CN107663514A - 一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，属于干细胞培养技术领域，用于临床应用的人脐带间充质干细胞培养的改进方法以及改进的人脐带间充质干细胞的培养组合物。其中基础培养基为Alpha‑MEM培养基，添加成份明确的血清替代物一种或者多种：营养因子，血小板源性因子，表皮生长因子，碱性成纤维生长因子，细胞因子抗体，蛋白多肽，植物提取物等。人脐带间充质干细胞在上述培养基中传代培养及扩增之后对培养细胞表面标记分析，生长曲线结果显示人脐带间充质干细胞的活率提高，流式结果显示人脐带间充质干细胞的特性稳定，其中不含血清，避免了血清成份对细胞培养的影响，防止了外源性不明成分和病原性污染，有效保证干细胞治疗产品的质量稳定和标准化，为用于临床治疗奠定了方法学基础。

Description

一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说是一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基和提高干细胞活率的方法。
背景技术
人脐带间充质干细胞是指从人脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有较明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。
干细胞增殖数量、活率以及无外源性污染是人脐带间充质干细胞在临床治疗应用中获得疗效与安全的关键，一方面由于常规培养基中含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的无血清培养基。
促进干细胞自我增殖的细胞因子对于开发无血清培养基具有重要的意义，而添加的特定细胞因子抗体则可防止细胞出现分化的特征，添加的植物提取物则可有效的促进细胞的活率，市场上存在的无血清干细胞培养基用于培养人脐带间充质干细胞时，细胞会出现生长缓慢和分化的特征，影响了干细胞的自我复制能力，在一定程度上阻碍了人脐带间充质干细胞的临床治疗应用，因此现有的技术需要改进和发展。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有临床应用中的不足，提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基和提高干细胞活率的方法，解决血清中带来的动物源性成分和病原体污染问题，促进细胞增殖并维持干细胞特性。
本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种人脐带间充质细胞在无血清的人脐带间充质干细胞培养基中传代培养及扩增的实验方法，该实验方法的步骤是：
首先制备人脐带间充质干细胞的无血清培养基，该培养基包括基础培养基和添加营养因子成份，其中，基础培养基为Alpha-MEM培养基，根据需要添加如下成份中的一种或者多种：
1. 营养因子A（1 ng/mL-100 ng/mL）；
2. 营养因子B（1 ng/mL-100 ng/mL）；
3. 血小板源性因子（1 ng/mL-100 ng/mL）；
4. 表皮生长因子（1 ng/mL-100 ng/mL）；
5. 碱性成纤维生长因子（1 ng/mL-100 ng/mL）；
6. 细胞因子抗体A（1 ng/mL-100 ng/mL）；
7. 细胞因子抗体B（1 ng/mL-100 ng/mL）；
8. 细胞因子抗体C（1 ng/mL-100 ng/mL）。
根据需要添加如下成份中的一种或者多种，优化以后的剂量：
1. 营养因子A（20 ng/mL -50 ng/mL），
2. 营养因子B（20 ng/mL -50 ng/mL），
3. 血小板源性因子（20 ng/mL -50 ng/mL），
4. 表皮生长因子（20 ng/mL -50 ng/mL），
5. 碱性成纤维生长因子（20 ng/mL -50 ng/mL），
6. 细胞因子抗体A（20 ng/mL-50 ng/mL），
7. 细胞因子抗体B（20 ng/mL -50 ng/mL），
8. 细胞因子抗体C（20 ng/mL -50 ng/mL）。
已知成分的培养基是完全不含动物来源组分的，并且不含人源的白蛋白复杂混合物，在某些实施方式中，组合物包含化学成分确定的培养基和一种或多种的组分因子，例如营养因子、生长因子、细胞因子抗体等。
培养基包括相应的明确的营养成分：氨基酸、维生素、盐类、脂类。
培养基还包括成分明确的蛋白多肽，也可加入经无菌及无病原体安全处理后的植物抽提物，培养基的制备是依次将基础培养基、蛋白多肤和细胞因子和植物提取物加入到培养基中。
其中植物提取物来自玫瑰花、芦荟、人参、肉苁蓉、红花、桃仁、茉莉花提取物。
所述人脐带间充质干细胞无血清培养基包括以下一种或者多种组分：
玫瑰花抽提物，10-50mg/L；
芦荟抽提物，10-50mg/L；
人参抽提物，10-50mg/L；
肉苁蓉抽提物，10-50mg/L；
红花提取物，10-50mg/L；
桃仁提取物，10-50mg/L；
茉莉花提取物，10-50mg/L。
