CN103495205B - 一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域。本发明提供了一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，是以壳聚糖、胶原或白蛋白等亲水性材料包裹多肽、蛋白类药物或化学药物形成载药微粒，再用含药微粒和多孔微球材料同时构建具有3D多孔结构的微球，并将含药微粒镶嵌在多孔微球的内部。本发明还提供了上述多孔复合微球制剂的制备方法，以及在制备组织缺损修复材料中的应用。本发明的多孔复合微球制剂不仅能实现药物缓慢释放，而且有利于种子细胞的增殖和分化。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法。
背景技术
由创伤和病理等因素造成的组织损伤对临床医生来说是一项巨大的挑战，常规手术治疗往往给患者带来难忍的疼痛，治疗效果也难以预测，常不能形成良好的新生组织。利用组织工程学，采用可降解聚合物材料制成组织工程支架以修复组织损伤是近年来的研究热点。组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与技术，研究用于修复、维护和促进人体组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的学科。随着无创伤和微创等非手术治疗方式的需要，研制兼具可注射、持续释放细胞生长因子、三维多孔结构的细胞支架成为组织工程发展的重要方向之一。
根据支架植入机体的方式，固体型组织工程支架主要可分为两大类：①可注射型，以微球体为主，既具有一定的力学强度，又具有良好的可流动性，包括两种：(A)载生长因子或化学药物的聚合物微球（没有多孔结构），能很好地控制药物释放，但没有多孔结构不利于种子细胞在支架上的黏附，也不能提供细胞生长所需的3D空间；(B)多孔微球，能增大微球的表面积以利于细胞附着，并提供细胞在体外生物反应器或体内增殖分化的3D空间，但是不含或无法控释生长因子或化学药物；②非注射型，即通过手术植入的支架，预先或使用前整合了生长因子或化学药物的多孔支架（或纳米纤维状支架），形状多为薄膜状、片状、块状等，由于体积较大且有一定刚性，因此必须通过手术才能植入。
另外，还有一类可注射的半固体水凝胶类的“软支架”，如壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白，泊洛沙姆凝胶等，其优点是在室温下具有流动性，注射入体内后凝固成型。但是，凝胶中的生长因子或化学药物释放过快，不利于种子细胞的增殖分化。为此，有研究将生长因子或化学药物用高分子材料制备成微球或纳米粒后再并入凝胶，从而达到缓释药物的目的。但是，含药微球与凝胶的复合物依然有诸多缺点：无法作为细胞体外扩增的载体；体内凝胶化时间和支架形状难以控制；凝胶力学强度差，孔隙结构难以控制，容易导致细胞泄漏并不利于增殖。因此，凝胶类可注射组织工程支架在应用上受到了一定的限制。
聚乳酸羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）由于具有良好的组织相容性和生物可降解性而广泛用于组织工程支架。多孔微球由于既可以注射，又具有一定的力学强度，高分子材料可生物降解，3D多孔支架还可以作为细胞扩增载体，是一种优良的注射型组织工程支架。但是，多孔结构又会导致生长因子或化学药物的突释，这一矛盾需要解决。例如：中国专利申请CN200810044593.6，发明名称为“一种可降解聚合物多孔微球的制备方法及其用途”，公开号为CN101249077，公开了一种可降解聚合物多孔微球的制备方法，制备得到的多孔微球采用吸附法使药物进入微球的多孔结构，但缺点在于吸附的药物快速释放。又如：中国专利CN200810161673.X，发明名称为“一种亲水性药物双重微球制剂及其制备方法”，公开号为CN101366700，公开了一种亲水性药物双重微球制剂的制备方法，是先制备亲水性药物的壳聚糖纳米粒，再将制备得到的纳米粒分散至PLGA的乙腈或二氯甲烷溶液中，制得双重微球制剂，该双重微球制剂是将含药壳聚糖纳米粒分散在PLGA微球内部，优点是保持了壳聚糖纳米粒对亲水性药物具有的高包封效率，体外释放缓慢，达到了药物缓释的目的，缺点在于该微球无3D多孔结构，不利于种子细胞黏附和增殖。
目前尚无文献报道一种既具有3D多孔结构有利于种子细胞附着和生长的、又含有可缓释控释药物，并可用于注射的多孔微球制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既具有3D多孔结构有利于种子细胞附着和生长的、又含有可缓释控释药物，并可用于注射的，内部镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂。本发明的另一个目的是提供该多孔复合微球制剂的制备方法。本发明的第三个目的是提供该多孔微球复合制剂在制备组织缺损修复材料中的应用。
本发明的主要技术方案是提供一种内部镶嵌含药微粒的具有3D多孔结构的复合微球，具体是首先以壳聚糖、胶原或白蛋白等亲水性材料包裹多肽、蛋白类药物或化学药物形成含药微粒，再用含药微粒和多孔微球材料同时构建具有3D多孔结构的微球，并将含药微粒镶嵌在多孔微球的内部，不仅能实现药物缓慢释放，而且有利于种子细胞的增殖和分化。
本发明的第一方面，是提供一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，由多孔微球和镶嵌在多孔微球中的含药微粒组成；所述的多孔微球的平均粒径为100～800μm，平均孔径为5～50μm；所述的含药微粒的平均粒径为50nm～100μm。较佳地，所述的多孔微球的平均粒径为100～500μm，平均孔径为20～30μm；所述的含药微粒的平均粒径为200nm～30μm。
所述的含药微粒，用于含药微粒制备的材料为不溶于二氯甲烷等有机溶剂的亲水性高分子材料，可选用壳聚糖、海藻酸钠、明胶、白蛋白等中的一种或两种以上。含药的材料的用量占含药微粒重量百分比为90～99.99%。
所述的含药微粒占多孔复合微球制剂总体组成（多孔微球+含药微粒）的2～50%（W/W）。
较佳地，用于含药的材料为壳聚糖，用量占含药微粒重量百分比为90～99.99%。
