CN103555665B

CN103555665B - 一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基

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Publication number: CN103555665B
Application number: CN201310583547.4A
Authority: CN
Inventors: 赵侃; 王春有; 赵宇; 刘湘连; 李莉莉
Original assignee: BEIJING DONGFANG HUAHUI BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING DONGFANG HUAHUI BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: CN103555665A

Abstract

本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基。以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：α‑MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L‑谷氨酰胺1‑5mM、泊洛沙姆18850‑300mg/L、重组人白蛋白2‑8g/L、重组人转铁蛋白10‑20mg/L、重组人胰岛素2‑10mg/L、Hepes1‑5mM、β‑巯基乙醇50nM、脂质0.1‑1mg/L、微量元素1‑5mg/L、谷胱甘肽0.1‑5mg/L、对氨基苯甲酸0.5‑5mg/L、氢化可的松1‑50ng/mL、维生素PP20‑50mg/L、维生素C5‑50mg/L、式I的化合物2‑10μM、式II的化合物5‑20μM、黄体酮10‑20ng/mL、腐胺1‑10mg/L、肝素1‑10IU/mL、EGF1‑10ng/mL、b‑FGF1‑10ng/mL、HGF1‑10ng/mL、VEGF1‑10ng/mL。该MSCs无血清培养基BPS‑SFM是一种化学成分确定、无动物源性物质、无血清的培养基；。

Description

一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基

技术领域

本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基，属于细胞工程与生物医药技术领域。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是广泛存在于人体组织器官中的成体干细胞，因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能，在临床造血支持、促进干细胞植入和免疫调控等方面具有潜在的应用前景。目前，通过将MSCs作为细胞治疗产品进行直接输注，或与支架材料相结合构建组织工程化的组织、器官（皮肤、骨或软骨等）进行移植开展的大规模临床前及临床研究证实，MSCs在烧伤、骨缺损、软组织填充、终末期肝病、心肌梗死、糖尿病等创伤或疾病的治疗中具有良好的安全性和有效性。例如，2012年，美国Osiris公司的干细胞产品Prochymal在加拿大获批上市，成为全球首个获批的干细胞药物。Prochymal是间充质干细胞静脉注射剂，用于激素治疗失败的acute GvHD（急性移植物抗宿主病，一种骨髓移植并发症）的儿童患者，这是间充质干细胞临床应用的历史性进步。

目前，已经可从脐带、胎盘、成人骨髓、外周血、脂肪等组织中分离获得MSCs，虽然不同来源MSCs在特性上略有差别，但都具有如下共同性质：例如，体外成纤维生长、扩增，特异性表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD166，但不表达内皮和造血的标志CD34和CD45等，且在体外具有成脂、成骨和成软骨分化的潜能。因此，都可以作为终末期疾病、难治性疾病治疗的种子细胞来源。

随着MSCs在临床应用中的迫切需求以及潜在的巨大衍生市场，关于符合临床应用要求的、规模化的MSCs的分离、纯化、扩增技术和标准的建立亟待解决。由于组织中MSCs数量极其有限，为获得足够用于临床治疗的细胞量，需要在回输前对其进行体外扩增。虽然研究表明，常规用于普通细胞培养的含有胎牛/新生牛血清的培养体系同样适合MSCs的体外扩增和维持，然而细胞内残存的动物血清会引发回输后受体产生严重的免疫反应，并且带来不可预知的动物源性污染，为临床应用带来诸多问题。例如Sunghoon Jung等人对这类含有血清或动物源成分的培养体系的临床应用问题进行了系统性总结（Sunghoon Jung etal.,Ex vivo Expansion of Human Mesenchymal Stem Cell in Defined Serum-FreeMedia,Stem Cells International,2012），其至少包括如下潜在问题：

