CN109609453B - 树鼩小胶质细胞培养基与其体外分离培养及纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种树鼩小胶质细胞培养基与其体外分离培养及纯化的方法，属于生物技术领域。本发明培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。本发明同时提供一种树鼩小胶质细胞体体外分离培养及纯化的方法，采用上述树鼩小胶质细胞培养基，包括消化脑组织、制备单细胞悬液、混合胶质细胞培养、小胶质细胞分离纯化等步骤，应用本发明树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法可以培养出纯度较高、活力较强的树鼩小胶质细胞，基本可以满足医学、生物学等研究领域对小胶质细胞相关实验研究的要求。

Description

树鼩小胶质细胞培养基与其体外分离培养及纯化的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种树鼩小胶质细胞培养基与其体外分离培养及纯化的方法。
背景技术
小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）的固有免疫细胞，属于单核巨噬细胞系，是CNS抵御病原入侵的一道重要的免疫防线。研究表明机体生理状态未受刺激时，处于静息状态的小胶质细胞发挥着清除细胞碎片、代谢废物、灭活细胞毒性物质的作用，其活化后，一方面发挥吞噬作用，并分泌神经源性保护因子促进神经修复，清除损伤；另一方面也能分泌一些炎症因子，加重炎症反应。活化的小胶质细胞起到神经保护与神经毒性的双重作用。现代临床研究表明，以帕金森疾病为代表的一类神经退行性疾病中，小胶质细胞的过度活化以及引起的一系列免疫反应在此类疾病病程进展中发挥了关键的作用。建立小胶质细胞的体外纯化培养体系是对其功能特性进行深入研究，以及以小胶质细胞为靶点的相关研究的基础和关键。
树鼩（tree shrew）属哺乳纲、攀鼩目，是一种形似松鼠的的小型哺乳动物，主要分布在热带和亚热带地区，我国主要分布在云南，广西和海南等地。树鼩作为一种新型实验动物，近年来我国在树鼩基础生物学及疾病动物模型研制方面取得了较大的进展。研究发现它在生物学特征、新陈代谢、生理生化和基因组等方面与人类近似，人与树鼩之间较人与啮齿类之间拥有更高的蛋白质相似度，进一步说明树鼩与灵长类亲缘关系更近，同时，通过基因组分析还发现树鼩在神经及免疫系统的分子信号通路与人类具有较高的同源性，且树鼩来源广泛，价格低，且已有学者成功建立树鼩帕金森病模型，可预测树鼩在帕金森疾病为代表的一类神经退行性疾病研究中具有良好的应用前景。
截止目前，虽然已经有关于大鼠、小鼠的小胶质细胞分离纯化及培养方法的报道，这些培养方法主要采用温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因法，但这些分离纯化及培养方法无法获取高产量、高纯度的小胶质细胞。且以往报道的关于小胶质细胞培养方法的培养基无法保证树鼩小胶质细胞在体外培养过程中增殖生长。因此如何克服树鼩小胶质细胞分离纯化及培养方法现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种树鼩小胶质细胞培养基与其体外分离培养及纯化的方法。本发明中的培养基可以有效延长和增加小胶质细胞在体外培养的时间和代次，细胞可以在长期的体外培养过程中增殖生长且保持细胞形态。本发明方法中分离、纯化操作步骤简单，具有产量高、纯度高和细胞活性强的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
树鼩小胶质细胞培养基，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。
本发明同时提供一种树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用上述树鼩小胶质细胞培养基，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生1-2d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养55-60min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立3-5min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，30-35min后更换培养基，将培养基全部更换为上述树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
进一步，优选的是，步骤（1）中，树鼩脑组织的皮质部分的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得到树鼩脑组织的皮质部分。
进一步，优选的是，步骤（1）中，消化时间为8-10min。
进一步，优选的是，步骤（1）中，消化时，采用移液器反复吹打15-20次。
进一步，优选的是，步骤（2）中，离心的速度为1300r/min，时间为5min。
进一步，优选的是，步骤（3）和步骤（4）中，已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶的制备方法为：取1mL 0.1-0.5mg/mL左旋多聚赖氨酸加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗。
进一步，优选的是，步骤（3）中，细胞培养瓶为25cm2的培养瓶。
进一步，优选的是，步骤（4）中，培养9d后，再进行细胞纯化。
本发明中MGS为小胶质细胞生长因子，B27是一种神经细胞培养添加剂。
本发明中半量换液可以解释为，将原培养基中的一半体积的培养基更换为新的培养基。
本发明中的小胶质细胞纯化方法定为直立手拍法，具体操作为在混合胶质细胞培养的第9d进行分离，首先把细胞培养瓶直立4-5min，然后轻柔拍打细胞培养瓶，待大部分上层细胞脱落悬浮后，利用差速贴壁再次纯化。直立手拍法结合差速贴壁操作简便，能减少机械损伤，避免产生泡沫，细胞产量高、活性好，是纯化分离树鼩小胶质细胞最适合的方法。