较佳地，用于含药的材料为白蛋白，用量占含药微粒重量百分比为90～99.99%。
较佳地，用于含药的材料为壳聚糖和明胶的组合，用量占含药微粒重量百分比为90～99.99%，壳聚糖和明胶的比例为1:10～10:1（W/W），优选比例为3:2～4:1（W/W）。
所述的多孔微球，具有为种子细胞增殖提供模拟体内生长所需的3D空间，用于制备多孔微球的材料可选用聚乳酸羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA）、聚乳酸（Polylactic acid，PLA）、聚羟基乙酸（Polyglycolic acid，PGA）、聚几内酯（Polycaprolactone，PCL）等中的一种或两种以上，并且采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1（W/W）。
所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成（多孔微球+含药微粒）的50～98%（W/W）。
较佳地，用于制备多孔微球的材料可选用聚乳酸羟基乙酸（PLGA），分子量为5000～300000。PLGA分子量的优选方案为80000～200000。PLGA分子量的优选方案为100000。
较佳地，用于制备多孔微球的材料可选用聚乳酸（PLA），分子量为60000～95000。
较佳地，用于制备多孔微球的材料可选用聚乳酸羟基乙酸（PLGA）和聚羟基乙酸（PGA）的组合，PLGA和PGA的质量比为1:9～9:1，PLGA的分子量为5000～300000，PGA的分子量为5000～300000。PLGA分子量的优选方案为80000～200000，PGA分子量的优选方案为20000～50000。
所述的致孔剂，包括碳酸氢盐、碳酸盐、双氧水、白蛋白和环糊精等，碳酸氢盐包括碳酸氢铵、碳酸氢钠等，碳酸盐包括碳酸锌、碳酸镁等，可选用其中的一种或多种，用量与多孔微球材料比例为1:10～1:1（W/W）。较佳地，致孔剂可选用碳酸氢铵，和制备多孔微球的材料的重量比为1:4～1:1（W/W）。
进一步地，本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，可采用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽对多孔微球材料进行修饰，以增加这类材料的亲水性和细胞黏附性，如RGD肽修饰的PLGA衍生物和PLA衍生物等。RGD肽可选用包括含有RGD片段的环肽或线型肽。
进一步地，本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，所述的含药微粒中的药物，最好具有促进细胞增殖和分化的作用，可选用多肽、蛋白类药物或化学药物等。其中，多肽蛋白类药物可选用骨形态发生蛋白（Bonemorphogenetic proteins，BMPs）、转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），胰岛素（Insulin），鲑鱼降钙素（Salmon calcitonin）等；化学药物可选用地塞米松和淫羊藿苷等。所述的含药微粒中的药物可选用其中的一种或两种以上。药物占含药微粒的0.01～10%（W/W）。
本发明在多孔微球的内部镶嵌含药微粒，具有双重作用：1.）避免生长因子或化学药物突释，降低突释可以降低药物的全身毒副作用；2.）可缓控释放生长因子或化学药物，以提高局部组织修复疗效。
本发明的第二方面，是提供一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
A、制备含药微粒
将药物加入亲水性高分子材料中，利用常规方法制备含药微粒，离心收集含药微粒，充分清洗，冷冻干燥；
B、制备镶嵌含药微粒的多孔复合微球
将步骤A制备的含药微粒镶嵌入多孔微球，可采用以下（a）或（b）的方法：（a）将制备多孔微球的材料溶于有机溶剂中，涡旋使其充分溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将步骤A制备的含药微粒加入初乳中，均质使含药微粒分散得到混悬液，将混悬液滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂；（b）将制备多孔微球的材料和步骤A制备的含药微粒加入有机溶剂中，涡旋使多孔微球材料溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将初乳滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂。
步骤A中，所述的含药微粒，用于含药微粒制备的材料为不溶于二氯甲烷等有机溶剂的亲水性高分子材料（亲水性含药材料），可选用壳聚糖、海藻酸钠、明胶、白蛋白等中的一种或两种以上。制备含药微粒的材料的用量占含药微粒重量百分比为90～99.99%。
亲水性含药材料为壳聚糖时，制备方法可参考文献：Kim SE,Park JH,ChoYW,Chung H,Jeong SY,Lee EB,et al.Porous chitosan scaffold containingmicrospheres loaded with transforming growth factor-beta1:implications forcartilage tissue engineering.Journal of controlled release:official journal of theControlled Release Society.2003;91:365-74。
亲水性含药材料为海藻酸钠时，制备方法可参考文献：单连海,郭海霞,张志斌.海藻酸钠微球的制备及对BSA控制释放的实验.重庆理工大学学报.2010;24(9):34-37。
亲水性含药材料为明胶时，制备方法可参考文献：肖玉鸿,吴红,刘宏伟,陈书军,李飞,吴道澄.rhBMP-2明胶微球的制备及对人牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性影响.第四军医大学学报.2005;26(9):799-801。
