CN105079885A - 一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明提供了一种既具有3D多孔结构利于种子细胞附着和生长、又可缓释控释、并可用于注射的内部镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂。本发明还提供了该多孔复合微球制剂的制备方法，以及该多孔复合微球制剂在制备骨或软骨组织缺损修复材料中的应用。发明的多孔复合微球可以作为细胞黏附和增殖的良好载体，可直接注射到达靶部位，为骨和软骨组织损伤提供非手术修复的可能性，具有广阔的临床应用和市场前景。

Description

一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂及其制备方法与应用。

背景技术

日常生活中较常出现骨和软骨损伤，其临床治疗效果不佳，常规手术治疗往往给患者带来持续的疼痛，易导致骨不连等副作用的发生。利用骨组织工程学，采用可降解聚合物材料制成组织工程支架以修复骨和软骨损伤是近年来的研究热点。组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与技术，研究用于修复、维护和促进人体组织或器官损伤后的形态和功能的生物替代物的学科。随着骨科无创伤和微创等非手术治疗方式的需要，研制兼具可注射、持续释放生长因子、三维多孔结构的细胞支架成为骨和软骨组织工程发展的重要方向之一。

根据支架植入机体的方式，固体型组织工程支架主要可分为两大类：①可注射型，以微球体为主，既具有一定的力学强度，又具有良好的可流动性，包括两种：(A)载生长因子或化学药物的聚合物微球(没有多孔结构)，能很好地控制药物释放，但没有多孔结构不利于种子细胞在支架上的黏附，也不能提供细胞生长所需的3D空间；(B)多孔微球，能增大微球的表面积以利于细胞附着，并提供细胞在体外生物反应器或体内增殖分化的3D空间，但是不含或无法控释生长因子或化学药物；②非注射型，即需通过手术植入的支架，预先或使用前整合了生长因子或化学药物的多孔支架(或纳米纤维状支架)，形状多为薄膜状、片状、块状等，由于体积较大且有一定刚性，必须通过手术才能植入。

聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)由于具有良好的组织相容性和生物可降解性而广泛用于组织工程支架。多孔微球由于既可以注射，又具有一定的力学强度，3D多孔结构还可以作为细胞扩增载体，是一种优良的注射型组织工程支架。但是，多孔结构又会导致生长因子或化学药物的快速释放，这一矛盾需要解决。例如：中国专利申请CN200810044593.6，发明名称为“一种可降解聚合物多孔微球的制备方法及其用途”，公开号为CN101249077，公开了一种可降解聚合物多孔微球的制备方法，制备得到的多孔微球采用吸附法使药物进入微球的多孔结构，但缺点在于吸附的药物释放快速。又如：中国专利CN200810161673.X，发明名称为“一种亲水性药物双重微球制剂及其制备方法”，公开号为CN101366700，公开了一种亲水性药物双重微球制剂的制备方法，是先制备亲水性药物的壳聚糖纳米粒，再将制备得到的纳米粒分散至PLGA的乙腈或二氯甲烷溶液中，制得双重微球制剂，该双重微球制剂是将含药壳聚糖纳米粒分散在PLGA微球内部，优点是保持了壳聚糖纳米粒对亲水性药物具有的高包封效率，体外释放缓慢，达到了药物缓释的目的，缺点在于该微球无3D多孔结构，不利于种子细胞黏附和增殖。

在骨组织工程支架中应用较多的细胞因子是骨形态发生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)，属于转化生长因子超家族的一员，能够促进间充质干细胞向成骨细胞分化，并导致钙沉积，从而形成新生骨。BMP-2已经广泛用于科研和临床方面的骨组织再生。但是，即使将BMP-2混合在组织工程支架中，需要的BMP-2含量仍然较大，费用高昂，增加了临床转化的难度。转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1)也是转化生长因子超家族的重要一员，具有促进细胞增殖和分化等作用。

本申请人已于2013年9月17日，申请了两项中国专利，一是申请号为CN201310425057.1，发明名称为“一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法”，公开号为：CN103495205A；另一是申请号为CN201310423354.2，发明名称为“一种可注射的镶嵌BMP2微粒的多孔PLGA复合微球制剂及其制备方法与应用”。

