WO2023167484A1 - 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023167484A1
WO2023167484A1 PCT/KR2023/002770 KR2023002770W WO2023167484A1 WO 2023167484 A1 WO2023167484 A1 WO 2023167484A1 KR 2023002770 W KR2023002770 W KR 2023002770W WO 2023167484 A1 WO2023167484 A1 WO 2023167484A1
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WO
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stem cells
composition
preventing
mesenchymal stem
exosomes
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PCT/KR2023/002770
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Inventor
우세준
홍혜경
서수인
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서울대학교병원
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating degenerative retinal diseases, and more particularly, to a composition for preventing or treating degenerative retinal diseases containing exosomes extracted from mesenchymal stem cells.
  • Retinal degeneration disease is a general term for diseases that eventually lead to blindness due to pathological changes caused by genetic abnormalities, aging, inflammation, and vascular diseases in the retina, which is the nerve tissue of the eye, and the macula, which is responsible for the most important function in the retina. do.
  • Degeneration of retinal cells is a pathological mechanism of major eye diseases such as macular degeneration and inherited retinal diseases. Because retinal cells, like other cells in the nervous system, have a poor ability to divide and regenerate, there is no effective method to regenerate or replace damaged cells when retinal cells are lost, so there is no treatment method for retinal cell degeneration to date. am. There is an urgent need for research on treatment techniques that prevent or delay degeneration of retinal cells.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition for preventing or treating retinal degenerative diseases that can prevent or delay degeneration of retinal cells.
  • composition for preventing or treating retinal degenerative diseases may contain exosomes extracted from human-derived mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • the mesenchymal stem cells may be tonsillar-derived mesenchymal stem cells.
  • the exosomes may be contained at a concentration of 1 ⁇ 10 10 to 5 ⁇ 10 11 particles/ml.
  • the exosome may have a size of 100 to 150 nm.
  • the retinal degenerative disease may be at least one selected from the group consisting of retinitis pigmentosa (RP), age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, hereditary retinal disease, uveitis, retinal vascular occlusion, optic nerve disease, and glaucoma. .
  • stem cell therapy by directly injecting stem cells into the eyeball has been attempted to treat retinal degenerative disease, but many cases have been reported in which the intraocularly injected stem cells are transformed into fibroblasts, resulting in blindness. It became. Therefore, it is difficult to immediately apply stem cell therapy to clinical practice for reasons of safety.
  • the present invention intraocularly injects a composition containing exosomes extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells as an active ingredient, potential risks due to stem cell therapy can be avoided.
  • Exosomes included in the composition of the present invention are extracellular vesicles (EV), which are mediators that deliver secreted factors of stem cells, and have anti-vascular, anti-inflammatory, anti-fibrotic, immunomodulatory, and neuroprotective effects.
  • the composition of the present invention has an excellent effect in preventing or treating retinal degenerative diseases by suppressing the toxicity of substances that induce apoptosis of retinal cells.
  • Figure 2 is a graph measuring the cell viability of RPE19 cells by the exosomes of the present invention when treated with atRAL.
  • FIG. 3 is a photograph of RPE19 cells of FIG. 2 observed under a microscope before being treated with the WST-1 assay.
  • Figure 4 is a graph measuring the inhibitory effect of atRAL toxicity by the exosomes of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing thicknesses of the external granule layer (ONL) and the inner granule layer (INL) in the Pde6b gene knockout mouse model according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating retinal degenerative diseases containing exosomes extracted from human-derived mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • “Mesenchymal stem cells” of the present invention are undifferentiated stem cells that have the ability to differentiate into two or more new cells (eg, bone cells, chondrocytes, muscle cells, fat cells, etc.) while having self-renewal ability. it means.
  • the "mesenchymal stem cells” of the present invention may be human-derived, animal-derived or plant-derived stem cells, preferably human-derived mesenchymal stem cells, and more preferably tonsil-derived mesenchymal stem cells (Tonsil-derived mesenchymal stem cells). Mesenchymal Stem Cell, T-MSC).