亲水性含药材料为白蛋白时，制备方法可参考文献：李艺,谭群友,柳珊,徐美玲,赵春景,张景勍.溴吡斯的明白蛋白微球的制备.中国医院药学杂志.2011;31(19):1567-1570。
步骤B中，所述的含药微粒占多孔复合微球制剂总体组成（多孔微球+含药微粒）的2～50%（W/W）。所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成（多孔微球+含药微粒）的50～98%（W/W）。
用于制备多孔微球的材料可选用聚乳酸羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA）、聚乳酸（Polylactic acid，PLA）、聚羟基乙酸（Polyglycolic acid，PGA）、聚几内酯（Polycaprolactone，PCL）等中的一种或两种以上，并且采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1（W/W）。
较佳地，用于制备多孔微球的材料可选用分子量为100000的PLGA；或者分子量为100000的PLGA和10000的PGA的组合，较佳地，PLGA和PGA的质量比为9:1～7:3；
所述的致孔剂，较佳地，选用碳酸氢铵，浓度以50-200mg/mL为佳，且致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1（W/W），并以1:4～1:1为佳。
步骤B中制备多孔微球的材料为聚乳酸羟基乙酸（PLGA）时，最佳的制备方法为：称取200mg PLGA（分子量100000，LA:GA=75:25），加入3.2mL二氯甲烷，溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以4000～10000转/分钟的速度均质，其中加入20mg含药微粒，均质后滴入120mL0.05%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌1～5小时，挥发出去二氯甲烷，3000～6000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗后，将多孔微球冷冻干燥。
制备多孔微球的材为PLGA和PGA时，最佳的制备方法为：称取150mgPLGA（分子量100000，LA:GA=75:25）和50mg PGA（分子量10000），加入3.2mL二氯甲烷，溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机均质(4000～10000转/分钟)，其中加入20mg含药微粒，均质后滴入120mL0.05%（W/V）的PVA水溶液，搅拌(400～800转/分钟)1～5小时，挥发除去二氯甲烷，离心(3000～6000转/分钟)收集微球，用去离子水清洗后，将多孔微球冷冻干燥。
所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿等；所述的外水相采用聚乙烯醇（Polyving akohol，PVA）溶液，浓度范围在0.05～2%（W/V）。
本发明的第三方面，是提供一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用。
所述的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用，具体是指用于制备骨或软骨组织缺损修复材料。
所述的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用，具体是指用于制备心肌组织缺损或脑组织缺损修复材料。
所述的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用，具体是指通过注射器将所述的多孔复合微球制剂直接注射到组织缺损部位。较佳地，用于骨或软骨组织缺损治疗，多孔复合微球平均粒径100～500μm。较佳地，用于心肌部位缺损注射，多孔复合微球平均粒径100～300μm。较佳地，用于脑组织缺损注射，多孔复合微球平均粒径150～300μm。
本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，经扫描电镜图和激光共聚焦显微镜图显示，多孔复合微球表面和内部均为多孔结构，壳聚糖微球镶嵌在多孔微球内部。
经体外药物释放实验表明，壳聚糖微可缓慢释放9天以上，而本发明的多孔复合微球制剂可缓释2周以上。
体外细胞活性实验表明，本发明的多孔复合微球表面比普通微球更加有利于细胞的黏附和增殖。
与普通的组织工程支架需手术置入相比，本发明多孔复合微球制剂可以通过注射方式到达损伤部位，对患者造成的伤害减小，并能适应不规则的缺损，操作简单，实用性强；同时药物的突释减小，并可以根据制剂物料配比调控释放；也具有适合种子细胞黏附和增殖的表面孔洞和3D多孔结构，有很大的研究价值和发展前景。
本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，由载多肽、蛋白类药物或化学药物的微粒（纳米粒或微球）和多孔微球组成，含药微粒镶嵌在多孔微球的内部。本发明具有以下优点：①多孔复合微球给药系统粒的粒径在可注射范围，可直接注射到组织缺损部位，实现无创伤的组织工程修复，以满足非手术或微创治疗的需要；②多孔复合微球中镶嵌的含药微粒可缓控释放多种生长因子等药物，避免药物突释，降低全身毒副作用的同时提高组织缺损部位的药物疗效；③多孔复合微球支架具有适宜孔径和孔隙率，为种子细胞增殖提供模拟体内生长所需的3D环境。
本发明的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，所用材料均具有良好的生物相容性和生物可降解性，植入体内后可逐渐降解，对机体没有影响。体外细胞实验表明，本发明的多孔复合微球可以作为细胞黏附和增殖的良好载体，可直接注射到组织缺损部位，为组织损伤提供非手术修复的可能性，具有广阔的临床应用和市场前景。
附图说明
图1为本发明的多孔复合微球制剂的结构示意图；
其中A为亲脂性非极性材料制备得到的多孔微球；B为含药微粒。
图2为本发明中的壳聚糖微球和PLGA多孔微球扫描电镜图；
