CN106754673A - 一种培养基底的修饰方法及间充质干细胞分离扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种培养基底的修饰方法及使用该方法的间充质干细胞分离扩增方法。所述修饰方法，包括以下步骤：A、将PEG和CYCLIC‑RGD溶于氯仿中，得到修饰液；B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；C、回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器。利用特定的高分子化学物质而不是使用成分难以确定的细胞外基质对培养容器进行修饰，配合适当的培养基，能够实现间充质干细胞的高效分离扩增。

Description

一种培养基底的修饰方法及间充质干细胞分离扩增方法
技术领域
本发明属于领域，具体涉及一种培养基底的修饰方法及使用该方法的间充质干细胞分离扩增方法。
背景技术
干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体各组织细胞新陈代谢的一群细胞。同时，在生物体内各种组织受到内源或外源性的损害时，干细胞可以被激活执行分化功能，从而达到修复该组织的目的。间充质干细胞在适当的条件下，具有强大的增值能力和分化能力，能够修复多种组织损伤，包括骨骼，肌肉，神经等组织，因此，间充质干细胞在再生医学治疗领域引起了越来越多的重视。
骨髓当中含有丰富的间充质干细胞，因此得到了最为广泛和深入的研究。研究证实，骨髓间充质干细胞表达特定的表面抗原表型，比如，CD45-，CD34-，CD29+，CD90+，CD73+和CD105+。在体外和体内环境中可向骨骼，软骨，神经以及胰岛等细胞分化。另外，骨髓间充质干细胞具有免疫调节的功能，分泌多种免疫相关信号分子，从而在免疫性疾病治疗过程中发挥作用。但是，尽管骨髓间充质干细胞细胞较易分离和培养，但是，骨髓来源有限，难以满足临床大量的需求。即便是进行患者的自体移植，患者也必须承担额外的痛苦。在其他组织，比如肌肉，脂肪，脑以及血液等其它组织也能分离获得间充质干细胞。这些细胞有与骨髓间充质干细胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，应用其他组织的间充干细胞面临着和应用骨髓间充质干细胞相同的问题，及样品稀缺，不足以满足临场需求。
已经证实，血液中含有活性很强的干细胞群，包括造血干细胞和间充质干细胞。血液中的间充质干细胞与骨髓干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，血液干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。同时，应用血液治疗糖尿病，神经损伤以及血管坏死等疾病也屡见报道。
但是，由于血液中间充质干细胞含量极低，如何高效分离和扩增这些细胞成为了阻碍血液间充质干细胞向临床转化的难题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种培养基底的修饰方法及使用该方法的间充质干细胞分离扩增方法。所述修饰方法，利用特定的高分子化学物质而不是使用成分难以确定的细胞外基质对培养容器进行修饰，配合适当的培养基，能够实现间充质干细胞的高效分离扩增。
本发明所采用的技术方案为：一种培养基底的修饰方法，包括以下步骤：
A、将PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修饰液；
B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；
C、回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器。
其中PEG为聚乙二醇，CYCLIC-RGD为环-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。使用被所述修饰方法修饰过得培养容器，能够能够实现间充质干细胞的高效分离扩增。
作为一种回收氯仿的方式，步骤C中，将培养容器置于2-10℃的负压下36-60小时，以完成氯仿的回收。采用低温负压的方式，是为了不破坏修饰液中的成分。
为稳定修饰层及整个体系的pH值，优选的技术方案是，步骤C后还包括步骤D、向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应10-14小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗。
进一步地，步骤D中，向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应12小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并继续在震荡下反应24小时后，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次。
根据本发明的实施例，步骤D中使用的磷酸盐缓冲液的浓度为10mg/mL，pH值为8。
为保证间充质干细胞分离扩增的顺利进行，不被杂菌污染，优选的技术方案是，步骤D之后还包括步骤E、将培养容器使用环氧乙烷进行消毒处理。
根据发明人的研究发现，所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.1-0.005g时有较好的修饰效果，PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.01g时，修饰效果最好，能够起到最好的分离扩增间充质干细胞的效果。
本发明还提供了一种使用所述修饰方法的间充质干细胞分离扩增方法，包括以下步骤：
A、将血液和同体积的α-MEM培养基混合，并加入浓度为3-8g/L的甲基纤维素溶液，静置30-40分钟，得到细胞悬液；
B、取所述细胞悬液的上清液，加至相对密度为1.077的淋巴细胞分离液上，并在2500-3000rpm的转速下离心20-40min，取界面层，加入磷酸盐缓冲液得到单细胞悬液；
C、将所述单细胞悬液接种至经所述修饰方法修饰过得培养容器内进行培养，当细胞达到90％融合时，进行传代培养并扩增。
为了进一步提高间充质干细胞的培养效率，优选的技术方案是，步骤A中，向培养α-MEM培养基中添加0.5-2％的Pen-Strep，5-100ng/mL的b-FGF，5-100ng/mL的EGF和5-100ng/mL的TGF-β。其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种培养基底的修饰方法及使用该方法的间充质干细胞分离扩增方法。所述修饰方法，利用特定的高分子化学物质而不是使用成分难以确定的细胞外基质对培养容器进行修饰，配合适当的培养基，能够实现间充质干细胞的高效分离扩增。