  • the "tonsil derived mesenchymal stem cell” of the present invention is a tissue that is located in the back of the neck and the back of the nose to primarily defend our body from substances such as bacteria invading from the outside and at the same time act as a lymphatic epithelial immune tissue. It refers to undifferentiated stem cells derived from the amygdala that have the ability to differentiate into two or more new cells while having the ability to self-renew.
  • the "exosome” of the present invention is an extracellular vesicle (EV), which serves to deliver living materials such as proteins, fats, metabolites, and nucleic acids to recipient cells.
  • EV extracellular vesicle
  • prevention refers to all activities that inhibit or delay the onset of retinal degenerative diseases by administering a composition containing exosomes extracted from tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention as an active ingredient.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change the symptoms of retinal degenerative disease by administering a composition containing exosomes extracted from tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention as an active ingredient.
  • improvement refers to all actions that improve the poor state of retinal degenerative disease by administering or ingesting the composition of the present invention to a subject.
  • retinal degeneration disease refers to a disease that causes pathological changes due to genetic abnormality, aging, inflammation, vascular disease, etc. in the retina, which is the nerve tissue of the eye, and the macula, which is responsible for the most important function in the retina, eventually leading to blindness.
  • retinal degenerative diseases include retinitis pigmentosa (RP), age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, hereditary retinal disease, uveitis, retinal vascular occlusion, and optic nerve disease. , glaucoma, etc.
  • exosomes extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells may have an average size (or average diameter) of 100 to 150 nm.
  • the exosome is at a concentration of 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 12 particles/ml, preferably at a concentration of 1 ⁇ 10 10 to 1 ⁇ 10 12 particles/ml, More preferably, it may be contained at a concentration of 1 ⁇ 10 10 to 5 ⁇ 10 11 particles/ml.
  • T-MSC human tonsil-derived mesenchymal stem cells
  • the conditioned medium used in this example is the tonsillar-derived mesenchyme prepared by Cellatoz Therapeutics Co., Ltd. using a human-derived material approved by the Institutional Review Board (IRB) of Ewha Medical Center (EUMC 2019-08-004).
  • a conditioned medium of stem cells (Tonsil derived Mesenchymal Stem Cell ew , T-MSC ew ) was used.
  • T-MSC tonsillar-derived mesenchymal stem cells
  • various methods known in the art may be used.
  • stem cells are cultured in a culture medium (DMEM), then subcultured in a serum-free and antibiotic-free medium, cell culture supernatant is recovered, and the recovered cell culture supernatant is centrifuged and 220nm pore membrane filter Filter to separate and extract exosomes.
  • the culture medium was centrifuged at 300 xg for 15 minutes and at 2000 xg for 10 minutes to remove cell debris, and filtration was performed with a 220nm bottle-top membrane (Cell debris removal step).
  • the storage agent was removed by flushing with 250 ml of DI water (Flush step).
  • 250 ml or more of DPBS (Ca 2+ , Mg 2+ ) was flushed to create a buffer environment in the device (Buffer conditioning step).
  • 250 ml medium was concentrated to a volume of 5 to 10 ml using a 300 kDa MWCO TFF filter (Concentration step). At this time, the feed pressure was controlled not to exceed 0.5 bar.
  • DPBS 7 to 10 times the concentrated volume was added, and diafiltration was performed again to a volume of 5 to 10 ml (Diafiltration step). At this time, more than 99% of small molecule removal was possible when diluted more than 7 times.
  • filtration was performed with a 220 nm bottle-top membrane (product recovery step). Information on the extracted exosomes is shown in Table 1 below.
  • RPE19 cells which are retinal pigment epithelium (RPE) cells, were dispensed in 5 ⁇ 10 3 cells/well, respectively, in a 96 well plate, and cultured in DMEM/F12 (10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) cell culture medium for 24 hours. cultured. After the culture, the existing culture medium is removed and replaced with a new cell culture medium, and then the exosomes extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells (abbreviated as 'MSC derived EV' or 'EV') are 0 or 1 ⁇ The wells were treated with various concentrations from 10 8 to 5 ⁇ 10 10 particles/ml.