其中A：壳聚糖微球（标尺=50μm）；B：壳聚糖微球局部放大图（标尺=5μm）；C：PLGA多孔微球（标尺=100μm）；D：PLGA多孔微球截面图（标尺=100μm）。
图3为本发明中镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的扫描电镜图（标尺=10μm）；其中箭头所示为壳聚糖微球。
图4为本发明中PLGA多孔微球粒径和表面孔径分布图和壳聚糖微球粒径分布图；
其中A：PLGA多孔微球粒径；B：PLGA多孔微球表面孔径；C：壳聚糖微球粒径。
图5为本发明中含BSA壳聚糖微球体外释放图；
图6为本发明镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球体外释放图；
图7为本发明镶嵌壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球体外细胞活性实验图；
其中黑色为无修饰的多孔微球，白色为GRGDSPC肽修饰的多孔微球。
图8为本发明中PLGA多孔微球和细胞共培养的激光共聚焦显微镜图；
其中A：镶嵌壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球；B：镶嵌壳聚糖微球的GRGDSPC修饰PLGA多孔复合微球（标尺=75μm）。白色箭头所示为细胞；
图9为本发明中含TGF-β1壳聚糖微球体外释放图；
图10为本发明镶嵌含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球体外释放图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：制备含模型药物牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球
A、制备含BSA壳聚糖微球：
根据文献报道（Kim SE,Park JH,Cho YW,Chung H,Jeong SY,Lee EB,et al.Porous chitosan scaffold containing microspheres loaded with transforming growthfactor-beta1:implications for cartilage tissue engineering.Journal of controlledrelease:official journal of the Controlled Release Society.2003;91:365-74），采用如下方法制备：称取120mg壳聚糖（分子量100000，浙江金壳生物化学有限公司），加入3mL2%（V/V）醋酸水溶液中，涡旋使其溶解后，加入1mL0.5%（W/V）模型药物牛血清白蛋白（美国Amresco公司）的水溶液，混匀后滴入90mL正辛醇（含4%司盘80，V/V）中，1200转/分钟搅拌30分钟后，滴加10mL5%（W/V）三聚磷酸钠（Sodium tripolyphosphate，TPP，美国Amresco公司）进行交联反应，继续搅拌1小时后，3000转/分钟离心收集含BSA的壳聚糖微球，用异丙醇和水清洗3遍后冷冻干燥，得到含BSA的壳聚糖微球。同时制备了含异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的BSA（FITC-BSA）壳聚糖微球。
B、制备镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球：
称取200mg聚乳酸羟基乙酸（Poly(lactic-co-glycolic acid)，分子量100000，LA:GA=75:25，德国Boehringer Ingelheim公司），加入3.2mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，称取20mg上述制备的含BSA壳聚糖微球加入初乳中，以8000转/分钟的速度均质0.5分钟得到混悬液，滴入120mL0.05%（W/V）的聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA-205S，日本Kuraray公司）水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例2：镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的形态观察
取一定量的实施例1中制备得到的含BSA壳聚糖微球和含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔微球，置于粘有双面胶的样品板上，镀金后在扫描电镜（ZESSMA10，德国）下观察，得到壳聚糖微球（图2A、B，标尺分别为50μm和5μm）和含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球（图2C、D，标尺100μm）的形态以及壳聚糖微球在多孔微球中的分布状态图（图2，标尺10μm）。
壳聚糖微球形态圆整，表面光滑，如图所示2A、B。PLGA多孔微球形态圆整，表面随机分布着大量孔洞，如图2C所示。多孔微球内部是相互连通的多孔结构，如图2D所示。如图3所示，壳聚糖微球镶嵌在多孔微球内壁的表面或内部（白色箭头所示），保持了圆整的结构和光滑的表面。
实施例3：镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的粒径测定
将实施例1制备的镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球分散在去离子水中，用马尔文Masersizer2000测定其粒径（图4A）。在多孔微球的扫描电镜照片上随机选取3个微球，测量其表面孔径（孔径<5μm的忽略不计），取平均值，孔径分布图如图4B所示。在含BSA壳聚糖微球的扫描电镜照片上量取微球的粒径，取平均值（图4C）。
如图4A所示，镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的平均粒径为353.32±35.24μm。如图4B所示，表面平均孔径为20.34±10.04μm。如图4C所示，壳聚糖微球的平均粒径是19.84±7.26μm，大部分壳聚糖微球粒径小于25μm。
