壁培养或生物反应器可通过本领域中常用方法来保持。

在一些实施方案中，对细胞培养物施加电磁场，以便刺激一种或多种蛋白质产生。用电磁场刺激培养物可涉及多种形式的电磁刺激，如脉冲电场或电容耦合电磁场。在一些实施方案中，用与电源偶联的刺激线圈刺激所述培养物。电流通过线圈产生脉冲磁场，能在液体中诱导脉冲电场。当它放在容器内，线圈可部分缠绕细胞培养物。线圈可整合入包含细胞培养物的容器，或是可拆卸的。例如，塑料管可与集成的线圈一起形成，或线圈可暂时与容器偶联，或放在容器内；例如，该管可被构造成使得线圈可卡装在容器上。电源可以根据需要偶联到线圈进行刺激。

用电磁场刺激培养物也包括跨越液体放置至少两个电极。然后可将电能施加到电极，以便电容耦合电极以及在此间产生电磁场。因此电磁场能通过所述培养物，以增加细胞因子的生成速率和/或量。在其他实施方案中，电极可用来产生直流电或者一个或多个线圈可用来产生脉冲电磁场。

电磁场的强度在刺激过程中可以为至少约0.5微伏/厘米，无论是由直流电、电容耦合的电流、或脉冲电磁场产生。在直流电电极的情况下，电流振幅可以是约1-200微安，并且在一些实施方案中，振幅可为约20-100微安。在更进一步的实施方案中，电流可以是约20、约60或约100微安。然而，应该理解的是，电流振幅也可以是其它合适的幅度。

刺激所施加的电磁场可以恒定或随时间变化。例如，正弦时变电磁场可使用跨越液体放置的电极而施加。这种正弦时变电磁场的跨电极的峰值电压可以为约1-10伏，在一些实施方案中，峰值电压大约为5伏。所产生的相应的电场振幅可以是约0.1-100毫伏/厘米(mV/cm)，在一些实施方案中，为约20mV/cm。正弦时变电磁场的频率范围约1,000-200,000赫兹，在一些实施方案中，频率可为约60,000赫兹。

施加到培养物的电磁场也可是脉冲电磁场。脉冲电磁场可以使用外部线圈和脉冲发生器来引起。在这方面，脉冲电磁场的脉冲持续时间可以为10-2000微秒/脉冲。在一个实施方案中，脉冲持续时间大约为225微秒。脉冲可包括电磁脉冲，其中一个脉冲串可含约1-200个脉冲。可替代地，电磁场可产生含约10-30个脉冲的脉冲串。在这方面，一个实施方案中每个脉冲串可包含约20个脉冲。

施加的脉冲电磁场中的脉冲串频率可变。在这方面，一些实施方案中，脉冲串可以1-100赫兹的频率重复，在其他实施方案中，可以10-20赫兹的频率重复。此外，脉冲串以约1.5赫兹、约15赫兹或约76赫兹的频率重复。脉冲串的持续时间可为10-40,000微秒。在这方面，脉冲串持续时间约4.5毫秒。

用于产生电容耦合电磁场的合适装置包括脊髓刺激仪(EBI,L.P.,Parsippany,NewJersey)或DC刺激装置如XLIIb脊髓融合刺激仪(EBI,L.P.,Parsippany,NewJersey)。脉冲电磁场可用各种已知方法和设备产生，如采用单线圈或一对Helmholtz线圈。例如，合适的设备包括EBIBoneHealingModel2001(EBI,L.P.,Parsippany,NewJersey)和BTBS刺激线圈。关于直流电，电场可用任何已知用于产生直流电场的装置来生成，如Osteogen^TM可植入的骨生长刺激仪(EBI,L.P.,Parsippany,NewJersey)。也可使用其他合适的装置产生电磁场。

细胞培养物可以自然释放抗炎性细胞因子至培养基中，或培养物可被诱导释放抗炎性细胞因子至培养基中。培养基可以通过抽吸、离心或过滤分离，用于形成无细胞抗炎性细胞因子的组合物。