申请人发现目前尚无文献报道一种既具有3D多孔结构有利于种子细胞附着和生长，又可同时缓释控释BMP-2和TGF-β1，并可用于注射的多孔微球制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既具有3D多孔结构利于种子细胞附着和生长、又可缓释控释骨形态发生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)和转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)，并可用于注射的，内部镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂。

本发明的另一个目的是提供该多孔复合微球制剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供该多孔复合微球制剂在制备骨或软骨组织缺损修复材料中的应用。

本申请人发现在使用BMP-2的同时，合并使用TGF-β1对BMP-2有促进作用，从而降低BMP-2在支架中的加入量，不仅降低经济成本并可提高疗效。

本发明的主要技术方案是提供一种可注射的镶嵌含骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)和壳聚糖微球和转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)微粒的聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)多孔复合微球制剂，具体是：

首先在壳聚糖、明胶、海藻酸钠或白蛋白等亲水性材料中摸索出适合包裹BMP-2和TGF-β1形成含药微粒的材料；

其次是用于制备多孔微球的材料PLGA，在分子量为5000～300000中摸索优选的分子量；

再次是初步设定含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒的重量百分比为1:1至5:1寻找出最合适的配比；

最后通过体外释放实验、裸鼠皮下异位成骨实验来考察含BMP-2和TGF-β1微粒的多孔复合微球制剂是否能促进骨组织修复。

本发明的第一方面，是提供一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，由多孔微球和镶嵌在多孔微球中的含药微粒组成；所述的多孔微球的平均粒径为为100～500μm，平均孔径为20～30μm；所述的含药微粒的平均粒径为200nm～30μm；

所述的含药微粒为分别独立的含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒，所含的药物BMP-2或TGF-β1分别占含药微粒的0.01～10％(W/W)，且含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒的重量百分比为5:1；

所述的含药微粒，用于含药微粒制备的材料为分子量为100000的壳聚糖，壳聚糖的用量占含药微粒重量百分比为90～99.99％(W/W)；

所述的含药微粒(含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒的总和)占多孔复合微球制剂总体组成(多孔微球+含药微粒)的2～50％(W/W)。

所述的多孔微球，具有为种子细胞增殖提供模拟体内生长所需的3D空间，用于制备多孔微球的材料为聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)，并且采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1(W/W)。

所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成(多孔微球+含药微粒)的50～98％(W/W)。

PLGA分子量的优选方案为100000。

所述的致孔剂，包括碳酸氢盐、碳酸盐、双氧水、白蛋白和环糊精等，碳酸氢盐包括碳酸氢铵和碳酸氢钠等，碳酸盐包括碳酸锌和碳酸镁等，可选用其中的一种或多种，用量与多孔微球材料比例为1:10～1:1(W/W)。较佳地，致孔剂可选用碳酸氢铵，和制备多孔微球的材料的重量比为1:4～1:1(W/W)。

本发明在壳聚糖、明胶、海藻酸钠和白蛋白等亲水性材料中摸索出分子量为100000的壳聚糖。根据文献报道和初步探索的结果显示，明胶和海藻酸钠制备得到的微球粒径偏大，不利于将其嵌入多孔微球。白蛋白微粒制备条件不利于保持BMP-2和TGF-β1的生物活性。而壳聚糖可以制备得到小粒径的微粒，并具有温和的制备条件。壳聚糖分子量选取100000，分子量过小可导致药物释放加快，分子量过大导致壳聚糖溶液粘度大，不利于制备。

本发明对制备多孔微球的材料分子量为5000～300000PLGA进行筛选，优选PLGA分子量为100000，利于形成多孔微球并保持了适宜的体内降解时间。小分子量的PLGA无法形成所需孔径和粒径的多孔微球，并且体内降解时间过快，不利于骨组织工程支架的应用。大分子量的PLGA降解时间延长，不利于新生骨组织的形成。

本发明在含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒的重量百分比为1:1至5:1中寻找出最合适的配比是5:1，该比例由生长因子包封率和文献报道的生长因子起效浓度确定。在该比例时，BMP-2和TGF-β1的含量适宜细胞的增殖分化和新生骨组织的形成。

进一步地，本发明的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，可采用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽对多孔微球材料进行修饰，以增加这类材料的亲水性和细胞黏附性，如RGD肽修饰的PLGA衍生物。RGD肽可选用包括含有RGD片段的环肽或线型肽。

