CN110257325A - 一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法 - Google Patents

一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，包括以下步骤：将芦荟植株经清洗灭菌后，研磨成浆，过滤取上清液，高速离心取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末；将去离子水加热后加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入碳酸氢钠和L‑谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入新生牛血清和芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至中性，灭菌，得到DMEM细胞培养液；将DMEM细胞培养液预热后，加入生长因子，混合均匀，接种细胞，恒温震荡培养，得到第一代细胞溶液；将第一细胞溶液稀释后，分别接种于新的DMEM细胞培养液中，置于低氧浓度和高氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到第二代和第三代细胞溶液，即得到具有自愈合性能的细胞溶液。

Description

一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法。
背景技术
血液中含有大量具有再生和修复功能的生物活性分子及血小板成分，在特定的环境下，血小板受刺激可大量产生皮肤生长与修复所需的重要生长因子，这些生长因子、活性多肽、氨基酸和蛋白等生物活性分子可有效帮助修复损伤，进而加速伤口愈合，对软硬组织再生具有促进作用。因此，目前转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和血小板源性生长因子等已广泛应用于临床治疗及处置，包括外科手术、整形手术、骨科、牙科与皮肤移植等。
中国专利CN108949870A公开的一种生产重血小板源生长因子的方法，具体制备方法包括以下步骤：(1)一级种子培养，用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增3次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml，其中种子培养基为：CD CHO AGT 24.6g/L；所述基础培养基为：DynamisAGT24.8g/L；所述补料培养基为：EfficientFeed C+AGT 176.4g/L；葡萄糖浓缩液为：葡萄糖200g/L；碳酸氢钠溶液为：NaHCO390.7g/L。(2)二级种子培养，用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增2次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。(3)反应器连续流加培养，用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；搅拌转速设置为280r/min；pH设置为6.95±0.15，pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40±20％，氧气气体流量为1.5～400ml/min，根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃，第5天降温至33.5±0.5℃，发酵14天结束。连续流加培养过程中，第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL；当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。(4)收集上清进行纯化准备，将发酵培养液经过离心处理后，先采用Q Sepharose FastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5MNaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2MNaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mM NaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍；然后采用SP SepharoseFastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC平衡，之后上样，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl溶液和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后，再用pH6.0的80m M柠檬酸-柠檬酸钠+0.5M NaCl溶液洗脱重组血小板源生长因子，收集重组血小板源生长因子。该提取方法简单，蛋白浓度高，安全性好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，本发明将芦荟有效提取物加入到细菌培养过程中，以得到具有自愈合性能的细胞。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将芦荟植株经清洗灭菌后，研磨成浆，过滤取上清液，高速离心取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末；
(2)将去离子水加热后加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入碳酸氢钠和L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入新生牛血清和步骤(1)制备的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至中性，灭菌，得到DMEM细胞培养液；
(3)将步骤(2)制备的DMEM细胞培养液预热后，加入生长因子，混合均匀，接种细胞，恒温震荡培养，得到第一代细胞溶液；
(4)将步骤(3)制备的第一细胞溶液稀释后，接种于步骤(2)制备的新的DMEM细胞培养液中，置于低氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到第二代细胞溶液；
(5)将步骤(2)制备的新的DMEM细胞培养液预热后，加入细胞生长因子，混合均匀，接种稀释后的第二代细胞溶液，置于高氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，清洗灭菌的工艺为：将芦荟洗净，去除外皮，置于60-75％的乙醇水溶液中充分振荡。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，高速离心的转速为10000-12000r/min，时间为15-30min。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，芦荟提取粉末的用量占总质量的3.5-5％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，pH值为7.2-7.4。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，细胞为少突胶质细胞、间充质干细胞和神经干细胞，接种量为总质量的7-7.5％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，细胞生长因子为血小板源性生长因子、表皮生长因子或者成纤维细胞生长因子。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)、(4)或者(5)中，恒温振荡培养的温度为33-35℃，振荡的频率为150-200r/min，时间为3-7d。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(4)中，低氧浓度的二氧化碳摇床中氧的含量为8-10％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(5)中，高氧浓度的二氧化碳摇床中氧的含量为20-25％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的制备方法是针对少突胶质细胞、间充质干细胞和神经干细胞，通过对现有的细胞培养进行改进处理，通过将芦荟提取有效成分加入到细胞培养繁殖过程中，芦荟提取物中含有蒽醌类物质和多糖类物质等活性物质，具有促进细胞再生、修复受损组织的作用，因此，将芦荟提取物经冷冻干燥后成粉末加入到多代细菌的培养中，将芦荟提取有效成分对细胞核进行影响，制备使细胞具有一定自修复性能，此外，在细胞培养过程中通过调节氧含量，先在低氧环境中再在高氧环境中培养，提高细胞对于高氧环境和低氧环境的承受能力。
(2)本发明的制备方法简单，对细胞的适用性强，安全性和有效性好，具有很好地应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于60％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以10000r/min的转速高速离心15min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至20℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.5g的碳酸氢钠和0.15g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的3.5％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.2，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至30℃后，加入血小板源性生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7％，接种少突胶质细胞，在33℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.6×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为8％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至30℃后，加入血小板源性生长因子，混合均匀，接种密度为0.6×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为20％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养3d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
实施例2：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于75％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以12000r/min的转速高速离心30min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至30℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.8g的碳酸氢钠和0.25g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的5％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.4，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入表皮生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7.5％，接种间充质干细胞，在35℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养7d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.8×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量10％的二氧化碳摇床中，在35℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养-7d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入表皮生长因子，混合均匀，接种密度为0.8×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为25％的二氧化碳摇床中，在35℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养7d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