实施例4：镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的体外释放实验
取20mg实施例1中制备的含FITC-BSA壳聚糖微球，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），于1、2、3、4、5、6、7、8和9天时，3000转/分钟离心5分钟，吸取全部上清，用高效液相色谱仪连接荧光检测器测定，同时补充新的释放液。取20mg实施例1制备的镶嵌含BSA壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球，加入1.5ml PBS（pH7.4），于1、2、3、4、5、6、7、11、15和19天时，用移液枪吸出全部液体，并补充新的释放液。所有取出的液体用Bradford（Coomassie Plus Assay Kit，美国Pierce公司）测定，计算出壳聚糖微球和本发明多孔复合微球的BSA释放百分率，实验平行三份，取平均值，制作释放曲线，结果见图5和图6。
如图5所示，壳聚糖微球首日释放19.69±0.74%，9天累积释放74.73±1.92%，而本发明的制剂可缓释23天以上，首日释放10.87±0.87%，23天累积释放62.09±2.54%（图6）。
实施例5：镶嵌含BSA壳聚糖微球的RGD肽修饰PLGA多孔复合微球的制备
取200mg氨基和马来酰亚胺基双官能团修饰的聚乙二醇（NH2-PEG-Mal，分子量3500，北京键凯科技有限公司）和20mg甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys，GRGDSPC，分子量691.35，上海生工生物工程有限公司），溶于4ml PBS（pH7.4）中，涡旋混匀后静置30分钟，反应得到PEG-GRGDSPC。取1g PLGA（分子量34000，LA:GA=50:50，德国Boehringer Ingelheim公司）溶于20mL二甲亚砜中，加入30mg乙基(3-二甲基胺基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（1-Ethyl-3-[3-dimethyla分钟opropyl]carbodiimide，EDC，上海阿拉丁试剂有限公司）和20mg N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxy succinimide，NHS，上海阿拉丁试剂有限公司），反应4h后加入PEG-GRGDSPC，继续反应2h后透析24h除去杂质，冷冻干燥得到PLGA-PEG-GRGDSPC。
称取40mg上述制备的PLGA-PEG-GRGDSPC和160mg PLGA（分子量100000，德国Boehringer Ingelheim公司）作为制备多孔微球的材料，其它步骤同实施例1。
实施例6：镶嵌含BSA壳聚糖微球的RGD肽修饰PLGA多孔复合微球的体外细胞实验
本实验分成2组，分别为实施例1制备得到的无RGD稀释的多孔复合微球和实施例5制备得到的RGD修饰的多孔复合微球，每份微球10mg，经60Co射线辐照灭菌后（8kGy，8h），将微球移入24孔细胞培养板，加入DMEM培养基平衡2h，同时用紫外灭菌。采用人骨肉瘤细胞作为模型细胞，将50μl2×105cells/ml接种到多孔复合微球上，每隔2天换液，于1、4和7天，用噻唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT，美国sigma公司）法考察细胞活性，用酶标仪测定492nm波长处吸光度值。各组作平行五个孔，取吸光度平均值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，实验结果见图7。取培养了1天的多孔复合微球，加入50μl2mg/ml荧光二乙酯，37℃孵育15分钟后，用PBS洗3遍，移入直径3.5cm的塑料培养皿中，在激光共聚焦显微镜下观察，结果见图8。
如图7所示，第1天时，GRGDSPC肽修饰的多孔复合微球比未修饰的微球有更多的细胞黏附（p<0.01）。第4天和7天时，两种微球中的细胞数目都明显增加，但与未修饰的多孔复合微球相比，GRGDSPC肽修饰的多孔微球上有更多的细胞生长（p<0.01）。如图8所示，在激光共聚焦显微镜下观察，细胞被染为绿色（白色箭头所示），在GRGDSPC肽修饰的多孔复合微球上有更多的细胞分布。
实施例7：制备镶嵌含转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球
方法同实施例1，其中1mL0.5%（W/V）BSA用1mL200ng/mL TGF-β1（美国Peprotech公司）代替。致孔剂为1mL200mg/mL碳酸氢铵。
实施例8：镶嵌含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球的体外释放实验
取20mg实施例7制备的含TGF-β1壳聚糖微球，加入1ml PBS（pH7.4），于1、2、3、4、5、6、7、8和9天时，3000转/分钟离心5分钟，吸取全部上清，并补充新的释放液。取20mg实施例7制备的镶嵌含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球，加入1.5ml PBS（pH7.4），于1、4、7、10和14天时，用移液枪吸出全部液体，并补充新的释放液。所有取出的液体用Elisa试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）测定，计算出壳聚糖微球和本发明多孔复合微球的TGF-β1释放百分率，实验平行三份，取平均值，制作释放曲线，结果见图9和图10。
如图9所示，含TGF-β1壳聚糖微球首日释放397pg，9天累积释放901pg，而镶嵌含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球可缓释2周以上，首日释放77pg，14天累积释放318pg（图10）。