本发明在多孔微球的内部镶嵌含药微粒，具有双重作用：1.)避免BMP-2和TGF-β1突释，降低突释可以减轻药物的全身毒副作用；2.)可缓控释放BMP-2和TGF-β1，以提高局部组织修复疗效。

本发明同时使用两种生长因子，即BMP-2和TGF-β1，具有两方面作用：1.)减少BMP-2用量，降低成本；2.)TGF-β1促进BMP-2的生理作用，进一步提高组织修复效果。

本发明的第二方面，是提供一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂的制备方法，包括以下步骤：

A、制备含药微粒

将BMP-2和TGF-β1分别加入壳聚糖中，利用常规方法制备含药微粒，离心收集含药微粒，充分清洗，冷冻干燥；

B、制备镶嵌含药微粒的多孔复合微球

将步骤A制备的含药微粒镶嵌入多孔微球，可采用以下(a)或(b)的方法：(a)将聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于有机溶剂中，涡旋使其充分溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将步骤A制备的含药微粒加入初乳中，均质使含药微粒分散得到混悬液，将混悬液滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂；(b)将聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和步骤A制备的含药微粒加入有机溶剂中，涡旋使多孔微球材料溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将初乳滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂。

所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿等；所述的外水相采用聚乙烯醇(Polyvingakohol，PVA)溶液，浓度范围在0.05～2％(W/V)。

步骤A中的制备方法也可参考文献：KimSE,ParkJH,ChoYW,ChungH,JeongSY,LeeEB,etal.Porouschitosanscaffoldcontainingmicrospheresloadedwithtransforminggrowthfactor-beta1:implicationsforcartilagetissueengineering.Journalofcontrolledrelease:officialjournaloftheControlledReleaseSociety.2003；91:365-74。

本发明的优选方案：一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂的制备方法，该方法为：

A、制备含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球：

称取一定量分子量为100000的壳聚糖，加2％(V/V)醋酸水溶液中，涡旋使其溶解，得到浓度为4％(W/V)壳聚糖溶液，加入1mL1％(W/V)BMP-2的水溶液，混匀后滴入正辛醇(含4％司盘80，V/V)中，快速搅拌(1000～1500转/分钟)30分钟后，滴加10mL5％(W/V)三聚磷酸钠(Sodiumtripolyphosphate，TPP)进行交联反应，继续搅拌后，离心(3000～5000转/分钟)收集含BMP-2的壳聚糖微球，用异丙醇和水分别清洗3遍后冷冻干燥，得到含BMP-2的壳聚糖微球；

含TGF-β1的壳聚糖微球制备方法相同，其中1mL1％(W/V)BMP-2改为1mL0.1％(W/V)TGF-β1；

B、制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球：

称取一定量分子量为100000的聚乳酸羟基乙酸(LA:GA＝75:25)，加入二氯甲烷，涡旋使其溶解，得到6.25％(W/V)的PLGA溶液，加入1mL10％(W/V)碳酸氢铵的水溶液，用均质机快速均质(6000～8000转/分钟)得到初乳，称取40mg上述制备的含BMP-2壳聚糖微球和10mg含TGF-β1壳聚糖微球，加入初乳中，以快速均质(6000～8000转/分钟)得到混悬液，滴入0.05％(W/V)的聚乙烯醇(PVA-205S，日本Kuraray公司)水溶液，搅拌3小时(500～800转/分钟)，挥发除去二氯甲烷，离心(3000～5000转/分钟)收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

本发明的第三方面，是提供一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂在制备骨或软骨组织缺损修复材料中的应用。

所述的应用，具体是指通过注射器将所述的多孔复合微球制剂直接注射到组织缺损部位。较佳地，用于骨或软骨组织缺损治疗，多孔复合微球平均粒径100～500μm。

本发明一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，经扫描电镜图显示，多孔复合微球表面为多孔结构，壳聚糖微球形态圆整。体外释放实验结果显示，多孔复合微球制剂中的BMP-2和TGF-β1可持续释放3周以上。

裸鼠皮下异位成骨实验表明，镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的多孔复合微球形成的骨组织细胞分布更均匀，有更多的新生骨和骨小梁生成。