（1）有害病原体的污染，例如病毒、支原体、朊病毒等；

（2）异种蛋白所引发的免疫反应；

（3）高度的批间差异性导致细胞的生产过程很难实现标准化；

（4）血清中还可能含有生长抑制因子、细胞毒性物质；

（5）为降低各类污染风险而开展的质量控制难度十分高；

（6）其它成分不明的因子、激素等物质的作用尚待研究。

近年来，对MSCs等成体干细胞的体外维持和扩增机制的深入研究，极大推动了MSCs的体外无血清培养体系的研发和建立。目前商品化以及在研的MSCs无血清培养基（表1）都是在基础培养基（α-MEM、IMDM、L-DMEM等）中添加生长因子（碱性成纤维细胞生长因子bFGF、上皮细胞生长因子EGF、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子-1IGF-1、干细胞生长因子SCF等）、蛋白（胰岛素Insulin、转铁蛋白Transferrin、人/牛血清白蛋白H/BSA等）、激素（地塞米松/钠）、微量元素（硒）、维生素等。无血清培养基具有成分明确的特点，并可良好维持MSCs的体外增殖和分化多能性，但存在价格高、保存时间短等问题。同时，这些培养基大多需要辅助明胶等基质胶对培养平皿进行包被处理，不但可能因此引入动物源成分，而且也增加了细胞培养扩增的工作量和传代过程中的污染机会。因此，寻找成分明确、质量稳定、使用便捷、成本较低的无血清培养体系对于MSCs的临床应用具有重要的意义。

表1目前已有的商品化培养基情况统计表

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于培养MSCs的无血清、无动物源性物质的培养基，其成分明确、质量稳定可控、成本较低、可高效用于MSCs原代细胞的分离和扩增，能够为MSCs临床应用的正规化推行和实现提供理想的基础条件。

为达到上述目的，本发明提供了一种用于培养间充质干细胞的无血清、无动物源性物质培养基（BPS-SFM培养基），以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：

α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巯基乙醇50nM、脂质0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、谷胱甘肽0.1-5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松1-50ng/mL、维生素PP20-50mg/L、维生素C5-50mg/L、式I所示的化合物2-10μM、式II所示的化合物5-20μM、黄体酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL；

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述无血清培养基中，所采用的脂质包括胆固醇、花生四烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等中的一种或几种的组合。

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述无血清培养基中，所采用的微量元素包括Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn和Ba等中的一种或几种的组合。

根据本发明的具体实施方案，优选地，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、Zn1mM、Ga0.3mM、Cr5μM、Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGF10ng/mL。

根据本发明的具体实施方案，优选地，以该无血清培养基的体积计，其还包括：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I10ng/mL、GM-CSF1-10ng/mL、TGF-β1-10ng/mL。即以体积计，上述无血清培养基可以包括以下成分组成：α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巯基乙醇50nM、脂质0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、谷胱甘肽0.1-5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松1-50ng/mL、维生素PP20-50mg/L、维生素C5-50mg/L、式I所示的化合物2-10μM、式II所示的化合物5-20μM、黄体酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL、原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I10ng/mL、GM-CSF1-10ng/mL、TGF-β1-10ng/mL。更优选地，上述五种成分的含量分别为：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I10ng/mL、GM-CSF10ng/mL、TGF-β10ng/mL。

本发明还提供了上述用于培养间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其包括将各种成分与水（例如注射用水，但不限于此）混合之后利用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存的步骤。在制备过程中，对于不溶于水的成分可以先将其溶于适当的溶剂，然后再与水混合，具体的可以根据现有方式进行。

本发明还提供了上述用于培养间充质干细胞的无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。

本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM的成分明确、无动物源性物质，可支持原代细胞的分离，且培养时无需包被细胞培养皿，培养效果与有血清培养基培养效果相当，避免异源性污染，可保证批次稳定性。

本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM和传统的有血清培养体系（10%胎牛血清培养基）以及市场无血清培养基（ScienCell的MSCM-SF培养基）培养MSC流式细胞表型的检测结果显示，本发明提供的无血清培养基和10%胎牛血清培养基以及ScienCell的MSCM-SF培养基相比，CD29、CD90、CD105、CD166的表达相近，阳性率都在90%以上，但不表达CD34、和CD45，两两差异无统计学意义。相比较ScienCell的MSCM-SF，本发明提供的MSCs无血清培养基对MSCs原代分离培养具有良好的支持作用，且支持作用与传统的10%胎牛血清培养基相当。