实施例9：制备镶嵌含骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球
方法同实施例1，其中1mL0.5%（W/V）BSA用1mL1%（W/V）BMP-2（美国Peprotech公司）代替。致孔剂为1mL200mg/mL碳酸氢铵。
实施例10：制备镶嵌含骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）海藻酸钠微球的PLA多孔复合微球
A、制备含BMP-2海藻酸钠微球：
采用如下方法制备：称取90mg海藻酸钠，加入3mL水中充分溶解，加入1mL0.1%（W/V）BMP-2溶液，混匀后滴入30ml4%（W/V）的氯化钙溶液中，1000转/分钟搅拌1h，最后3000转/分钟离心收集微球，用去离子水充分清洗，冷冻干燥。
B、制备含BMP-2海藻酸钠微球的PLA多孔复合微球：
称取150mg聚乳酸（Polylactic acid，PLA，分子量60000～95000，济南岱罡生物工程有限公司）和60mg上述制备的含BMP-2海藻酸钠微球，加入3mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL80mg/mL BSA（致孔剂）的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，滴入120mL0.5%（W/V）的聚乙烯醇（PVA-205S，日本Kuraray公司）水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例11：制备镶嵌含血管内皮生长因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）明胶微球的PLA多孔复合微球
A、制备含VEGF明胶微球：
采用如下方法制备：称取150mg明胶（上海鲁博明胶有限公司），加入5ml水中，加热至50℃溶解后，滴入到200mL液体石蜡（含2%司盘80，V/V）中，800转/分钟搅拌30分钟后，加入5mL甲醛，继续搅拌1h后5000转/分钟离心收集微球，用丙酮和去离子水充分清洗3遍，冷冻干燥得到明胶微球。取20mg明胶微球，加入1mL0.01%（W/V）VEGF溶液，于4℃孵育6h，离心去除上清，冷冻干燥后得到含VEGF明胶微球。
B、制备镶嵌含VEGF明胶微球的PLA多孔复合微球：
称取100mg PLA（分子量30000～60000，济南岱罡生物工程有限公司），加入2mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入0.5mL100mg/mL碳酸氢钠的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入5mg上述制备的含VEGF明胶微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入100mL1%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例12：制备镶嵌含VEGF明胶微球和含TGF-β1壳聚糖微球的PLA多孔复合微球
含VEGF明胶微球的制备同实施例11，含TGF-β1壳聚糖微球的制备同实施例7。
称取称取400mg PLA（分子量160000～280000，济南岱罡生物工程有限公司），加入7mL乙酸乙酯，涡旋使其溶解后，加入2mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入上述40mg含VEGF白蛋白微球和5mg含TGF-β1壳聚糖微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL0.5%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去乙酸乙酯，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例13：制备镶嵌含VEGF明胶微球的PLGA/PGA多孔复合微球
含VEGF明胶微球制备同实施例11。
称取150mg PLGA（分子量100000，LA:GA=75:25，德国BoehringerIngelheim公司）和50mg聚羟基乙酸（Polyglycolic acid，PGA，分子量10000，长春圣博生物材料有限公司），加入3.5mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL200mg/mL碳酸氢钠的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入60mg上述含VEGF明胶微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL1%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例14：制备镶嵌含VEGF明胶微球的RGD肽修饰PLGA/PGA多孔复合微球
含VEGF明胶微球的PLGA/PGA多孔复合微球制备方法同实施例13，其中多孔微球材料采用110mg PLGA（RG756S）、40mg实施例5合成的PLGA-PEG-GRGDSPC，以及50mg PGA。
实施例15：制备镶嵌含BMP-2海藻酸钠微球的PLGA/PGA多孔复合微球
含BMP-2海藻酸钠微球的制备同实施例10。
称取50mg PLGA（分子量100000，LA:GA=75:25，德国Boehringer Ingelheim公司）和150mg PGA（分子量10000，长春圣博生物材料有限公司），加入3.5mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL200mg/mL碳酸氢钠的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入10mg上述含BMP-2海藻酸钠微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入150mL0.05%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3h，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例16：制备镶嵌含BMP-2白蛋白微球的聚几内酯（Polycaprolactone，PCL）多孔复合微球