根据文献报道，合用BMP-2和TGF-β1可以起到更好的新骨生成作用。与不含或含TGF-β3(作用与TGF-β1相近)的成骨培养基相比，含有BMP-2和TGF-β3的成骨培养基中有更多的I型胶原(由成骨细胞分泌)和钙沉积(JKarbanováandTSoukupetal.ACTAMEDICA2010；53(2):79-84)。含有BMP-2和TGF-β3的支架可增加新骨形成，促进纤维钙化(DHaschtmannandSJFergusonetal.EurSpineJ2012；21:1724-1733)。单独使用含BMP-2的支架仍然需要达到微克级的剂量，费用较大，合用TGF-β1不仅可以降低BMP-2剂量，减少费用，而且可以显著促进骨和软骨的修复，起到更好的组织再生作用。

与普通的组织工程支架相比，本发明多孔复合微球制剂可以通过注射方式到达损伤部位，对患者造成的伤害减小，并能适应不规则的缺损，操作简单，实用性强；同时药物的突释减小，并可以根据制剂物料配比调控释放速度；也具有适合种子细胞黏附和增殖的表面孔洞和3D多孔结构，有很大的研究价值和发展前景。

本发明具有以下优点：①多孔复合微球给药系统粒的粒径在可注射范围，可直接注射到组织缺损部位，实现无创伤的组织工程修复，以满足非手术或微创治疗的需要；②多孔复合微球中镶嵌的含药微粒可缓控释放BMP-2和TGF-β1，避免药物突释，降低全身毒副作用的同时提高组织缺损部位的药物疗效；③多孔复合微球支架具有适宜孔径和孔隙率，为种子细胞增殖提供模拟体内生长所需的3D环境。

本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，所用材料均具有良好的生物相容性和生物可降解性，植入体内后可逐渐降解，对机体没有影响。异位成骨实验表明，本发明的多孔复合微球可以作为细胞黏附和增殖的良好载体，可直接注射到达靶部位，为骨和软骨组织损伤提供非手术修复的可能性，具有广阔的临床应用和市场前景。

附图说明

图1为本发明的多孔复合微球制剂的结构示意图；

其中A为PLGA多孔微球；B为含药微粒。

图2为本发明中的壳聚糖微球和PLGA多孔微球扫描电镜图；

其中A：壳聚糖微球(标尺＝20μm)；B：PLGA多孔微球(标尺＝100μm)；

图3为本发明中PLGA多孔微球粒径和表面孔径分布图和壳聚糖微球粒径分布图；

其中A:PLGA多孔微球粒径；B：PLGA多孔微球表面孔径；C：壳聚糖微球粒径。

图4为本发明镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球支架体外释放图；

其中A：BMP-2释放曲线；B：TGF-β1释放曲线。

图5为本发明镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球支架裸鼠皮下异位成骨的新生骨图；

其中1：空白组；2：空白复合微球支架组；3：含TGF-β1复合微球支架组；4：含BMP-2复合微球支架；5：含BMP-2和TGF-β1复合微球支架组。

图6为本发明中镶嵌含BMP-2壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球裸鼠皮下异位成骨的新生骨重量图；

其中1：空白组；2：空白复合微球支架组；3：含TGF-β1复合微球支架组；4：含BMP-2复合微球支架组；5：含BMP-2和TGF-β1复合微球支架组。图7为本发明镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球裸鼠皮下异位成骨的新生骨切片苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining，HEstaining)图；

其中1：空白组；2：空白复合微球支架组；3：含TGF-β1复合微球支架组；4：含BMP-2复合微球支架组；5：含BMP-2和TGF-β1复合微球支架组。

图8为本发明镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球裸鼠皮下异位成骨马松染色(Massonstaining)图。

其中1：空白组；2：空白复合微球支架组；3：含TGF-β1复合微球支架组；4：含BMP-2复合微球支架组；5：含BMP-2和TGF-β1复合微球支架组。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1：制备含骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)壳聚糖微球和转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)壳聚糖微球的聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid，PLGA)多孔复合微球

A、制备含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球：

根据文献报道(KimSE,ParkJH,ChoYW,ChungH,JeongSY,LeeEB,etal.Porouschitosanscaffoldcontainingmicrospheresloadedwithtransforminggrowthfactor-beta1:implicationsforcartilagetissueengineering.Journalofcontrolledrelease:officialjournaloftheControlledReleaseSociety.2003；91:365-74)，采用如下方法制备：称取120mg壳聚糖(分子量100000，浙江金壳生物化学有限公司)，加入3mL2％(V/V)醋酸水溶液中，涡旋使其溶解后，加入1mL1％(W/V)BMP-2(美国Peprotech公司)的水溶液，混匀后滴入90mL正辛醇(含4％司盘80，V/V)中，1200转/分钟搅拌30分钟后，滴加10mL5％(W/V)三聚磷酸钠(Sodiumtripolyphosphate，TPP，美国Amresco公司)进行交联反应，继续搅拌1小时后，3000转/分钟离心收集含BMP-2的壳聚糖微球，用异丙醇和水清洗3遍后冷冻干燥，得到含BMP-2的壳聚糖微球。