本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM与ScienCell的MSCM-SF培养基培养传代的MSCs都具有成脂、成骨、成软骨分化能力。同时，在原代细胞传代过程中，本发明提供的MSCs无血清培养基对细胞有更好的适应性，传代中细胞的凋亡率明显低于MSCM-SF培养基。在传代过程中接种的MSCs的密度要低于MSCM-SF培养基生长的最佳最低密度，且同一接种密度下，MSCs在本发明提供的MSCs无血清培养基中的生长速度明显快于对照组。

本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM是一种化学成分确定、无动物源性物质、无血清的培养基，同时，该培养基用于细胞培养过程中，无需对培养瓶进行包被处理，可以避免在细胞培养的过程中引入动物成分、增加污染机会和操作的复杂性。更重要的是本发明提供的培养基可以有效支持MSCs的原代分离培养，可以在更低的细胞接种密度下进行细胞传代（最低4000/mL）。本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM质量稳定，批次可控性强，易于推广和市场化，是MSCs基础研究和临床应用研究的理想培养基。

附图说明

图1a为BPS-SFM培养基培养的P0代MSCs的形态图；

图1b为BPS-SFM培养基培养的P4代MSCs的形态图；

图1c为对照组培养基培养的P0代MSCs的形态图；

图1d为对照组培养基培养的P4代MSCs的形态图；

图2a是以4×10⁴/mL的密度接种时BPS-SFM与对照组的细胞增殖结果；

图2b是以6×10⁴/mL的密度接种时BPS-SFM与对照组的细胞增殖结果；

图3a和图3b分别为BPS-SFM培养基和对照组的成脂分化结果；

图3c和图3d分别为BPS-SFM培养基和对照组的成骨分化结果；

图3e和图3f分别为BPS-SFM培养基和对照组的成软骨分化结果；

图4a和图4b分别是BPS-SFM培养基和对照组的细胞核型分析结果。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

本实施例提供了一种BPS-SFM培养基，其具体成分如表2所示：

表2

组分	含量
		α-MEM	10.2g/L
碳酸氢钠	2.4g/L

L-谷氨酰胺	5mM
		泊洛沙姆188	100mg/L
重组人白蛋白	8g/L
		重组人转铁蛋白	20mg/L
重组人胰岛素	10mg/L
		Hepes	5mM
β-巯基乙醇	50nM
		胆固醇	0.5mM
花生四烯酸	50nM
		棕榈酸	0.26mg/L
棕榈油酸	0.25mg/L
		硬脂酸	0.28mg/L
油酸	0.28mg/L
		亚油酸	0.28mg/L
亚麻酸	0.28mg/L
		维生素PP	50mg/L
维生素C	20mg/L
		Cu	5nM
Se	30nM
		Zn	1mM
Ga	0.3mM
		Cr	5μM
Mg	0.3mM
		Mn	5nM
谷胱甘肽	1mg/L
		对氨基苯甲酸	1mg/L
氢化可的松	50ng/mL
		式I所示的化合物	10μM
式II所示的化合物	20μM
		黄体酮	15ng/mL
腐胺	10mg/L
		肝素	10IU/mL
EGF	10ng/mL
		b-FGF	10ng/mL
HGF	10ng/mL
		VEGF	10ng/mL

原儿茶酸	1.5mmol/L
		PDGF-BB	10ng/mL
IGF-I	10ng/mL
		GM-CSF	10ng/mL
TGF-β	10ng/mL

本实施例提供的上述BPS-SFM培养基是通过将表2所示的各种成分与注射用水混合在一起然后采用0.22μm的滤器过滤除菌得到的，不溶于水的成分可以先溶于适当的溶剂再与水混合。该BPS-SFM培养基应密封，4℃避光保存。

本实施例中使用的细胞培养试剂为美国Sciencell公司销售的，细胞因子为美国Peprotech公司的产品，细胞培养瓶为德国SARSTEDT公司提供的。

上述BPS-SFM培养基的各种参数如下：

pH：7.2-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素<0.5EU/mL。

实施例2脐带间充质干细胞的无血清分离与培养

本实施例提供了一种利用实施例1提供的BPS-SFM培养基培养脐带间充质干细胞的方法，分离获得的细胞同批以Sciencell公司无血清培养基MSCM-SF为对照组培养基进行培养，包括以下步骤：