本发明树鼩小胶质细胞培养基中加入了1%的MGS（小胶质细胞生长补剂），小胶质细胞生长补剂（MGS）是一种培养基补剂，用于体外培养正常人体小胶质细胞的最佳生长。它是一种无菌浓缩(100X)溶液，含有生长因子、激素和培养正常人类小胶质细胞所必需的蛋白质。此添加物提供一个最佳平衡的生长环境，最大限度地促进正常人体小胶质细胞的体外生长。而本实验把此添加物用于树鼩小胶质细胞的培养，取得了很好的效果，经试验验证，通过MGS的使用，可以有效小胶质细胞在体外培养过程中的衰老周期，细胞可以在长期（至少在P2代以内，约10d）的体外培养过程中增殖生长且保持细胞形态。不添加MGS的则完全无法达到此效果，且小胶质细胞生长增殖困难，无法传代。
B27是无血清细胞培养添加剂，常用于神经元的培养，可作为神经细胞基础培养基的添加剂。文献报道B27可以用来作为星形胶质细胞培养的添加剂，目前没有应用于小胶质细胞培养的相关报道。本发明将B27添加进小胶质细胞培养基，发现B27添加剂能抑制成纤维细胞生长，维持小胶质细胞形态和促进小胶质细胞贴壁生长。
经实验验证：不添加MGS和B27，小胶质细胞纯化后增殖生长困难，无法传代；只添加MGS，小胶质细胞贴壁时间延长，纯化后30min换液时还有大量细胞未贴壁；只添加B27，纯化后30min换液时贴壁细胞的细胞数量比只添加MGS的多，但小胶质细胞增殖速度慢；MGS和B27共同使用能达到最好的效果，小胶质细胞能快速贴壁，培养24h可见细胞开始变形，呈梭形，72h后可见大部细胞分处于静息状态，形态表现为多极梭形、分支状、杆状等不规则形态，贴壁细胞分裂成不同大小的细胞集落。细胞集落逐渐扩大，5d即可达80%融合。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
（1）应用本发明树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法可以培养出纯度较高、活力较强的树鼩小胶质细胞，以满足后续的实验需求；
（2）本发明方法中分离、纯化操作步骤简单，省时，具有产量高、纯度高和细胞活性强的特点，基本可以满足医学、生物学等研究领域对小胶质细胞相关实验研究的要求。
（3）本发明中通过树鼩小胶质细胞培养基的使用，小胶质细胞能快速贴壁（30min内贴壁），增殖率可达63%。
（4）本发明中通过树鼩小胶质细胞培养基的使用，可以有效延长和增加小胶质细胞在体外培养的时间和代次，细胞可以在长期（至少在P2代以内，10d内）的体外培养过程中增殖生长且保持形态，且能传2代，而不使用这个培养基配方小胶质细胞增殖困难，无法传代。
附图说明
图1是混合培养第9天的混合神经胶质细胞形态图(100X)；其中，箭头所指为小胶质细胞；细胞培养至第9天，细胞呈分层生长，下层为星形胶质细胞为主伴有其他类型的胶质细胞，上层呈圆形，胞体较小，折光性较强，呈半悬浮或悬浮生长的为小胶质细胞；
图2是纯化后3天小胶质细胞形态图(100X)；小胶质细胞直立手拍法分离纯化后第3d，大部细胞分处于静息状态，形态表现为多极梭形、分支状、杆状等不规则形态；
图3是树鼩小胶质细胞免疫荧光鉴定结果图(100X)；用小胶质细胞标志物CD11b（OX42）进行免疫荧光染色鉴定，被染色的均是小胶质细胞，形态清晰。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数。
实施例1
树鼩小胶质细胞培养基，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。
一种树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用本实施例上述树鼩小胶质细胞培养基，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生1.5d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养58min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立4min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，33min后更换培养基，将培养基全部更换为上述树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
实施例2
树鼩小胶质细胞培养基，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。
一种树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用本实施例上述树鼩小胶质细胞培养基，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生1d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养55min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立3min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，30min后更换培养基，将培养基全部更换为上述树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
步骤（1）中，树鼩脑组织的皮质部分的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得到树鼩脑组织的皮质部分。
步骤（1）中，消化时间为8min。
步骤（1）中，消化时，采用移液器反复吹打15次。
步骤（2）中，离心的速度为1300r/min，时间为5min。
步骤（3）和步骤（4）中，已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶的制备方法为：取1mL0.1mg/mL左旋多聚赖氨酸加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗。
步骤（3）中，细胞培养瓶为25cm2的培养瓶，差速贴壁处理的时间为1h。
步骤（4）中，培养9d后，再进行细胞纯化。
实施例3
树鼩小胶质细胞培养基，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。
一种树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用本实施例上述树鼩小胶质细胞培养基，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生2d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养60min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立5min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中， 35min后更换培养基，将培养基全部更换为上述树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