  • DMEM/F12 10% FBS, Penicillin-Streptomycin added
  • EZ-cytox cell viability assay kit (WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea) was added 24, 48, and 72 hours after exosome (EV) treatment, and reacted for 1.5 hours in an incubator.
  • OD (optical density) values were measured at 450 nm using a microplate reader.
  • FIG. 1 is a graph showing the toxicity test results for exosomes of the present invention.
  • the OD value of the wells cultured with RPE19 cells not treated with exosomes (EV) as a control group (None) was set as 100%, and the OD values of the remaining experimental groups were converted based on this value.
  • exosomes (EV) were treated at various concentrations for 24, 48, and 72 hours, but compared to the control group (None), cell viability was confirmed to be about 90% or higher. No cytotoxicity was observed.
  • RPE19 cells were each dispensed in 5 ⁇ 10 3 cells/well in a 96 well plate and cultured for 24 hours in DMEM/F12 (10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) cell culture medium. After the culture, the existing culture medium is removed and replaced with a new cell culture medium, all-trans-retinal (abbreviated as 'atRAL'), a toxic substance that induces apoptosis of retina cells. ) at 25 ⁇ M and 50 ⁇ M.
  • exosomes (MSC derived EV) extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells were treated in wells at concentrations tenfold from 0 or 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 particles/ml.
  • EZ-cytox cell viability assay reagent (WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea) was added and reacted for 1.5 hours in an incubator. OD values were measured at 450 nm using a microplate reader.
  • Figure 2 is a graph measuring the cell viability of RPE19 cells by the exosomes of the present invention when treated with atRAL.
  • the OD value of the wells cultured with RPE19 cells not treated with exosomes (EV) as a control group (None) was set as 100%, and the OD values of the other experimental groups were converted based on this.
  • the experimental group treated with atRAL 25 ⁇ M without adding exosomes (EV) was confirmed to have about 30% cell viability compared to the control group (None), and exosomes (EV ) was not added and the experimental group treated with atRAL 50 ⁇ M was confirmed to have about 10% cell viability compared to the control group (None).
  • FIG. 3 is a photograph of RPE19 cells of FIG. 2 observed under a microscope before being treated with the WST-1 assay.
  • the number of cells decreased and the shape of the cells changed to round, but exosomes (EV) were mixed with atRAL at 1 ⁇ 10 10 particles/ml.
  • EV exosomes
  • RPE1 cells were each dispensed at 5 ⁇ 10 3 cells/well in a 96 well plate and cultured for 24 hours in DMEM/F12 (10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) cell culture medium. After the culture, the existing culture medium was removed, exchanged with a new cell culture medium containing 50 nM of CytoTox Green dye (Incucyte CytoTox Green, Sartorius, cat# 4633) that stains dead cells, and then treated with 50 ⁇ M of atRAL. . In addition, exosomes (MSC derived EV) extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells were treated in wells at concentrations tenfold from 0 or 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 particles/ml.
  • DMEM/F12 10% FBS, Penicillin-Streptomycin added
  • FIG 4 is a graph measuring the inhibitory effect of atRAL toxicity by the exosomes of the present invention, and is a result of measuring Green dye intensity values for each time. As shown in Figure 4, in the case of the experimental group (B) treated with atRAL reagent without adding exosomes (EV), the green dye intensity value steadily increased until about 18 hours due to the increase in apoptotic cells from one hour later.
  • RPE1 cells were each dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells/well on an 8 well chamber slide and cultured for 24 hours in DMEM/F12 (10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) cell culture medium. After the culture, the existing culture medium was removed and replaced with a new cell culture medium, and exosomes (MSC derived EV) extracted from tonsil-derived mesenchymal stem cells tagged with far-red fluorescence were added to 5 ⁇ 10 9 particles. /ml. After 3 hours, 6 hours, 16 hours, and 24 hours, the culture medium was removed, and cells were fixed using 4% paraformaldehyde (PFA) and observed under a fluorescence microscope after DAPI staining.