取以上植物成分：玫瑰花、芦荟、人参、肉苁蓉、红花、桃仁、茉莉花，分别榨汁收集汁液，采用2000g离心，去除碎片获取上清液，再采用0.22um滤膜过滤，去除混在上清液中的细胞碎片，也可采用分级无菌超滤分离机进行截留，此处所述分级超滤分离机，是由电磁供料泵、耐震压力表、无菌原料罐、压力表、无菌管道支架和1000D和50KD无菌有机滤膜等配件连接组成。
获得的上清液通过滤膜的顺序为：先通过50KD有机滤膜，收集低于50KD的营养因子液，然后将营养因子液用电磁泵再次打入1000D有机滤膜，收集到营养浓缩液，根据工艺需要，通过反复浓缩可以将营养因子液体积浓缩为原收集上清液体积的1/50既可，测定提取的植物精华液，分装以后备用。
以上成分可保护细胞免受理化因素损伤并支持人脐带间充质干细胞分泌生成细胞因子。
人脐带间充质干细胞在上述培养基中传代培养及扩增的实验步骤是：
1）细胞复苏步骤：
a．从液氮罐中快速取出1管细胞至备有液氮的冰盒中，待用；
b．打开水浴锅至37℃；
c．用10mL移液管吸取9mL完全培养基至15mL离心管中，待用；
d．用镊子从冰盒中夹出细胞，在37℃水浴中快速解冻，轻轻摇晃，直至只有一小块冰坨，复苏时间控制在2min以内；
e．用100-1000uL Tip头将复苏好的细胞吸至离心管中，轻晃混匀，Tip头可吸取少量离心管中的细胞悬液清洗一遍冻存管，400g，室温离心3min；
f．用移液管向1个T75培养瓶中加入7mL完全培养基；离心完，倒去上清，擦拭管口，加入8mL完全培养基重悬细胞，吹打10次混匀，取20uL细胞悬液用于计数，接种至培养瓶中；
g．培养瓶上手动标记细胞名称、复苏代数和复苏日期，放至37℃，5%CO2培养箱中培养；
h．20uL细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用PBS稀释1倍）稀释2倍计数；
i. 操作完，整理生物安全柜和桌面，放入下次操作时需用耗材，紫外照射消毒30min。
2）传代培养步骤（以T75cm2培养瓶为例）：
a．显微镜下观察细胞生长状态，当细胞汇合度至80%时，按1:3比例传代；
b．从培养箱中取出细胞，倒去废液，擦拭瓶口，用5mL移液管吸取5mL生理盐水将细胞洗一遍（注：不要直接吹打细胞），轻晃培养瓶，吸去废液；
c．吸取2mL0.25%Trypsin-EDTA加入到培养瓶内，丢弃移液管，轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖整个培养瓶，5%CO2培养箱中放置3min，在显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全从培养瓶底壁脱落；
d．用5mL移液管吸取2mL完全培养基至培养瓶内，吹打10次混匀，移入1个15mL离心管中，混匀，丢弃移液管；
e．用5mL移液管吸取5mL 生理盐水将培养瓶中残留的细胞洗一遍，移入上述15mL离心管中，丢弃移液管，400g，室温离心3min；
f．倒去上清，擦拭管口，用10mL移液管吸取32mL完全培养基至1个T225培养瓶中；再吸取8mL完全培养基重悬细胞，吹打10次混匀，取20uL细胞悬液用于计数，接种至培养瓶中；
g．培养瓶上手动标记细胞名称、传代代数和传代日期，放至37℃,5%CO2培养箱中培养；
h. 20uL细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用PBS稀释1倍）稀释5倍计数；
i．操作完，整理生物安全柜和桌面，放入下次操作时需用耗材，紫外照射消毒30min；
g．培养细胞的表面标记分析的试验步骤是：
取P2代的细胞，去掉培养液，洗涤2次，用1:1的质量0.05%浓度胰蛋白酶液消化，离心，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/ml的细胞悬液，加入10uL抗体，在4度下孵育，用PBS洗涤1次，离心，用500uL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测进行检测并记录结果。
3）本发明的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，克服了动物源性血清污染的缺陷和并解决了细胞扩增数量和维持干细胞特性的问题：不含血清，避免了不明血清成份对细胞培养的影响和动物源性的污染；培养基中添加了特殊的细胞因子和特定的细胞因子抗体，可促进人脐带间充质干细胞的增殖和维持干细胞特性，增加了人脐带间充质干细胞的存活率，确保了细胞的质量和安全性符合国家的GMP要求，为广泛的临床应用铺平道路。
4）本发明人脐带间充质干细胞无血清培养基中的人脐带间充质干细胞保持良好的贴壁特性，人脐带间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态，同时经过多代培养的情况下，细胞可保持正常状态。
5）本发明的生长体系中的人脐带间充质干细胞在48-72小时前能够生长至平台期，但对照生长体系中的人脐带间充质干细胞只能在72-96小时后才能够生长至平台期，由此可以看出，本发明的无血清培养基能够有效地促进人脐带间充质干细胞的生长速度和存活率。
6） 本发明所述的无血清培养基和对照组培养基培养的流式细胞表型对比结果显示, 本发明提供的无血清培养基和对照组培养基阳性表达CD44，CD73、CD90、CD105，阴性表达CD14，CD19，CD34和CD45，没有统计学差异。