实施例3：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于65％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以11000r/min的转速高速离心20min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至25℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.6g的碳酸氢钠和0.20g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的4％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.3，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至33℃后，加入成纤维细胞生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7.3％，接种神经干细胞，在34℃下，以180r/min的速率恒温振荡培养5d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.7×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为9％的二氧化碳摇床中，在34℃下，以150-200r/min的速率恒温振荡培养5d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至32℃后，加入成纤维细胞生长因子，混合均匀，接种密度为0.7×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为21％的二氧化碳摇床中，在34℃下，以180r/min的速率恒温振荡培养6d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
实施例4：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于72％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以10500r/min的转速高速离心25min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至27℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.7g的碳酸氢钠和0.2g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的4％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.4，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至33℃后，加入血小板源性生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7.3％，接种少突胶质细胞、间充质干细胞和神经干细胞，在34℃下，以180r/min的速率恒温振荡培养4d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.6×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为10％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入表皮生长因子，混合均匀，接种密度为0.8×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为20％的二氧化碳摇床中，在35℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养4d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
实施例5：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于60％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以12000r/min的转速高速离心15min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至30℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.5g的碳酸氢钠和0.25g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的3.5％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.4，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至30℃后，加入成纤维细胞生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7.5％，接种少突胶质细胞，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.8×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为8％的二氧化碳摇床中，在35℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养7d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至30℃后，加入成纤维细胞生长因子，混合均匀，接种密度为0.8×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为20％的二氧化碳摇床中，在35℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养7d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
实施例6：
(1)将芦荟植株洗净，去除外皮，置于75％的乙醇水溶液中充分振荡后，研磨成浆，过滤取上清液，以10000r/min的转速高速离心30min，取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末。
(2)将1L的去离子水加热至20℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.8g的碳酸氢钠和0.15g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清和用量占总质量的5％的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.2，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(3)将DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入血小板源性生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7％，接种少突胶质细胞，在35℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养7d，得到第一代细胞溶液。
(4)将第一细胞溶液稀释至0.6×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为10％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第二代细胞溶液。
(5)将新的DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入表皮生长因子，混合均匀，接种密度为0.6×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为25％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
对比例：
(1)将1L的去离子水加热至20℃后，加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入3.8g的碳酸氢钠和0.15g的L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入占总体系10％的灭活新生牛血清，搅拌均匀，调节体系的pH值至7.2，灭菌，得到DMEM细胞培养液。
(2)将DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入血小板源性生长因子，混合均匀，按照接种量为总质量的7％，接种少突胶质细胞，在35℃下，以150r/min的速率恒温振荡培养7d，得到第一代细胞溶液。
(3)将第一细胞溶液稀释至0.6×106个/ml的密度后，接种于新的DMEM细胞培养液中，置于氧的含量为10％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到第二代细胞溶液。
(4)将新的DMEM细胞培养液预热至35℃后，加入表皮生长因子，混合均匀，接种密度为0.6×106个/ml稀释后的第二代细胞溶液，置于氧的含量为25％的二氧化碳摇床中，在33℃下，以200r/min的速率恒温振荡培养3d，得到具有细胞溶液。
经检测，实施例1-6制备的具有自愈合性能的细胞溶液和对比例1制备的细胞溶液的浓度的结果如下所示：
由上表可见，本发明制备的具有自愈合性能的细胞溶液中细胞对外界有更好的耐性，具有一定的自愈能力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将芦荟植株经清洗灭菌后，研磨成浆，过滤取上清液，高速离心取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末；
(2)将去离子水加热后加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入碳酸氢钠和L-谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入新生牛血清和步骤(1)制备的芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至中性，灭菌，得到DMEM细胞培养液；
(3)将步骤(2)制备的DMEM细胞培养液预热后，加入生长因子，混合均匀，接种细胞，恒温震荡培养，得到第一代细胞溶液；
(4)将步骤(3)制备的第一细胞溶液稀释后，接种于步骤(2)制备的新的DMEM细胞培养液中，置于低氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到第二代细胞溶液；
(5)将步骤(2)制备的新的DMEM细胞培养液预热后，加入细胞生长因子，混合均匀，接种稀释后的第二代细胞溶液，置于高氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到具有自愈合性能的细胞溶液。
2.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，清洗灭菌的工艺为：将芦荟洗净，去除外皮，置于60-75％的乙醇水溶液中充分振荡。
3.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，高速离心的转速为10000-12000r/min，时间为15-30min。
4.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，芦荟提取粉末的用量占总质量的3.5-5％。
5.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，pH值为7.2-7.4。
6.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，细胞为少突胶质细胞、间充质干细胞和神经干细胞，接种量为总质量的7-7.5％。
7.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，细胞生长因子为血小板源性生长因子、表皮生长因子或者成纤维细胞生长因子。
8.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)或者(5)中，恒温振荡培养的温度为33-35℃，振荡的频率为150-200r/min，时间为3-7d。
9.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，低氧浓度的二氧化碳摇床中氧的含量为8-10％。
10.根据权利要求1所述的一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，高氧浓度的二氧化碳摇床中氧的含量为20-25％。
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