  • DMEM/F12 10% FBS, Penicillin-Streptomycin added
  • FIG. 5 shows a photomicrograph of fluorescently labeled exosomes according to this Example. As shown in FIG. 5 , it was confirmed that exosomes (EV) were present in cells even after 24 hours of exosome (EV) treatment. That is, through this Example, it was confirmed that the exosomes moved directly into the RPE1 cytoplasm to produce a therapeutic effect.
  • EV exosomes
  • exosomes extracted from tonsillar-derived mesenchymal stem cells was confirmed in vivo using PDE6b knockout rats.
  • intravitreous injection of exosome (EV) 3 ⁇ 10 11 particles/ml was performed, followed by fundus photography.
  • concentration of exosomes (EV) in rat vitreous was 1.5 ⁇ 10 7 to 2.3 ⁇ 10 7 particles/ ⁇ l.
  • 15 days after exosome (EV) injection a rat eye ball was extracted to prepare a paraffin block.
  • a slide was prepared by sectioning a rat eyeball made of paraffin block to a thickness of 4 ⁇ m, and then H&E staining was performed. Using a slide scanner, the outer nuclear layer (ONL) and the inner granule layer (ONL) at 500, 750, 1000, and 1500 ⁇ m of the retina from left to right based on the optic disc The thickness of the nuclear layer (INL) was measured.
  • 6 is a graph showing thicknesses of the external granule layer (ONL) and the inner granule layer (INL) in the Pde6b gene knockout mouse model according to an embodiment of the present invention.
  • the sample number was covered and measured blindly, and the average value was derived by measuring three times for each part.
  • the left eye not injected with exosomes (EV) was used as a control group (#2-25L, #2-29L, #2-30L) and an experimental group (#2-25R, #2-29R, #2-30R). Only the right eye used was injected with exosomes (EV).
  • FIG. 6 it was confirmed that the thickness of the ONL layer of the right eye injected with exosomes (EV) was increased compared to that of the left eye as a control group.
  • the increase in the thickness of the ONL on only one side of the optic disc in the experimental group was due to injection of exosomes (EV) only in that direction.

Abstract

망막세포의 변성을 예방하거나 지연시킬 수 있는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다. 이 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물은, 인체 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유한다.

Description

중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성에 관한 것이다.
망막변성(retinal degeneration) 질환은 안구의 신경 조직인 망막과, 망막에서 가장 중요한 기능을 담당하는 황반에 유전적 이상, 노화, 염증, 혈관질환 등에 의한 병적인 변화가 발생하여 결국 실명에 이르는 질환을 총칭한다. 망막세포의 변성은 황반변성, 유전성 망막질환 등 중요 안과질환의 병리 기전이다. 망막세포는 신경계의 다른 세포와 마찬가지로 분열 및 재생 능력이 떨어지기 때문에, 망막세포가 소실될 경우 재생시키거나 손상된 세포를 대체할 수 있는 효과적인 방법이 없어서 현재까지 망막세포 변성에 대한 치료방법은 없는 상황이다. 망막세포의 변성을 막거나 지연시키는 치료 기술에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 망막세포의 변성을 예방하거나 지연시킬 수 있는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물은, 인체 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 엑소좀은 1×1010 내지 5×1011 particles/ml의 농도로 함유될 수 있다.
상기 엑소좀은 100 내지 150 nm 크기를 가질 수 있다.
상기 망막변성질환은 망막색소변성증(RP), 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
종래에 망막변성질환을 치료하기 위해 줄기세포를 안구 내에 직접 주사하는 줄기세포 치료가 시도되었으나, 안구 내 주사된 줄기세포가 섬유아세포(fibroblast)로 전환(transformation)되어 실명을 초래한 사례가 다수 보고되었다. 따라서, 안전성을 이유로 줄기세포 치료를 임상에 바로 적용하기는 어렵다. 반면 본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 안구 내에 주사하기 때문에, 줄기세포 치료에 기인한 잠재적 위험을 피할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함된 엑소좀은 줄기세포의 분비 인자를 전달하는 매개체인 세포외소포체(extracellular vesicles, EV)로서, 항혈관, 항염증, 항섬유화, 면역조절, 신경보호 등의 효능을 가진다. 본 발명의 조성물은 망막세포(retina cell)의 세포자멸사(apoptosis)를 유발하는 물질의 독성을 억제함으로써 망막변성질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 엑소좀에 대한 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 atRAL 처리 시 본 발명의 엑소좀에 의한 RPE19 cell의 세포 생존능을 측정한 그래프이다.