附图说明
图1为应用实施例6所述经过高分子修饰基底的培养容器及培养方法分离扩增血液中间充质干细胞的相差显微镜图片。可以看到细胞形态均一，均为纺锤形，状态良好。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种培养基底的修饰方法，包括以下步骤：
A、将PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修饰液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.1g；
B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；
C、将培养容器置于10℃的负压下36小时，回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器；
D、向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应12小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并继续在震荡下反应24小时后，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mg/mL，pH值为8；
E、将培养容器自然干燥后使用环氧乙烷进行消毒处理，备用。
实施例2
一种培养基底的修饰方法，包括以下步骤：
B、将PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修饰液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.005g；
B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；
C、将培养容器置于2℃的负压下60小时，回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器；
D、向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应12小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并继续在震荡下反应24小时后，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mg/mL，pH值为8；
E、将培养容器自然干燥后使用环氧乙烷进行消毒处理，备用。
实施例3
一种培养基底的修饰方法，包括以下步骤：
C、将PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修饰液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.01g；
B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；
C、将培养容器置于6℃的负压下48小时，回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器；
D、向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应12小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并继续在震荡下反应24小时后，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mg/mL，pH值为8；
E、将培养容器自然干燥后使用环氧乙烷进行消毒处理，备用。
实施例4
一种使用实施例1所述修饰方法的间充质干细胞分离扩增方法，包括以下步骤：
A、无菌条件下，将脐带血和同体积的α-MEM培养基混合，向培养α-MEM培养基中添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mLb-FGF，5ng/mL EGF和100ng/mL TGF-β；得到培养液，并浓度为3g/L的甲基纤维素溶液，甲基纤维素溶液与所述培养液的体积比为4:1；静置40分钟，得到细胞悬液；
B、取所述细胞悬液的上清液，加入磷酸盐缓冲液，加至相对密度为1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，并在2750rpm的转速下离心40min，取界面层，加入磷酸盐缓冲液得到单细胞悬液；因为Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml，其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界层面即可收集到比较纯的单核细胞。
C、将所述单细胞悬液接种至经所述修饰方法修饰过得培养容器内进行培养，具体方式为：随后，使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基均匀打散收集到的细胞，脐带血间充质干细胞培养基是指在添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mL的b-FGF，5ng/mL的EGF和100ng/mL的TGF-β等生长因子的α-MEM培养基。
细胞打散后，接种于实施例1制备的培养容器(细胞培养板)，7天后更换培养基，洗涤培养板，除去未贴壁细胞，继续使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，每7天换液一次，直至细胞接近90％融合。
将90％融合细胞用胰酶进行消化，接种于未经实施例1处理过的培养板，使用10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，3天换液一次。直至融合，并进行下一次传代。
当细胞达到90％融合时，进行传代培养并扩增。
实施例5
一种使用实施例2所述修饰方法的间充质干细胞分离扩增方法，包括以下步骤：
A、无菌条件下，将脐带血和同体积的α-MEM培养基混合，向培养α-MEM培养基中添加2％的Pen-Strep，5ng/mLb-FGF，100ng/mL EGF和5ng/mL TGF-β；得到培养液，并浓度为8g/L的甲基纤维素溶液，甲基纤维素溶液与所述培养液的体积比为4:1；静置35分钟，得到细胞悬液；
B、取所述细胞悬液的上清液，加入磷酸盐缓冲液，加至相对密度为1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，并在3000rpm的转速下离心30min，取界面层，加入磷酸盐缓冲液得到单细胞悬液；因为Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml，其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界层面即可收集到比较纯的单核细胞。