获取15cm剖腹产新生儿脐带组织，用含5%青-链霉素生理盐水充分洗净，充分去除血污；

将洗净的脐带均匀剪为3-4cm长度小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；

将剥离的华通氏胶剪碎为1mm³-3mm³的小块，将1mg/mL的胶原酶A和1mg/mL的中性蛋白酶按照1:2的质量比混合并加入其中，置于37℃、5%CO₂培养箱中消化处理2小时，期间每20分钟取出检测消化情况；

离心收集细胞和残余组织，用1%青-链霉素无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗去残留胶原酶，2000rpm离心5分钟，弃上清；加入0.25%胰酶（含0.02%EDTA），置于37℃、5%CO₂培养箱中消化10分钟，期间每3分钟监测消化情况；

利用1%青-链霉素无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗去残留胶原酶，2000rpm离心5分钟，弃上清；

分别使用实施例1提供的BPS-SFM培养基和对照组培养基MSCM-SF重悬组织和细胞，接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂培养箱培养，8-15天后进行传代培养。

实施例1提供的BPS-SFM培养基和对照组培养基培养的MSCs形态图见图1a-图1d所示，其中，图1a代表BPS-SFM培养基培养的P0代MSCs，图1b代表BPS-SFM培养基培养的P4代MSCs，图1c代表对照组培养基培养的P0代MSCs，图1d代表对照组培养基培养的P4代MSCs。图1a-图1d的结果显示在原代培养6天(P0)，本发明提供的无血清培养基支持MSCs的原代分离培养，但对照组培养基在不添加血清的情况下不支持MSCs的原代分离培养。细胞培养传代至P4后，本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSCs形态均呈典型的短小梭形，形态均一，轮廓清晰，两者无明显差异。BPS-SFM为实施例1的无血清培养基，对照组为ScicenCell的MSCM-SF。

实施例3细胞增殖能力检测

本实施例对实施例1提供的BPS-SFM培养基与对照组的细胞增殖能力进行对比检测，具体按照以下步骤进行：

分别处理BPS-SFM培养基和对照组两种不同的无血清培养基中的P4代脐带间充质干细胞，分别以4×10⁴/mL和6×10⁴/mL的密度接种于96孔板内，每孔添加100μL培养基，每组细胞接种5个平行孔；细胞贴壁24h后按1:10添加CCK-8试剂，在37℃、5%的CO₂培养箱中孵育2h，进行OD值测定。

细胞增殖结果图见图2a和图2b所示，其中，图2a是以4×10⁴/mL的密度接种时二者的细胞增殖结果，图2b是以6×10⁴/mL的密度接种时二者的细胞增殖结果。由图2a和图2b可以看出：在低密度接种情况下，BPS-SFM培养基对脐带间充质干细胞的扩增能力优于对照组，当高密度接种时，两者作用相当。

实施例4流式细胞仪检测细胞表型

本实施例是对实施例1中提供的BPS-SFM培养基以及对照组MSCM-SF中的P4代细胞进行细胞表型，按照以下步骤进行：

用TrypLE消化收集实验组BPS-SFM培养基和对照组MSCM-SF中的P4代细胞，分别与荧光标记的CD29、CD90、CD105、CD34和CD45等表面抗体孵育，并以FITC和PE标记的小鼠IgG同型抗体作为对照；在4℃下孵育45min，离心收集细胞；利用PBS缓冲液清洗3次后，将细胞重悬于400μL PBS缓冲液中，上机进行流式细胞仪分析，具体结果如表3所示。

表3

实施例5成脂诱导分化

本实施例是对实施例1中提供的BPS-SFM培养基以及对照组MSCM-SF中的P4代细胞进行成脂诱导分化，按照以下步骤进行：

将脐带MSCs（实验组BPS-SFM培养基中的P4代MSCs、对照组MSCM-SF中的P4代MSCs）按照1.0×10⁴/孔接种于24孔培养板中，在含10%FBS的α-MEM中培养24h后，更换为脂肪诱导培养基：在含10%FBS的高糖DMEM中添加地塞米松（10^-6mol/L）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（0.5mmol/L）、消炎痛（60μmol/L）和胰岛素（5μg/mL），每3天更换一次培养基，连续诱导2周；用油红O染色鉴定分化细胞内脂滴的形成。