도 3은 도 2의 RPE19 cell을 WST-1 assay로 처리하기 전에 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 엑소좀에 의한 atRAL 독성의 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 5는 본 실시예에 따라 형광 표지된 엑소좀의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델에서 외과립층(ONL)과 내과립층(INL)의 두께를 측정한 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명은 인체 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 "중간엽 줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포(예를 들어, 뼈 세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등)로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 "중간엽 줄기세포"는 인체 유래, 동물 유래 또는 식물 유래 줄기일 수 있고, 바람직하게는 인체 유래 중간엽 줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cell, T-MSC)일 수 있다.
본 발명의 "편도 유래 중간엽 줄기세포"는 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 발명의 "엑소좀(exosome)"은 세포외소포체(extracellular vesicles, EV)로서 단백질, 지방, 대사물질(metabolite), 핵산 등과 같은 생체 유래 물질을 수용 세포로 전달하는 역할을 한다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 망막변성질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "치료"는 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 망막변성질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 망막변성질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "망막변성질환"이란 안구의 신경 조직인 망막과, 망막에서 가장 중요한 기능을 담당하는 황반에 유전적 이상, 노화, 염증, 혈관질환 등에 의한 병적인 변화가 발생하여 결국 실명에 이르는 질환을 총칭한다. 예를 들어, 망막변성질환으로는 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP), 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환, 녹내장 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 100 내지 150 nm 평균 크기(또는 평균 직경)을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에는 상기 엑소좀이 1×107 내지 1×1012 particles/ml의 농도로, 바람직하게는 1×1010 내지 1×1012 particles/ml의 농도로, 더욱 바람직하게는 1×1010 내지 5×1011 particles/ml의 농도로 함유될 수 있다.
실시예 1. 인체 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)로부터 엑소좀의 추출
본 실시예에 사용된 조건배지는 이화의료원 IRB(Institutional Review Board)에서 승인(EUMC 2019-08-004)을 받은 인체 유래물을 사용하여 (주)셀라토즈테라퓨틱스에서 제조한 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil derived Mesenchymal Stem Cellew, T-MSCew)의 조건배지를 사용하였다.
엑소좀을 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)로부터 추출하는 방법으로는 당업계에 알려진 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포를 배양배지(DMEM)에 배양한 다음, 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대배양하고, 세포 배양 상층액을 회수하고, 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하고 220nm pore membrane filter로 여과하여 엑소좀을 분리하여 추출한다. 구체적으로, 배양배지를 300 x g, 15분간 그리고 2000 x g, 10분간 원심 분리하여 세포 파쇄물(cell debris)를 제거하고 220nm bottle-top membrane으로 filtration을 진행하였다(Cell debris removal 단계). 이어서 DI water 250 ml로 플러싱하여 storage agent를 제거하였다(Flushing 단계). DPBS(Ca2+, Mg2+) 250 ml 이상으로 플러싱하여 장치 내에 buffer 환경을 조성하였다(Buffer conditioning 단계). 250 ml 배지를 300 kDa MWCO TFF filter를 이용하여 5 내지 10ml 부피까지 농축(concentration)을 진행하였다(Concentration 단계). 이 때 feed pressure가 0.5bar를 넘지 않도록 제어하였다. Concentrated volume의 7 내지 10배 DPBS를 추가하고 다시 5 내지 10 ml 부피까지 diafiltration을 진행하였다(Diafiltration 단계). 이 때 7배 이상 희석 시 99% 이상의 small molecule removal이 가능하였다. 샘플 회수 후, 220nm bottle-top membrane으로 filtration을 진행하였다(Product recovery 단계). 이와 같이 추출된 엑소좀의 정보는 아래 표 1과 같다.