从尿液中获得组分

在一些实施方案中，抗炎性细胞因子从尿液分离，用于生产本技术的蛋白质溶液。蛋白质可通过本领域已知的方法从尿液分离。由orgenBiotekCorp.(Thorold,Ontario,Canada)出售的ProteoSpin^TMUrineProteinConcentrationMaxiKit采用了一种这样的方法。此试剂盒利用整合进离心柱的离子交换树脂。简言之，获得尿液样品，并将其pH调节至3.5。然后将尿液转移到含有离子交换树脂的离心柱里，所述离心柱放置于收集管内。然后将柱离心，其中蛋白质附着于树脂，剩余液体和盐流入收集管内被丢弃。随后通过应用提供的柱激活和洗涤缓冲液洗涤蛋白质，接着离心。过柱液被丢弃，重复洗涤程序。将洗脱缓冲液(10mM磷酸钠，pH12.5)加到柱上并将中和剂加到洗脱管内。含有洗脱缓冲液的离心柱置于洗脱管并离心，从而将蛋白质洗脱，并捕获于含中和剂的洗脱管。

治疗组合物

本技术还提供了包含蛋白质溶液和第二组分的组合物，所述第二组分包含活性物质、生理载体、以及它们的组合。在一些实施方案中，组合物包含安全和有效量的蛋白质溶液和安全和有效量的第二活性物质。组分的“安全和有效”量是这样的量，当以本技术的方式使用时，其足以在人或其它哺乳动物对象中达到所需的治疗效果，而没有过度的不良副作用(如毒性、刺激或过敏反应)，具有相称的合理的利益/风险比。组分的具体的安全和有效量随各种因素明显变化，如治疗的具体病症，患者的身体状况，同时治疗的性质(如果有的话)，所用的具体组分，具体给药途径和剂型，采用的载体(如果有的话)，以及所需的剂量方案。

本文中有用的那些活性材料包括生物制品和药物活性物质。生物制剂包括成分血，如PRP，血液制品，以及浓缩的骨髓抽吸物(cBMA)。因此，在一些实施方案中，本技术提供了包含安全和有效量的蛋白质溶液和安全和有效量的cBMA的组合物。自体治疗组合物包含APS和cBMA，其比例为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。可替代地，APS：cBMA比例可以是约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或10:1。cBMA包括造血干细胞、基质干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、红细胞、白细胞、成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞或内皮细胞。本文中可用的制备cBMA的方法描述于美国申请公开号2006/0278588，Woodell-May，公开于2006年12月14日。

可用于本发明的药物活性成分包括有机分子、蛋白质、肽、肽模拟物、核酸、核蛋白、反义分子、多糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物和多糖、植物提取物及其合成的和生物工程化的类似物、活细胞(不是白细胞基质细胞，如软骨细胞、骨髓细胞)、病毒和病毒颗粒、天然提取物，以及它们的组合。生物活性材料的具体的非限制性实例包括激素、抗生素和其它抗感染剂、造血剂、血栓形成剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂(化疗剂)、退热剂、止痛药、抗炎剂、抗过敏剂、血管扩张剂、细胞因子、生长因子、基因调节剂、维生素、矿物质和其它营养品，营养保健品和它们的组合。特别是，活性物包括支气管扩张剂(如沙丁胺醇、左布特罗(levabuterol)、irbuterol、异丙托铵、沙美特罗和福莫特罗)、糖皮质类固醇(例如莫米松、氟替卡松、布地奈德和丙酸倍氯米松)、抗生素、抗病毒剂以及它们的组合。在一些实施方案中，除了那些存在于蛋白质溶液的组分，组合物可包含生长因子，如来源于血小板的生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白(BMP)。