含TGF-β1的壳聚糖微球制备方法相同，其中1mL1％(W/V)BMP-2改为1mL0.1％(W/V)TGF-β1(美国Peprotech公司)。

B、制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球：

称取200mg聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，分子量100000，LA:GA＝75:25，德国BoehringerIngelheim公司)，加入3.2mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，称取50mg上述制备的含BMP-2壳聚糖微球和10mg含TGF-β1壳聚糖微球，加入初乳中，以8000转/分钟的速度均质0.5分钟得到混悬液，滴入120mL0.05％(W/V)的聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，PVA-205S，日本Kuraray公司)水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

实施例2：镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的形态观察

取一定量的实施例1中制备得到的含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球，及含壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球，置于粘有双面胶的样品板上，镀金后在扫描电镜(ZESSMA10，德国)下观察，得到壳聚糖微球(图2A，标尺为20μm)和含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球(图2B，标尺为100μm)的形态。

壳聚糖微球形态圆整，表面光滑，如图2A所示。PLGA多孔微球形态圆整，表面随机分布着大量孔洞，如图2B所示。

实施例3：镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的粒径测定

将实施例1制备的镶嵌含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球分散在去离子水中，用马尔文Masersizer2000测定其粒径(图3A)。在多孔微球的扫描电镜照片上随机选取3个微球，测量其表面孔径(孔径<5μm的忽略不计)，取平均值，孔径分布图如图3B所示。在含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球的扫描电镜照片上量取微球的粒径，取平均值(图3C)。

如图3A所示，镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的平均粒径为345.16±11.00μm。如图3B所示，表面平均孔径28.30±6.55μm。如图3C所示，壳聚糖微球的平均粒径是15.50±7.03μm，大部分壳聚糖微球粒径小于25μm。

实施例4：镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的体外释放实验

取20mg实施例1制备的镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球，加入1.5mLPBS(pH7.4)，于1、4、7、10、13、16、19和22天时，用移液枪吸出全部液体，并补充新的释放液。所有取出的液体用Elisa试剂盒测定，计算本发明多孔复合微球的BMP-2和TGF-β1释放百分率，实验平行三份，取平均值，制作释放曲线。

结果显示，镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球，BMP-2首日释放12.3±5.84％，22天累积释放79.6±4.1％(图4A)，TGF-β1首日释放15.8±4.83％，22天累积释放86.3±4.6％(图4A)。

实施例5：镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的RGD肽修饰PLGA多孔复合微球的制备

取200mg氨基和马来酰亚胺基双官能团修饰的聚乙二醇(NH2-PEG-Mal，分子量3500，北京键凯科技有限公司)和20mg甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys，GRGDSPC，分子量691.35，上海生工生物工程有限公司)，溶于4mLPBS(pH7.4)中，涡旋混匀后静置30min，反应得到PEG-GRGDSPC。取1gPLGA(分子量34000，LA:GA＝50:50，德国BoehringerIngelheim公司)溶于20mL二甲亚砜中，加入30mg乙基(3-二甲基胺基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC，上海阿拉丁试剂有限公司)和20mgN-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS，上海阿拉丁试剂有限公司)，反应4小时后加入PEG-GRGDSPC，继续反应2小时后透析24小时除去杂质，冷冻干燥得到PLGA-PEG-GRGDSPC。

称取40mg上述制备的PLGA-PEG-GRGDSPC和160mgPLGA(分子量100000，德国BoehringerIngelheim公司)作为制备多孔微球的材料，其它步骤同实施例1。

实施例6：镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的裸鼠皮下异位成骨实验

本实验分为5组：空白组(兔骨髓间充质干细胞，BMSCs)；空白微球和BMSCs组；镶嵌含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球组和BMSCs；镶嵌含BMP-2壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球组和BMSCs；镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球和BMSCs组。在裸鼠皮下注射200μL上述各组的细胞或微球悬液。于2周时，取出新骨，称重，在4％多聚甲醛中固定24小时，脱水并用石蜡包埋后，进行HE和Masson染色。