A、制备含BMP-2白蛋白微球：
采用如下方法制备：将250mg人血清白蛋白加入4mL水中溶胀，滴入1000转/分钟搅拌的100mL蓖麻油中，乳化5分钟后滴入已预热至130℃的蓖麻油中，固化10分钟后冷却至室温，加入乙醚，5000转/分钟离心除去上清，反复5次，真空干燥得到空白白蛋白微球。取20mg空白白蛋白微球，加入1mL0.1%（W/V）BMP-2溶液，于4℃孵育6小时，离心去除上清，冷冻干燥后得到含BMP-2白蛋白微球。
B、制备镶嵌含BMP-2白蛋白微球的PCL多孔复合微球：
称取150mg聚几内酯（PCL DG-C100，济南岱罡生物工程有限公司），加入3mL乙酸乙酯，涡旋使其溶解后，加入1mL200mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入40mg上述制备的含BMP-2白蛋白微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL0.5%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去乙酸乙酯，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例17：制备镶嵌含BMP-2白蛋白微球和含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球
含BMP-2白蛋白微球的制备同实施例16，含TGF-β1壳聚糖微球的制备同实施例7。
称取称取200mg PLGA（分子量65000，LA:GA=50:50，德国BoehringerIngelheim公司），加入4mL乙酸乙酯，涡旋使其溶解后，加入1mL50mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入上述5mg含BMP-2白蛋白微球和40mg含TGF-β1壳聚糖微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL0.5%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去乙酸乙酯，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例18：制备镶嵌含VEGF明胶微球和含TGF-β1壳聚糖微球的PLGA多孔复合微球
含VEGF明胶微球的制备同实施例11，含TGF-β1壳聚糖微球的制备同实施例7。
称取200mg PLGA（分子量34000，LA:GA=50:50，德国Boehringer Ingelheim公司），加入3mL乙酸乙酯，涡旋使其溶解后，加入1mL100mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入上述20mg含VEGF明胶微球和20mg含TGF-β1壳聚糖微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL0.5%（W/V）的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去乙酸乙酯，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
实施例19：制备镶嵌含VEGF明胶微球和含TGF-β1壳聚糖微球的RGD肽修饰PLGA/PGA多孔复合微球
含VEGF明胶微球的制备同实施例10，含TGF-β1壳聚糖微球的制备同实施例7，PLGA-PEG-GRGDSPC的制备同实施例5。
称取100mg PLGA（分子量100000，德国Boehringer Ingelheim公司），50mgPGA（分子量10000，长春圣博生物材料有限公司）和50mgPLGA-PEG-GRGDSPC（PLGA RG503H，分子量34000），加入3mL二氯甲烷，涡旋使其溶解后，加入1mL40mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以8000转/分钟的速度均质3分钟得到初乳，加入上述50mg含VEGF明胶微球和5mg含TGF-β1壳聚糖微球，8000转/分钟均质0.5分钟，得到的混悬液滴入200mL0.5%（W/V）的PVA水溶液，以600转/分钟搅拌3小时，挥发除去二氯甲烷，3000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，将多孔微球冷冻干燥。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (16)
1.一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，它是由多孔微球和镶嵌在多孔微球中的载药微粒组成；所述的多孔微球的平均粒径为100～800μm，平均孔径为5～50μm；所述的载药微粒的平均粒径为50nm～100μm；
所述的载药微粒，用于载药的材料选用壳聚糖、海藻酸钠、明胶、白蛋白中的一种或两种以上；载药的材料的用量占载药微粒重量百分比为90～99.99％；
所述的多孔微球，用于制备多孔微球的材料选用聚乳酸羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯中的一种或两种以上，并且采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1；
所述的载药微粒占多孔复合微球制剂总体组成的重量百分比为2～50％；
所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成的重量百分比为50～98％。
2.根据权利要求1所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，所述的多孔微球的平均粒径为100～500μm，平均孔径为20～30μm；所述的载药微粒的平均粒径为200nm～30μm。