步骤（1）中，树鼩脑组织的皮质部分的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得到树鼩脑组织的皮质部分。
步骤（1）中，消化时间为10min。
步骤（1）中，消化时，采用移液器反复吹打20次。
步骤（2）中，离心的速度为1300r/min，时间为5min。
步骤（3）和步骤（4）中，已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶的制备方法为：取1mL0.5mg/mL左旋多聚赖氨酸加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗。
步骤（3）中，细胞培养瓶为25cm2的培养瓶，差速贴壁处理的时间为1h。
步骤（4）中，培养9d后，再进行细胞纯化。
实施例4
树鼩小胶质细胞培养基，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04%B27。
一种树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用本实施例上述树鼩小胶质细胞培养基，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生1.5d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养57min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立4min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，32min后更换培养基，将培养基全部更换为上述树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
步骤（1）中，树鼩脑组织的皮质部分的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得到树鼩脑组织的皮质部分。
步骤（1）中，消化时间为9min。
步骤（1）中，消化时，采用移液器反复吹打18次。
步骤（2）中，离心的速度为1300r/min，时间为5min。
步骤（3）和步骤（4）中，已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶的制备方法为：取1mL0.3mg/mL左旋多聚赖氨酸加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗。
步骤（3）中，细胞培养瓶为25cm2的培养瓶，差速贴壁处理的时间为1h。
步骤（4）中，培养9d后，再进行细胞纯化。
应用实例
1.树鼩神经胶质细胞混合培养
步骤（1），取1只新生1d的树鼩，75%酒精中浸泡消毒5min，无菌环境中断头处死，完整取下脑部。无菌环境中经预冷至4℃D-Hanks液反复冲洗后置于盛有4℃的D-Hanks液的培养皿中，在显微镜下去除头皮，暴露头骨，用眼科剪剪开头骨，小心取出脑组织，仔细剔除表面的血管和脑膜，去除小脑换完脑干，只留下皮质部分，使用眼科剪充分剪碎脑组织，转入50ml离心管内，加入3mL的0.25%胰酶消化10min，并用移液器反复吹打18次，消化至肉眼观察无明显的脑组织团块。
步骤（2），加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，一次性细胞滤网过滤，取滤液，1300r/min离心5min，弃上清；之后4ml加入含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基，吹打重悬，得到单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养55-60min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
此步骤培养至第9d，得到的是混合胶质细胞（图1）。倒置显微镜下可观察到混合胶质细胞铺满瓶底，细胞成分层生长，小胶质细胞生长在最上层，呈较强折光性，半贴壁或者悬浮生长。
2树鼩小胶质细胞的纯化
待细胞培养9d，纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基，手拍前，轻柔吸除2ml培养基（留用），将细胞培养瓶直立4-5min，然后手拍法轻轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，30min后完全更换培养基，去除少突胶质细胞及其他杂质细胞，将培养基全部更换为本发明所述的树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同，均为2mL。此步骤得到的是纯树鼩小胶质细胞（图2）。细胞处于静息状态，形态表现为多极梭形、分支状、杆状等不规则形态。
3树鼩小胶质细胞免疫荧光染色鉴定
小胶质细胞纯化培养3d后，接种于放置了圆形爬片的24孔板，第二天进行免疫荧光染色鉴定，选择小胶质细胞的标志物CD11b（OX42）免疫细胞荧光染色。步骤如下：
（1）用0.01mmol/L PBS液洗3次，每次5分钟，预冷的4%多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，每次5min，自然干燥。
（2）Triton X-100室温孵育10min以破膜，PBS洗三次，每次5min。
（3）滴加0.01mmol/L PBS稀释好的正常山羊血清封闭液（美仑生物，MB4508）（稀释度为5），37℃孵育20min，不洗。
（4）滴加稀释好的CD11b单克隆抗体（稀释度为200），置于湿盒，4℃过夜，PBS漂洗3次，每次3min。
（5）滴加0.01mmol/L PBS稀释好的二抗结合FITC的山羊抗兔IgG（绿色荧光标记），37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次3min。
（6）滴加200ul DAPI染色液，覆盖玻片上的样品即可，室温避光孵育5min，对标本进行核染，然后吸出DAPI染色液，PBS漂洗4次，每次5 min。