在一些实施方案中，蛋白质溶液包含来自包含白细胞的组织的一种或多种细胞因子，通过使包含白细胞的液体与固相提取材料接触。包含白细胞的液体包括血液、脂肪组织、骨髓、及其部分，如富血小板血浆。固相提取的材料包括上述的那些。通过将全血离心制备成分血的装置描述于，美国专利号7992725，Leach等，公开于2011年8月9日；美国专利号7374678，Leach，公开于2008年5月20日；美国专利号7179391，Leach等人，公开于2007年2月20日；美国专利号7992725，Leach等人，公开于2011年8月9日；美国专利号7806276，Leach等人，公开于2010年10月5日；以及美国专利号8048297，Leach等人，公开于2011年11月1日。制备富含细胞因子溶液的方法描述于，美国专利申请公开号2009/0220482，Higgins等人，公开于2009年9月3日；美国专利申请公开号2010/0055087，Higgins等人，公开于2010年3月4日；美国专利申请公开号2011/0052561，Hoeppner，公开于2011年3月3日；国际申请公开号2012/030593，Higgins等人，公开于2012年3月8日；和美国专利申请公开号2012/0172836，Higgins等人，公开于2012年7月5日。在本技术的方面有用的组合物和方法，也在与本发明同时提交的以下申请中描述：美国专利申请系列号13/840562，Binder等人，MethodsandNon-ImmunugenicCompositionsforTreatingInflammatoryDiseases；美国专利申请系列号13/841083，Landrigan等人，TreatmentofInflammatoryRespiratoryDiseaseUsingProteinSolutions；美国专利申请号13/837480，O’Shaughnessey等人，TreatmentofPainUsingProteinSolutions；美国专利申请系列号13/839280，Leach等人，MethodsforMakingCytokineCompositionsfromTissueUsingNon-CentrifugalMethods；美国专利申请系列号13/840129，Matusuka等人，TreatmentofCollagenDefectsUsingProteinSolutions；以及美国专利申请系列号13/841103，Landrigan等人，TreatmentofPeripheralVascularDiseaseUsingProteinSolutions，所有这些都通过引用并入本文。

除了任何含蛋白质溶液的液体，组合物可包含载体材料。应当理解的是，在本技术的各种实施方案中，治疗的方法采用如以上组成和制备的蛋白质溶液，没有进一步的载体，通过直接注射到或通过其它应用到治疗部位。然而，在其他实施方案中，可以使用额外的载体材料，其理由如易于施用，帮助使用特定的输送装置施用，增强活性，增加将蛋白质溶液保持在施用部位的时间。本文中有用的载体包括盐水、透明质酸、胶原蛋白、缓冲液(如Hank氏缓冲液)、细胞培养基、血液制品(如PRP和贫血小板血浆)、骨髓抽吸物、浓缩的骨髓抽吸物，以及它们的混合物。

蛋白质溶液和包含蛋白质溶液的组合物可在施用前通过任何合适的方法灭菌。例如，蛋白质溶液可以通过无菌过滤器来处理由上述方法制备的产品进行灭菌。在一些实施方案中，抗生素可在上述的接触步骤中包含在固相提取材料里，或者可以在本文中所描述的方法和治疗方法的各种步骤的一个或多个添加。可替代地，或另外地，蛋白质溶液可以无菌制备。

蛋白质溶液和包含蛋白质溶液的组合物也可在产生后使用在那些本领域中已知的方法冻干(冷冻干燥，或冻干)。当冷冻干燥时，抗炎性细胞因子组合物可在施用之前或在施用时水化。水化可通过将该组合物与溶液来完成，所述溶液包括盐水、缓冲液、血液、成分血、骨髓抽吸物、浓缩骨髓抽吸物和它们的组合。

本技术提供了包含来自血液或其他组织来源的组分的组合物，适合于同种异体施用。特别是，这样的组合物可包含从一个哺乳动物对象，或多个哺乳动物对象分离的蛋白质和其他组分，所述哺乳动物对象不是本技术的方法中所述组合物所施用的对象。在一些实施方案中，蛋白质溶液含有从待治疗的对象分离而来的组分以及除了待治疗对象之外的一个或多个对象中分离的组分。

治疗方法

本技术提供了治疗人或哺乳动物对象中由IL-1ra介导的炎症疾病或其它疾病的方法，其包括给对象施用本技术的蛋白质溶液。这类疾病可用升高的嗜中性粒细胞计数来表征。没有限制本技术的机制、功用或功能，该技术的方法和治疗调节了白介素-1效应以及它在炎症级联中的作用。通常如上述讨论，白介素-1(IL-1)包括细胞因子家族，其能刺激淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，激活噬菌细胞，增加气道纤维化，促进呼吸道中淋巴细胞结节，提高MMP-9和MMP-12的产量，以及参与许多慢性炎性病症。IL-1可由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞产生，并且是抗感染炎症反应的一部分。参见，Lappalainen等人，"Interleukin-1βCausesPulmonaryInflammation,Emphysema,andAirwayRemodelingintheAdultMurineLung"AmericanJournalofRespiratoryCellandMolecularBiology,vol.32,no.4,pages311-318(April2005)。