3.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，用于载药的材料为壳聚糖、白蛋白，或壳聚糖和明胶的组合，且壳聚糖和明胶的重量比例为1:10～10:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，用于制备多孔微球的材料为分子量为5000～300000的聚乳酸羟基乙酸；分子量为60000～95000的聚乳酸；或分子量为5000～300000的聚乳酸羟基乙酸和分子量为5000～300000的聚羟基乙酸的组合，且PLGA和PGA的质量比为1:9～9:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，用于制备多孔微球的材料为分子量为100000的聚乳酸羟基乙酸；或分子量为100000的聚乳酸羟基乙酸和10000的聚羟基乙酸的组合，且PLGA和PGA的质量比为9:1～7:3；
6.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，所述的致孔剂，为碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸锌、碳酸镁、双氧水、白蛋白或环糊精。
7.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，用于制备多孔微球的材料采用RGD肽进行修饰，所述的RGD肽为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸片段的环肽或线型肽。
8.根据权利要求1或2所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂，其特征在于，所述的载药微粒中的药物，选用骨形态发生蛋白、转化生长因子β、血管内皮生长因子、胰岛素、鲑鱼降钙素、地塞米松、淫羊藿苷中的一种或两种以上；药物占载药微粒的重量百分比为0.01～10％。
9.一种如权利要求1所述的可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
A、制备载药微粒
将药物加入亲水性载药材料中，利用常规方法制备载药微粒，离心收集载药微粒，充分清洗，冷冻干燥；
B、制备镶嵌含药微粒的多孔复合微球
将步骤A制备的含药微粒镶嵌入多孔微球，可采用以下(a)或(b)的方法：(a)将制备多孔微球的材料溶于有机溶剂中，涡旋使其充分溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将步骤A制备的含药微粒加入初乳中，均质使含药微粒分散得到混悬液，将混悬液滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂；(b)将制备多孔微球的材料和步骤A制备的含药微粒加入有机溶剂中，涡旋使多孔微球材料溶解，加入含有致孔剂的水溶液混合，均质后得到初乳，将初乳滴入搅拌条件下的外水相，搅拌数小时挥发有机溶剂，离心收集微球，充分清洗，冷冻干燥，得到镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂。
10.根据权利要求9所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，用于制备多孔微球的材料为分子量为100000的PLGA；或者分子量为100000的PLGA和10000的PGA的组合，且PLGA和PGA的质量比为9:1～7:3；
所述的致孔剂，为浓度50-200mg/mL的碳酸氢铵，且致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10～1:1。
11.根据权利要求9所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，步骤B具体为：
称取200mg分子量为100000，LA:GA＝75:25的PLGA，加入3.2mL二氯甲烷，溶解后，加入1mL100mg/mL的碳酸氢铵的水溶液，用均质机以4000～10000转/分钟的速度均质，其中加入20mg含药微粒，均质后滴入120mL0.05％W/V的聚乙烯醇水溶液，以600转/分钟搅拌1～5小时，挥发出去二氯甲烷，3000～6000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗后，将多孔微球冷冻干燥。
12.根据权利要求9所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，步骤B具体为：
称取150mg分子量为10000，LA:GA＝75:25的PLGA和50mg分子量为10000的PGA，加入3.2mL二氯甲烷，溶解后，加入1mL 100mg/mL的碳酸氢铵的水溶液，用均质机以4000～10000转/分钟的速度均质，其中加入20mg含药微粒，均质后滴入120mL 0.05％W/V的PVA水溶液，以400～800转/分钟搅拌1～5小时，挥发除去二氯甲烷，3000～6000转/分钟离心收集微球，用去离子水清洗后，将多孔微球冷冻干燥。
13.根据权利要求9所述的一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿；所述的外水相采用聚乙烯醇溶液，浓度范围为0.05～2％W/V。
14.一种如权利要求1所述的可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用。
15.根据权利要求14所述的可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用，该应用是指用于制备骨或软骨组织缺损修复材料。
16.根据权利要求14所述的可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂在制备组织缺损修复材料中的应用，该应用是指用于制备心肌组织缺损或脑组织缺损修复材料。
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