（7）捞取爬片，抗荧光衰减封片剂封片（美仑生物，MA0222），免疫荧光显微镜下观察拍片。此步骤得到的是树鼩小胶质细胞免疫荧光染色结果（图3）。
鉴定结果：此方法得到的小胶质细胞经免疫荧光染色鉴定，细胞均被染色，形态清晰，确定为小胶质细胞，纯度可达到96%以上。
对比本发明中的各个步骤及其参数，结果如下：
步骤（1）中，实验发现，消化时间超过10min，过度消化会影响小胶质细胞的贴壁能力不利于贴壁，少于10min，消化时间不够，导致小胶质细胞数量减少。消化时间10min是最好的时间点。
步骤（3）中，接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶，能促进细胞的贴壁，脑组织中的成纤维细胞最先贴壁，经过差速贴壁处理减少杂细胞。省略这一步骤，导致杂细胞过多，使小胶质细胞的产量和纯度降低。
步骤（4）中，培养至第9d进行纯化，此时期的小胶质细胞增殖已经达到顶峰，且瓶底的星形胶质细胞与瓶壁粘附力较高，分离时使小胶质细胞的脱落不会有星形胶质细胞混入；大于9d时，星形胶质细胞生长的速度较快，长成多层会导致小胶质细胞很难分离，且容易混入较多其他杂细胞，使小胶质细胞产量和纯度降低。
步骤（4）中，纯化时，先吸出一半培养基留用，待小胶质细胞纯化之后和树鼩小胶质细胞培养基等体积混合加入培养瓶，留用的培养基中有星形胶质细胞分泌的神经源性因子，能促进小胶质细胞的生长。不加留用的培养基，小胶质细胞生长速度减慢，纯化后6-7d才能达到80%融合；加留用的培养基，纯化的小胶质细胞5d就能达到80%的融合。
步骤（4）中，在轻柔拍打细胞瓶之前先把细胞瓶直立4-5min，能使上层的小胶质细胞更容易脱落且所需时间短（10min），获得的细胞数量更多。省略这一步骤，单单采用手拍法轻柔拍打培养瓶（15min），耗时，且还会有部分细胞未脱落，减少小胶质细胞的数量。
步骤（4）中，纯化后30min完全换液，省略这一步骤，培养瓶中会有少部分少突胶质细胞，降低小胶质细胞的纯度。而低于30min，大部分小胶质细胞未贴壁，导致小胶质细胞数量减少，超过30min，其他细胞如少突胶质细胞贴壁，降低小胶质细胞的纯度。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.树鼩小胶质细胞培养基，其特征在于，该培养基以DMEM/F12完全培养基为基础培养基，并在基础培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗、1%MGS和0.04% B27。
2.树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，采用权利要求1所述的树鼩小胶质细胞培养基，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），消化脑组织：取新生1-2d的树鼩脑组织的皮质部分，剪碎，采用0.25%胰酶消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；
步骤（2），制备单细胞悬液：加入与步骤（1）采用的0.25%胰酶等体积的含10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F12完全培养基终止消化，再次反复吹打成单细胞悬液，过滤，取滤液，离心，弃上清；之后加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基吹打重悬成单细胞悬液；
步骤（3），混合胶质细胞培养：将步骤（2）第二次得到的单细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养55-60min后进行差速贴壁处理，培养3d后完全更换成新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；之后每3d更换培养基一次，每次半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基；
步骤（4），小胶质细胞分离纯化：细胞纯化前1d半量换液，换为新的含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12的完全培养基；纯化时，先吸出一半培养基留用，将细胞培养瓶直立3-5min，然后轻轻拍打细胞瓶，镜下观察出现大量悬浮细胞时，停止拍打，得到细胞悬液；之后将细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，30-35min后更换培养基，将培养基全部更换为权利要求1所述的树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基的混合培养基；
其中，混合培养基中树鼩小胶质细胞培养基和之前吸出留用的一半培养基体积相同。
3.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（1）中，树鼩脑组织的皮质部分的获得方法为：将树鼩脑组织剔除表面的血管和脑膜，再去除小脑和脑干，即得到树鼩脑组织的皮质部分。
4.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（1）中，消化时间为8-10min。
5.根据权利要求2或4所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（1）中，消化时，采用移液器反复吹打15-20次。
6.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（2）中，离心的速度为1300r/min，时间为5min。
7.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶的制备方法为：取1mL 0.1-0.5mg/mL左旋多聚赖氨酸加入到细胞培养瓶中，摇匀铺满瓶底，静置5min，吸出液体并将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱过夜烘干，接种前用PBS润洗。
8.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞培养瓶为25cm2的培养瓶。
9.根据权利要求2所述的树鼩小胶质细胞体外分离培养及纯化的方法，其特征在于，步骤（4）中，培养7-9d后，再进行细胞纯化。
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