C、将所述单细胞悬液接种至经所述修饰方法修饰过得培养容器内进行培养，具体方式为：随后，使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基均匀打散收集到的细胞，脐带血间充质干细胞培养基是指在添加2％的Pen-Strep，5ng/mL的b-FGF，100ng/mL的EGF和5ng/mL的TGF-β等生长因子的α-MEM培养基。
细胞打散后，接种于实施例2制备的培养容器(细胞培养板)，7天后更换培养基，洗涤培养板，除去未贴壁细胞，继续使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，每7天换液一次，直至细胞接近90％融合。
将90％融合细胞用胰酶进行消化，接种于未经实施例2处理过的培养板，使用10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，3天换液一次。直至融合，并进行下一次传代。
当细胞达到90％融合时，进行传代培养并扩增。
实施例6
一种使用实施例3所述修饰方法的间充质干细胞分离扩增方法，包括以下步骤：
A、无菌条件下，将脐带血和同体积的α-MEM培养基混合，向培养α-MEM培养基中添加1％的Pen-Strep，50ng/mLb-FGF，10ng/mL EGF和10ng/mL TGF-β；得到培养液，并浓度为5g/L的甲基纤维素溶液，甲基纤维素溶液与所述培养液的体积比为4:1；静置30分钟，得到细胞悬液；
B、取所述细胞悬液的上清液，加入磷酸盐缓冲液，加至相对密度为1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，并在2500rpm的转速下离心20min，取界面层，加入磷酸盐缓冲液得到单细胞悬液；因为Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml，其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界层面即可收集到比较纯的单核细胞。
C、将所述单细胞悬液接种至经所述修饰方法修饰过得培养容器内进行培养，具体方式为：随后，使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基均匀打散收集到的细胞，脐带血间充质干细胞培养基是指在添加1％的Pen-Strep，50ng/mL的b-FGF，10ng/mL的EGF和10ng/mL的TGF-β等生长因子的α-MEM培养基。
细胞打散后，接种于实施例3制备的培养容器(细胞培养板)，7天后更换培养基，洗涤培养板，除去未贴壁细胞，继续使用添加10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，每7天换液一次，直至细胞接近90％融合。
将90％融合细胞用胰酶进行消化，接种于未经实施例3处理过的培养板，使用10％胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，3天换液一次。直至融合，并进行下一次传代。
当细胞达到90％融合时，进行传代培养并扩增。
实施例7
本实施例FACs(流式细胞荧光分选技术)对实施例6中扩增得到的干细胞进行表面抗原检测，结果如表1所示。
表1表面抗原检测结果表
指示剂 反应
CD34 -
CD45 -
CD3 -
CD73 +
CD105 +
CD90 +
表1证实，对于实施例6所分离和培养的干细胞，CD34、CD45及CD3为阴性，而CD73、CD105及CD90为阳性。此结果表明实施例6所分离并扩增的细胞是间充质干细胞。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种培养基底的修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修饰液；
B、将修饰液均匀涂抹在培养容器的内表面；
C、回收培养容器内表面上修饰液中的氯仿，得到内表面覆盖有修饰层的培养容器。
2.根据权利要求1所述的修饰方法，其特征在于，步骤C中，将培养容器置于2-10℃的负压下36-60小时，以完成氯仿的回收。
3.根据权利要求1所述的修饰方法，其特征在于，步骤C后还包括步骤D、向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应10-14小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗。
4.根据权利要求3所述的修饰方法，其特征在于，步骤D中，向培养容器内加入磷酸盐缓冲液，在震荡下反应12小时，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并继续在震荡下反应24小时后，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次。
5.根据权利要求4所述的修饰方法，其特征在于，步骤D中使用的磷酸盐缓冲液为浓度为10mg/mL，pH值为8的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求3所述的修饰方法，其特征在于，步骤D之后还包括步骤E、将培养容器使用环氧乙烷进行消毒处理。
7.根据权利要求1所述的修饰方法，其特征在于，所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.1-0.005g。
8.根据权利要求7所述的修饰方法，其特征在于，所述PEG和CYCLIC-RGD的比例为1mL：0.01g。
9.一种使用权利要求1-8任一所述修饰方法的间充质干细胞分离扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将血液和同体积的α-MEM培养基混合，并加入浓度为3-8g/L的甲基纤维素溶液，静置30-40分钟，得到细胞悬液；
B、取所述细胞悬液的上清液，加至相对密度为1.077的淋巴细胞分离液上，并在2500-3000rpm的转速下离心20-40min，取界面层，加入磷酸盐缓冲液得到单细胞悬液；
C、将所述单细胞悬液接种至经所述修饰方法修饰过得培养容器内进行培养，当细胞达到90％融合时，进行传代培养并扩增。
10.根据权利要求9所述的间充质干细胞分离扩增方法，其特征在于，步骤A中，向培养α-MEM培养基中添加0.5-2％的Pen-Strep，5-100ng/mL的b-FGF，5-100ng/mL的EGF和5-100ng/mL的TGF-β。
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