Total volume 5 ml
Mode size 114.2　±　7.2 nm
Number concentrations 2.94Х1011　± 2.97Х1010　particles/ml
Protein concentrations 98.31 mg/ml
실시예 2. 엑소좀 독성 실험(Exosome toxicity test in vitro, RPE19)
망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포인 RPE19 cell을 96 well plate에 각각 5×103 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(이를 'MSC derived EV' 또는 'EV'라 약칭함)을 0 또는 1×108 부터 5×1010 particles/ml까지 다양한 농도로 상기 well에 처리하였다. 엑소좀(EV) 처리 후 24, 48, 72 시간 뒤에 EZ-cytox 세포생존율 분석 시약(WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea)을 추가하고, 배양기에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450nm에서 OD(optical density)값을 측정하였다.
도 1은 본 발명의 엑소좀에 대한 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 1에서, 대조군(None)으로 엑소좀(EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 본 실험군의 경우 엑소좀(EV)을 다양한 농도로 24, 48, 72시간 동안 처리하였으나 대조군(None)에 비해 약 90% 이상의 세포 생존능(cell viability)를 나타내는 것으로 확인되어 세포 독성은 관찰되지 않았다.
실시예 3. 효능 실험(Efficacy test in vitro, RPE19)
RPE19 cell을 96 well plate에 각각 5×103 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, 망막세포(retina cell)의 세포자멸사(apoptosis)를 유발하는 독성물질인 all-trans-retinal(이를 'atRAL'이라 약칭함)을 25 μM 및 50 μM로 처리하였다. 여기에 추가로 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 0 또는 1×107부터 1×1010 particles/ml까지 10배수의 농도로 well에 처리하였다. 이로부터 3시간 뒤에 EZ-cytox 세포생존율 분석 시약(WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea)을 추가하고, 배양기에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 OD값을 측정하였다.
도 2는 atRAL 처리 시 본 발명의 엑소좀에 의한 RPE19 cell의 세포 생존능을 측정한 그래프이다. 도 2에서, 대조군(None)으로 엑소좀(EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 25 μM을 처리한 실험군은 대조군(None)에 비해 약 30%의 세포 생존능(cell viability)를 가지는 것으로 확인되었고, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 50 μM을 처리한 실험군은 대조군(None)에 비해 약 10%의 세포 생존능(cell viability)를 가지는 것으로 확인되었다. 반면 엑소좀(EV)을 추가하여 처리한 경우 이러한 세포 생존능의 감소 현상은 약화되는 것으로 확인되었다. 특히 atRAL 25 μM에 엑소좀(EV)을 1×1010 particles/ml로 처리한 실험군의 세포 생존능(cell viability)은 약 85%로 나타났으며, atRAL 50μM에 엑소좀(EV)을 1×1010 particles/ml로 처리한 실험군의 세포 생존능(cell viability)은 약 90%로 나타났다. 따라서 위 실험을 통해 atRAL에 의한 망막 독성이 본 발명의 엑소좀(EV)에 의해 억제되는 것이 확인되었다.
도 3은 도 2의 RPE19 cell을 WST-1 assay로 처리하기 전에 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV) 처리 없이 atRAL만 처리한 실험군의 경우 세포의 수도 적어지고 세포의 모양이 둥글게 바뀌었으나, 엑소좀(EV)을 1×1010 particles/ml로 atRAL과 함께 처리한 경우 대조군(None) well과 비교하여 세포 모양에 큰 차이가 없는 것이 확인되었다.
실시예 4. 효능 실험(Efficacy test in vitro, RPE1)
RPE1 cell을 96 well plate에 각각 5×103 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후 기존 배양배지를 제거하고, 사멸된 세포에 염색되는 CytoTox Green dye(Incucyte CytoTox Green, Sartorius, cat#4633) 50 nM을 포함한 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, atRAL을 50 μM로 처리하였다. 여기에 추가로 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 0 또는 1×107부터 1×1010 particles/ml까지 10배수의 농도로 well에 처리하였다.