IL-1的作用模式可由IL-1ra介导。IL-1ra结合细胞表面上与IL-1相同的受体，从而阻止IL-1将信号传送到该细胞。IL-1ra从白细胞分泌，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、多形核细胞(PMNs)，和其他细胞，其可以调节各种IL-1相关的免疫和炎症应答，如下所述，ArendWP,MalyakM,GuthridgeCJ,GabayC(1998)"Interleukin-1receptorantagonist:roleinbiology"Annu.Rev.Immunol.16:27-55。IL-1ra产生受一些物质刺激，包括粘附性免疫球蛋白G(IgG)、其他细胞因子，以及细菌或病毒组分。同样，TNF-a的作用模式由sTNF-RI和sTNF-RII介导，这阻止TNF-a结合到结合sTNF-RI和/或sTNF-RII的膜上。

通过本技术的方法治疗炎性疾病的实例包括类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质溶解、肌腱炎、滑膜炎、外周血管疾病，以及炎性呼吸系统疾病(如慢性阻塞性肺病、纤维化、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征，和肺炎)。治疗方法还包括预防、减少或消除各种疾病相关的疼痛，如创伤性损伤、肌肉拉伤、关节炎(类风湿关节炎和骨关节炎)、滑膜炎、骶髂关节疾病、背部疾病、外科手术后的注射、肌腱注射、运动医学过程(例如，ACL修复、MCL修复、BTB修复、髌骨修复或软骨修复)、挫伤、肌肉劳损、创伤后骨关节炎相关的疼痛。方法还包括在胶原蛋白缺陷，如在关节炎，损伤或手术操作相关的关节的缺陷，的位置刺激软骨细胞生成。

在一些实施方案中，本技术的方法包括将蛋白质溶液施用到组织缺陷的部位，以预防或治疗IL-1ra相关的疾病。如本文中所提，这样的“组织缺陷”包括涉及对生理或美容目的不恰当的组织的任何病症。这种缺陷的实例包括那些先天性的，那些由疾病、疾病或损伤的症状导致的或是疾病或损伤的症状导致的，和那些手术或其它医疗程序的结果。实施方案包括治疗血管、骨骼、皮肤、神经，器官和组织缺陷。这种缺陷的实例包括骨质疏松、脊椎固定程序、髋关节和其他关节置换术、慢性伤口、骨折、组织和肌肉的硬化，以及脊髓或其他神经损伤所引起的那些。在各种实施方案中，本发明的组合物和方法可以用于与骨修复或软骨缺陷相关的方法中。

在各种实施方案中，方法用于治疗人类的炎性疾病。在其他实施方案中，治疗是用于非人哺乳动物，如陪伴、工作和体育动物。例如，本技术的这样的方法可用于治疗马的炎性疾病。

在各种实施方案中，本技术的方法包含用于制备蛋白质溶液的护理点的方法。此处所指的“护理点的方法”是本技术的方法，例如，从血液凝块或尿液中生产蛋白质溶液，所实施的时间接近给所治疗的对象施用该蛋白质溶液。这种方法可以在待输入的哺乳动物对象邻近的位置进行，如在同一房间(例如，床边)，或另外地直接相邻。在各种实施方案中，“接近的时间”可以是给对象施用蛋白质溶液的，例如，12小时内、8小时内、2小时内、1小时内或30分钟内。

在一些实施方案中，蛋白质溶液与伴随疗法一起施用。这种疗法包括，例如，施用如上所述药物活性物或生物制剂。在一些实施方案中，伴随疗法与蛋白质溶液同时施用。例如，方法可包括与安全和有效剂量的活性物质一起施用蛋白质溶液，所述活性物质选自糖皮质激素、非甾体消炎药、抗生素、抗病毒剂，以及它们的组合。

在一些实施方案中，方法包括与如上所述的浓缩的骨髓抽吸物一起施用蛋白质溶液。例如，cBMA和蛋白质溶液可以相伴施用。

本技术的方法一般包括将蛋白质溶液施用在哺乳动物对象的炎症部位。可以用任何合适的装置，包括本领域已知的这类将组合物局部递送到肌肉、关节、血管、肺或其它组织的装置，进行蛋白质溶液的施用。例如，用于治疗与关节疾病相关的炎症或疼痛的局部递送包括在关节或在关节附近注射蛋白质溶液。治疗炎性呼吸系统疾病包括通过气管插管、吸入器和喷雾器输送蛋白质溶液。