实施例6成骨诱导分化

本实施例是对实施例1中提供的BPS-SFM培养基以及对照组MSCM-SF中的P4代细胞进行成骨诱导分化，按照以下步骤进行：

将脐带MSCs（实验组BPS-SFM培养基中的P4代MSCs、对照组MSCM-SF中的P4代MSCs）以5×10³/孔密度接种于24孔培养板中，在含10%FBS的α-MEM中培养24h后换用诱导培养基，成骨诱导体系为：含10%FBS的高糖DMEM中添加地塞米松（10^-7mol/L）、维生素C（50μmol/L）和β-磷酸甘油（10mmol/L）。每3天更换新鲜培养基，诱导至4周时，用von Kossa染色骨结节鉴定晚期成骨。

实施例7成软骨诱导分化

本实施例是对实施例1中提供的BPS-SFM培养基以及对照组MSCM-SF中的P4代细胞进行成软骨诱导分化，按照以下步骤进行：

将脐带MSCs（实验组BPS-SFM培养基中的P4代MSCs、对照组MSCM-SF中的P4代MSCs）按3×10⁵个细胞接种于5ml含10%FBS的α-MEM培养基的15mL塑料尖底试管中，220×g低速离心8min，使细胞形成微团；更换为软骨诱导培养基：高糖DMEM中添加维生素C（50μg/mL）、地塞米松（2×10^-7mol/L）、1×ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）、丙酮酸钠（1mmol/L）、P/S（青/链霉素）、Pro（50μg/mL）和TGF-β3（10ng/mL）。每4天更换培养基，形成的微团在上述体系内培养4-5周后行HE染色分析软骨形态。

实施例5-7的三向分化结果见图3a-图3f所示，其中，图3a和图3b分别为BPS-SFM培养基和对照组MSCM-SF的成脂分化结果，图3c和图3d分别为BPS-SFM培养基和对照组MSCM-SF的成骨分化结果，图3e和图3f分别为BPS-SFM培养基和对照组MSCM-SF的成软骨分化结果。由图3a-图3f的内容可以看出，两种培养基中的MSCs具有相同的成脂、成骨、成软骨分化能力。

实施例8染色体核型分析

本实施例是对实施例1中提供的BPS-SFM培养基以及对照组MSCM-SF中的P8代细胞进行染色体核型分析，按照以下步骤进行：

收集在实验组BPS-SFM培养基和对照组MSCM-SF培养基中处于指数增殖期的P8代脐带MSCs，200×g离心5min；利用0.05%-0.2%的秋水仙碱水溶液处理2-4h，再用0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液处理3-4h后，用卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3，v/v）室温下固定30-60min，经90%酒精、80%酒精、70%酒精依次各浸泡0.5h后，滴片、晾片，进行染色体核型分析。细胞核型分析结果图见图4a和图4b，其中，图4a和图4b分别是BPS-SFM培养基和对照组的细胞核型分析结果。由图4a和图4b可以看出两种培养基中培养到P8代MSCs核型保持正常。

Claims

1.一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以该无血清培养基的体积计，其由以下成分组成：

α-MEM 10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188 100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes 5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu 5nM、Se 30nM、Zn 1mM、Ga 0.3mM、Cr 5μM、Mg 0.3mM、Mn 5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C 20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF 10ng/mL、b-FGF 10ng/mL、HGF 10ng/mL、VEGF 10ng/mL；

2.一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以该无血清培养基的体积计，其由以下成分组成：

α-MEM 10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188 100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes 5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu 5nM、Se 30nM、Zn 1mM、Ga 0.3mM、Cr 5μM、Mg 0.3mM、Mn 5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C 20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF 10ng/mL、b-FGF 10ng/mL、HGF 10ng/mL、VEGF 10ng/mL、原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB 10ng/mL、IGF-I 10ng/mL、GM-CSF 1-10ng/mL、TGF-β1-10ng/mL；

3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其中，所述的原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I 10ng/mL、GM-CSF 10ng/mL、TGF-β10ng/mL。

4.权利要求1-3任一项所述的用于培养间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其包括将各种成分与水混合之后利用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存的步骤。

5.权利要求1-3任一项所述的用于培养间充质干细胞的无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。