附图说明
1)图1A为人脐带间充质干细胞无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞的形态图片。
2)图1B常规培养基培养的人脐带间充质干细胞的形态图片。
3)图1中2种培养基培养72小时后细胞融合达到80％，细胞形态均一，呈长梭形，细胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中央。
4)图2中，横坐标表示生长时间单位为天数，纵坐标表示细胞计数值，图2中的曲 线1为本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基培养的生长曲线图，图2中的曲线2为常规 培养基培养的脐带间充质干细胞的生长曲线图。
5)图2中人脐带间充质干细胞无血清培养基和常规培养基培养的人脐带间充质干细胞的生长曲线图，细胞生长情况：两种培养基生产的人脐带间充质干细胞生长情况差异有显 著性意义(P＞0.05)。
6)图3中，流式细胞表型对比结果图3中，第1行是无血清培养基培养的人脐带间 充质干细胞的流式表型，第2行是常规培养基培养的人脐带间充质干细胞的流式表型。
7)流式细胞表型对比结果：图3中培养基和对照组培养基阳性表达CD44，CD73、 CD90、CD105，阴性表达CD11，CD19，CD34和CD45没有统计学差异。

Claims (8)

1.一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，基础培养基为Alpha-MEM培养基，根据需要添加如下成份中的一种或者多种：
1）营养因子A（1 ng/mL -100 ng/mL）；
2）营养因子B（1 ng/mL -100 ng/mL）；
3）血小板源性因子（1 ng/mL -100 ng/mL）；
4）表皮生长因子（1 ng/mL -100 ng/mL）；
5）碱性成纤维生长因子（1 ng/mL -100 ng/mL）；
6）细胞因子抗体A（1 ng/mL -100 ng/mL）；
7）细胞因子抗体B（1 ng/mL -100 ng/mL）；
8）细胞因子抗体C（1 ng/mL -100 ng/mL）。
2.根据权利1要求所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基组合物, 其中培养基包含一种或多种生长因子或细胞因子，可选择的添加成份以及优化以后的剂量如下：
1）营养因子A（20ng/mL-50 ng/mL）；
2）营养因子B（20ng/mL-50 ng/mL）；
3）血小板源性因子（20ng/mL-50 ng/mL）；
4）表皮生长因子（20ng/mL-50 ng/mL）；
5）碱性成纤维生长因子（20ng/mL-50 ng/mL）；
6）细胞因子抗体A（20ng/mL-50 ng/mL）；
7）细胞因子抗体B（20ng/mL-50 ng/mL）；
8）细胞因子抗体C（20ng/mL-50 ng/mL）。
3.根据权利1要求所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基组合物，对于原代细胞的脐带间充质干细胞无血清培养基组合物，其中可添加植物提取物来自玫瑰花，芦荟，人参，肉苁蓉，红花，桃仁，茉莉花提取物。
4.根据所述权利3所述提取物，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基包括以下一种或者多种组分：
1）玫瑰花抽提物，10-50mg/L；
2）芦荟抽提物，10-50mg/L；
3）人参抽提物，10-50mg/L；
4）肉苁蓉抽提物，10-50mg/L；
5）红花提取物，10-50mg/L；
6）桃仁提取物，10-50mg/L；
7）茉莉花提取物，10-50mg/L。
5.根据权利1要求所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基已知成分的培养基是完全不含动物来源组分的，并且不含人源的白蛋白复杂混合物，在某些实施方式中，组合物包含化学成分确定的培养基和一种或多种的组分因子，例如营养因子、生长因子、细胞因子抗体，植物提取物等。
6.根据权利1要求所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基培养基包括相应的明确的营养成分：氨基酸、维生素、盐类、脂类。
7.根据权利1要求所述的人脐带间充质干细胞无血清培养基还包括成分明确的蛋白多肽，加入经无菌及无病原体安全处理后的植物抽提物，培养基的制备是依次将基础培养基、蛋白多肤、细胞因子和植物提取物加入到培养基中。
8.一种基于权利1要求所述脐带间充质干细胞培养基的干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）培养基的制备依次将基础培养基、营养因子、细胞因子、蛋白多肤、细胞因子抗体和植物提取物加入到培养基中；
2）常规法分离得到脐带间充质干细胞；
3）将分离得到的脐带间充质干细胞接种到上述培养基中，并进行贴壁培养，也可用于3D培养。
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