术语的非限制性讨论

标题(例如“介绍”和“概要”)和本文所用的副标题仅用于披露范围内主题的一般组织，不旨在限制本技术或其它任何方面的披露。特别是，在“介绍”中公开的主题可能包括新的技术，并可能不构成现有技术的叙述。“概要”中公开的主题并不是一个详尽或完整公开的整个范围的技术或由此的任何实施方案。材料的分类或讨论在本说明的一节内是为了方便，以及不应该得出推论，当它被用于在任何给定的组合物时，该材料必须或完全按照本文分类行使功能。

本公开里引用的所有专利和专利申请的公开内容通过引用并入本文。

在说明该技术的实施方案时，描述和具体例子仅旨在用于说明，而并非意在限制本技术的范围。具体实施方案、材料、组合物和方法的等效变化、修改、变体可以在本技术的范围内进行，具有基本相似的结果。此外，具有所述特征的多个实施方案的叙述不旨在排除具有附加功能的其它实施方案，或结合了所述特征的不同组合的其它实施方案。提供具体的实例的目的是为了说明如何制备和使用本技术的组合物和方法，并且除非明确说明，不旨在表示本技术的给定的实施方案已被或没有被提出或测试。

如本文所用，词语“优选”或“优选的”指的是在某些情况下，提供一定好处的该技术的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的表述并不意味着其它实施方案不可用，也不意味着将其它的实施方案排除于本技术的范围。

如本文所用，词语“包括”和它的变体，意在非限制性的，使得列表中的项目的列举不排除其他类似项目也可用于本技术的材料、组合物、设备以及方法。类似地，术语“能够”和“可以”以及其变体意在非限制性的，使得叙述实施方案能够或者可以包括某些元素或特征，并不排除本技术的不含有那些元素或特征的其它实施方案。

作为非限制性的术语，例如，包括，含有，或具有的同义词，尽管开放式术语“包含”在本文中用于描述和要求保护本技术的实施方案，但是，可以替代地，实施方案可以使用更限制性的术语如“由...组成”或“基本上由...组成”来描述。因此，对于列举材料、组分或方法步骤的任何给定的实施方案中，本技术还具体包括，由，或基本上由，这些材料、组分或方法组成的实施方案，不包括另外的材料、组分或方法(对于由……组成)和不包括影响该实施方案显著性质的另外的材料、组分或方法影响实施方案(对于基本上由……组成)，即使这样的另外的材料、部分或过程中没有在本申请中明确详述。例如，列举要素A、B和C的组合物或方法的详述具体设想的实施方案为由，以及基本上由A、B和C组成，排除可能在本领域中列举的要素D，即使要素D在本文未明确描述被排除在外。此外，如本文使用的术语“基本上由列举的材料或组分组成”设想为“由所列举的材料或组分组成”的实施方案。

本文中所用的“一个”表示项目中的“至少一个”存在；可能的话，多个这样的项目也可以存在。当应用于数值时，“大约”表示计算或测量允许该数值的一些轻微的不精确性(接近精确的值；大约或合理地接近该值；几乎)。如果，由于某种原因，“大约”提供的不精确性不被理解成本领域的普通含义，那么如本文所用“大约”至少表示可能从测量或使用这种参数的常规方法出现的变化。

如本文所用，除非另有说明，范围包括端点，并且包括整个范围内公开内容的所有不同的值和进一步划分的范围。因此，例如，范围“从A到B”或“从约A到约B”是包括A和B。特定参数(如温度，分子量，比重等)的值和值的范围的公开并不排除可用于本发明的其他值和其范围。可以设想，用于给定参数的两个或多个特定的示例性的值可以限定该参数可要求保护的值的范围的端点。例如，如果此处举例说明参数X具有数值A和还举例具有数值Z，可以设想，参数X可以具有的值的范围从约A到约Z。相似地，可以设想，公开参数的两个或更多个值的范围(不管范围是否是嵌套的、交叠的或不同的)包括值的范围的所有组合，其可以用所公开的范围的端点要求保护。。例如，如果本文举例说明参数X具有1-10或2-9或3-8的范围内的值，还设想参数X可以具有的值的其它范围包括1-9、1-8、1-3、1-2、2-10、2-8、2-3、3-10和3-9。