图5所示为自裸鼠皮下取出的异位骨。图6显示，镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的新生骨重量最大，与空白支架组和含TGF-β1多孔复合微球有显著差异。HE染色(图7)和Masson染色(图8)显示，空白组和空白微球组的新生骨形态均不好，含TGF-β1复合支架组的新生骨内部逐渐形成早期的骨组织，但总体成骨较少，而含BMP-2复合支架组在表层形成了较厚的类骨质，但内部支架之间没有形成新骨，含BMP-2和TGF-β1复合支架组同时促进了表层和内部的类骨质形成。在含BMP-2复合支架组和含BMP-2和TGF-β1复合支架组中的壳聚糖微球由原来圆整的形态改变为不规则形态，表明由于细胞生长旺盛，导致其迅速降解。

实施例7：制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1海藻酸钠微球的PLGA多孔复合微球

A、制备含BMP-2和TGF-β1海藻酸钠微球：

采用如下方法制备：称取90mg海藻酸钠，加入3mL水中充分溶解，加入1mL0.1％(W/V)BMP-2溶液或1mL0.01％(W/V)TGF-β1，混匀后滴入30ml4％(W/V)的氯化钙溶液中，1000转/分钟搅拌1小时，最后3000转/分钟离心收集微球，用去离子水充分清洗，冷冻干燥。

B、制备含BMP-2和TGF-β1海藻酸钠微球的PLGA多孔复合微球：

称取150mgPLGA(分子量150000，LA:GA＝75:25，德国BoehringerIngelheim公司)和40mg上述制备的含BMP-2海藻酸钠微球和20mg含TGF-β1海藻酸钠微球，加入3mL乙酸乙酯，涡旋使PLGA溶解后，加入1mL50mg/mLBSA的水溶液作为致孔剂，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，滴入120mL0.5％(W/V)的聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，PVA-205S，日本Kuraray公司)水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

结果显示，制备得到的海藻酸钠微球粒径大(平均粒径大于80μm)，体外释放快(1天内释放80％以上)。

实施例8：制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1明胶微球的PLGA多孔复合微球

A、制备含BMP-2和TGF-β1明胶微球：

采用如下方法制备：称取150mg明胶(上海鲁博明胶有限公司)，加入5mL水中，加热至50℃溶解后，滴入到200mL液体石蜡(含2％司盘80，V/V)中，800转/分钟搅拌30分钟后，加入5mL甲醛，继续搅拌1h后5000转/分钟离心收集微球，用丙酮和去离子水充分清洗3遍，冷冻干燥得到明胶微球。取20mg明胶微球，加入1mL0.1％(W/V)BMP-2溶液或1mL0.001％(W/V)TGF-β1溶液，于4℃孵育6小时，离心去除上清，冷冻干燥后得到含BMP-2或TGF-β1明胶微球。

B、制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1明胶微球的PLGA多孔复合微球：

称取100mgPLGA(分子量50000，LA:GA＝75:25，德国BoehringerIngelheim公司)，加入2mL氯仿，涡旋使其溶解后，加入0.5mL100mg/mL碳酸氢钠的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入30mg上述制备的含BMP-2明胶微球和30mg含TGF-β1明胶微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入100mL1％(W/V)的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

结果显示，制备得到的明胶微球粒径大(平均粒径大于80μm)，体外释放快(1天内释放70％以上)。

实施例9：制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1白蛋白微球的PLGA多孔复合微球

A、制备含BMP-2和TGF-β1白蛋白微球：

采用如下方法制备：将250mg人血清白蛋白加入4mL水中溶胀，滴入1000转/分钟搅拌的100mL蓖麻油中，乳化5分钟后滴入已预热至130℃的蓖麻油中，固化10分钟后冷却至室温，加入乙醚，5000转/分钟离心除去上清，反复5次，真空干燥得到空白白蛋白微球。取20mg空白白蛋白微球，加入1mL0.1％(W/V)BMP-2溶液或1mL0.01％(W/V)TGF-β1溶液，于4℃孵育6小时，5000转/分钟离心去除上清，冷冻干燥后得到含BMP-2白蛋白微球。