이를 Incucyte live cell imaging 장비(Sartorius)를 사용하여 한 시간마다 bright field로 live cell을 관찰하였고, green fluorescence 관찰로 총 24시간 동안 사멸 세포를 확인하였다. 도 4는 본 발명의 엑소좀에 의한 atRAL 독성의 억제 효과를 측정한 그래프로서, 시간 별로 Green dye intensity 값을 측정한 결과이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 시약을 처리한 실험군(B)의 경우 한 시간 후부터 사멸 세포의 증가로 green dye intensity 값이 약 18시간까지 꾸준히 증가하였다. 엑소좀(EV)을 추가 처리한 실험군(C, D, E, F)의 경우 엑소좀(EV)의 농도가 증가함에 따라 green dye intensity 값의 증가 기울기가 감소한 것이 확인되었다. 특히 엑소좀(EV)을 1×1010 particles/ml로 처리한 경우 약 14시간까지는 대조군(None)과 유사하게 안정적이었고 그 후 세포독성(cytotoxicity)이 상대적으로 약하게 발생하는 것이 확인되었다.
실시예 5. Far-red로 표지된 엑소좀의 위치화(Localization of F(red)-tagged EV with RPE1)
RPE1 cell을 8 well chamber slide에 각각 1×104 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, far-red fluorescence로 표지(tagging)한 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 5×109 particles/ml로 처리하였다. 3시간, 6시간, 16시간 및 24시간 후 배양배지 제거하고, 4% paraformaldehyde(PFA)를 사용하여 세포를 고정시킨 뒤 DAPI staining 후 형광현미경으로 관찰하였다. 도 5는 본 실시예에 따라 형광 표지된 엑소좀의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이 엑소좀(EV) 처리 24시간 후에도 세포 내 엑소좀(EV)이 존재하는 것이 확인되었다. 즉, 본 실시예를 통해 엑소좀이 RPE1 세포질 내로 직접 이동하여 치료효과를 내는 것이 확인되었다.
실시예 6. Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델(in vivo Pde6b knockout rat)
앞선 in vitro 실시예를 바탕으로 in vivo에서 PDE6b knockout rat을 사용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 효능을 확인하였다. PDE6b knockout rat을 마취한 후 엑소좀(EV) 3×1011 particles/ml를 초자체내주사(intravitreous injection)한 후 안저촬영(fundus photography)을 실시하였다. 쥐 유리체(vitreous volume: 13-20 μl) 내 엑소좀(EV)의 농도는 1.5×107 내지 2.3×107 particles/μl이다. 엑소좀(EV)을 주사한 후 15일 뒤 쥐 안구(rat eye ball)를 적출하여 paraffin block을 제작하였다. Paraffin block으로 만든 쥐 안구를 4 μm 두께로 section하여 slide를 제작 후 H&E staining을 진행하였다. 슬라이드 스캐너(slide scanner)를 이용하여, 시신경 유두(optic disc)를 기준으로 좌우로 망막(retina)의 500, 750, 1000, 1500 μm 지점의 외과립층(outer nuclear layer, ONL)과 내과립층(inner nuclear layer, INL)의 두께를 측정하였다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델에서 외과립층(ONL)과 내과립층(INL)의 두께를 측정한 그래프이다. 두께 측정 시 객관성 유지를 위해 시료 번호를 가리고 blind로 측정하였으며, 각 부위별로 3번씩 측정하여 평균 값을 도출하였다. 엑소좀(EV)을 주사하지 않은 좌안을 대조군(#2-25L, #2-29L, #2-30L)으로 사용하였고, 실험군(#2-25R, #2-29R, #2-30R)으로 사용된 우안에만 엑소좀(EV)을 주사하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 대조군인 좌안과 비교하여 엑소좀(EV)을 주사한 우안의 외과립층(ONL)의 두께가 증가된 것이 확인되었다. 실험군에서 시신경 유도(optic disc)를 기준으로 한쪽에만 외과립층(ONL)의 두께가 증가한 것은 해당 방향으로만 엑소좀(EV)을 주사하였기 때문이다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (5)

  1. 인체 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는, 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 1×1010 내지 5×1011 particles/ml의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는, 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 100 내지 150 nm 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 망막변성질환은 망막색소변성증(RP), 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
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