Claims

1.基本上无细胞的抗炎性细胞因子组合物，包括以下组分：

(a)白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；和

(b)可溶性肿瘤坏死因子受体I；其中，所述组分的至少一种源自尿液、凝结的血液或组织培养物。

2.权利要求1的抗炎性组合物，其中IL-1ra的浓度为至少约10,000pg/ml，并且sTNF-RI的浓度为至少约1,200pg/ml。

3.权利要求1的抗炎性组合物，进一步包含选自以下的细胞因子：可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNF-RII)、源自血小板的生长因子AB和BB(PDGF-AB和PDGF-BB)、表皮生长因子(EGF)及其混合物。

4.权利要求3的抗炎性组合物，进一步包含肝细胞生长因子(HGF)或可溶性白介素-1受体II(sIL-lRII)的至少一种。

5.权利要求4的抗炎性组合物，其中HGF的浓度为至少约3000pg/ml。

6.权利要求4的抗炎性组合物，其中所述抗炎性细胞因子的组合物是冷冻干燥的。

7.权利要求1的抗炎性组合物，其中所述白介素-1受体拮抗剂源于尿液。

8.权利要求1的抗炎性组合物，其中所述白介素-1受体拮抗剂源于组织培养物。

9.权利要求1的抗炎性组合物，其中所述白介素-1受体拮抗剂源于血液凝块。

10.权利要求1的抗炎性组合物，进一步包含载体材料。

11.权利要求10的抗炎性组合物，其中所述载体材料选自透明质酸、胶原蛋白以及其混合物。

12.用于治疗IL-1介导的疾病的基本上无细胞的抗炎性细胞因子组合物，包含以下组分：

(a)至少约10,000pg/ml的IL-1ra；

(b)至少约1,200pg/ml的sTNF-RI；和

(c)选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-lRII及其混合物的蛋白质，其中组合物中所述蛋白质的浓度大于正常血液中该蛋白的浓度；以及

其中，至少一种所述组分来源于尿液、凝结的血液或组织培养物。

13.权利要求12的抗炎性组合物，其中，至少一种组分是分离的尿液、凝结的血液或组织培养物。

14.权利要求12的组合物，其中，至少一种组分是从培养基获得的，所述培养基来自单层细胞培养物、生物反应器或非贴壁细胞培养物。

15.制备用于治疗IL-1介导的疾病的无细胞抗炎性细胞因子组合物的方法，包括：

(a)在生长培养基中培养产IL-1ra的细胞；

(b)分离培养基；和

(c)将组合物冷冻干燥。

16.权利要求15的方法，其中所述培养以单层培养的方式、在生物反应器中或以非贴壁培养的方式进行。

17.权利要求15的方法，其中所培养的细胞经遗传工程化以过量产生IL-1ra。

18.权利要求17的方法，其中经遗传工程化以过量产生IL-1ra的所培养的细胞是用包含编码IL-1ra的DNA序列的重组DNA分子转染的哺乳动物细胞。

19.权利要求15的方法，其中所培养的细胞是来源于血液、骨髓、脂肪组织或脂肪来源的干细胞的细胞。

20.权利要求15的方法，其中所述培养包括将细胞置于电磁场。

21.权利要求20的方法，其中所述电磁场包括脉冲电磁场或电容耦合电磁场。

22.治疗由IL-1介导的疾病的方法，包括给有需要的对象施用权利要求1的基本上无细胞的组合物。

23.权利要求22的方法，其中所述疾病是关节炎、骨质溶解、肌腱炎、滑膜炎、疼痛、创伤性损伤、肌肉拉伤、外周血管疾病或炎性呼吸道疾病。

24.权利要求22的方法，还包括给所述对象施用选自类固醇、止痛药及其组合的药物活性成分。

25.治疗哺乳动物对象中由IL-1介导的疾病的方法，包括给所述对象施用权利要求6的基本上无细胞的组合物。

26.权利要求25的方法，其中在施用前，组合物在溶液中复水，该溶液选自盐水、缓冲液、血液、成分血、骨髓抽吸物、浓缩的骨髓抽吸物及其组合。

27.治疗由IL-1介导的疾病的方法，包括给有需要的对象施用权利要求9的基本上无细胞的组合物。

28.权利要求25的方法，其中哺乳动物对象是人。

29.权利要求25的方法，其中哺乳动物对象是非人哺乳动物。