B、制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1白蛋白微球的PLGA多孔复合微球：

称取100mgPLGA(分子量100000，LA:GA＝75:25，德国BoehringerIngelheim公司)和40mg上述制备的含BMP-2白蛋白微球和15mg上述制备的含TGF-β1白蛋白微球，加入3mL乙酸乙酯，涡旋使PLGA溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，得到的混悬液滴入200mL0.5％(W/V)的PVA水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去乙酸乙酯，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

结果显示，制备得到的白蛋白微球粒径大(平均粒径大于80μm)，体外释放快(1天内释放80％以上)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，它是由多孔微球和镶嵌在多孔微球中的含药微粒组成；所述的多孔微球的平均粒径为为100～500μm，平均孔径为20～30μm；所述的含药微粒的平均粒径为200nm～30μm；

所述的含药微粒为分别独立地含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒，所含的药物BMP-2或TGF-β1分别占含药微粒的0.01～10％W/W，且含BMP-2微粒和含TGF-β1微粒的重量百分比为5:1；

所述的含药微粒，用于含药微粒制备的材料为分子量为100000的壳聚糖，壳聚糖的用量占含药微粒重量百分比为90～99.99％W/W；

所述的含药微粒占多孔复合微球制剂总体组成的2～50％(W/W)；

所述的多孔微球，用于制备多孔微球的材料为PLGA。

2.根据权利要求1所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，所述的多孔微球，采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1W/W；所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成的50～98％W/W。

3.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，PLGA分子量的为5000～300000。

4.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，PLGA分子量的为100000。

5.根据权利要求2所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，所述的致孔剂，为碳酸氢盐、碳酸盐、双氧水、白蛋白，或环糊精；用量与多孔微球材料比例为1:10～1:1W/W。

6.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂，其特征在于，采用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽对多孔微球材料进行修饰。

7.一种如权利要求1所述的可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、制备含药微粒

将BMP-2和TGF-β1分别加入壳聚糖中，利用常规方法制备含药微粒，离心收集含药微粒，充分清洗，冷冻干燥；

B、制备镶嵌含药微粒的多孔复合微球

将步骤A制备的含药微粒镶嵌入多孔微球，可采用以下(a)或(b)的方法：(a)将聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于有机溶剂中，涡旋使其充分溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将步骤A制备的含药微粒加入初乳中，均质使含药微粒分散得到混悬液，将混悬液滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂；(b)将聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和步骤A制备的含药微粒加入有机溶剂中，涡旋使多孔微球材料溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将初乳滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂。

8.根据权利要求7所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿；所述的外水相采用聚乙烯醇溶液，浓度范围在0.05～2％W/V。

9.根据权利要求7所述的一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，该方法为：

A、制备含BMP-2或TGF-β1壳聚糖微球：

称取一定量分子量为100000的壳聚糖，加2％V/V醋酸水溶液中，涡旋使其溶解，得到浓度为4％W/V壳聚糖溶液，加入1mL1％W/VBMP-2的水溶液，混匀后滴入含4％V/V司盘80的正辛醇中，1000～1500转/分钟快速搅拌30分钟后，滴加10mL5％W/V三聚磷酸钠进行交联反应，继续搅拌后，3000～5000转/分钟离心收集含BMP-2的壳聚糖微球，用异丙醇和水分别清洗3遍后冷冻干燥，得到含BMP-2的壳聚糖微球；

含TGF-β1的壳聚糖微球制备方法相同，其中1mL1％W/VBMP-2改为1mL0.1％W/VTGF-β1；

B、制备镶嵌含BMP-2和TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球：

称取一定量分子量为100000的聚乳酸羟基乙酸，LA:GA＝75:25；加入二氯甲烷，涡旋使其溶解，得到6.25％W/V的PLGA溶液，加入1mL10％W/V碳酸氢铵的水溶液，用均质机6000～8000转/分钟快速均质得到初乳，称取40mg上述制备的含BMP-2壳聚糖微球和10mg含TGF-β1壳聚糖微球，加入初乳中，以6000～8000转/分钟快速均质得到混悬液，滴入0.05％W/V的聚乙烯醇PVA-205S水溶液，500～800转/分钟搅拌3小时，挥发除去二氯甲烷，3000～5000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。

10.一种如权利要求1所述的可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂在制备骨或软骨组织缺损修复材料中的应用。