KR20170049775A

KR20170049775A - 망막색소상피 분화 유도용 조성물

Info

Publication number: KR20170049775A
Application number: KR1020150150366A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 최순원; 이승희
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 주식회사 강스템바이오텍
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2017-05-11
Also published as: KR101982801B1

Abstract

본 발명은 miR-410 억제제를 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 키트, 상기 조성물을 사용하여 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 방법 및 상기 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 miR-410 억제제를 포함하는 조성물은 특별한 조건없이 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시킬 수 있으므로, 망막색소상피의 손상으로 인한 다양한 망막질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

망막색소상피 분화 유도용 조성물{Composition for inducing differentiation to retinal pigment epithelium}

본 발명은 망막색소상피 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 miR-410 억제제를 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 키트, 상기 조성물을 사용하여 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 방법, 상기 방법으로 분화된 망막색소상피 및 상기 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

실명(失明)은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 광수용체세포 (photoreceptor cell) 및 망막색소상피세포의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막미형성, 망막 변성 (retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 광수용체세포 및 망막색소상피세포를 새로운 기능성 세포로 재생하여 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 광수용체세포 및 망막색소상피세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.

골수 줄기세포 (bone marrow stem cell: BMS), 망막줄기세포 (retinal stem cell: RSC), 배아줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) 및 체세포핵치환 줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell: SCNT) 등을 이용한 치료 가능성이 대두되고 있다. 그러나, 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 배아세포 (embryonic cell) 및 망막기원세포 (retinal progenitor)로부터의 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 의한 병변 규명과, 4) 망막 변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.

최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고, 임상치료 시, 기능부전의 세포를 새로운 세포로 치환하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다. 인간 배아줄기세포에서 유도된 각종 장기를 구성하는 분화 세포들은 정상적인 분화 과정을 통해 형성되는 해당 세포들과 동일한 성상 및 기능을 가질 수 있을 것으로 가정 되어 왔다. 이 가능성에 기반하여, 발달 단계와 유사한 환경을 제공하는 분화 유도법이 췌장 호르몬-발현 내분비세포 (D'Amour, et al., Nat. Biotechnol., 2006; 24: 1392-401), 신경세포 (Pankratz, et al., Stem Cells 2007; 25: 1511-20), 근육세포(Barberi et al., Nat. Med., 2007; 13: 642-8), 혈관내피세포 (Wang, et al., Nat. Biotechnol., 2007; 25: 317-8) 분화 등에서 시도되고 있다. 망막 질환에서도 인간 배아줄기세포로부터 분화된, 망막 세포의 대표적인 세포인 광수용체세포 및 망막색소상피세포를 생산하고자 많은 시도들이 있었으나, 성적은 매우 저조하였다.

현재까지의 가장 큰 성공 중 하나로 보고된 연구결과는 망막 기원세포가 인간 배아줄기세포로부터 효과적으로 유도되었다는 것이나, 유도된 망막 기원세포로부터 광수용체세포의 분화는 실패하였다 (분화율 0.01% 미만)(Lamba, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74). 또 다른 하나는 인간 배아줄기세포로부터 광수용체세포를 성공적으로 분화시켰다고 보고하였으나, 이는 총 분화 유도기간이 200일 이상 걸리며, 그 분화율도 8%로서 매우 미미하기 때문에, 이를 임상에 적용하여 실명을 치료하기에는 현실적으로 불가능한 성적이다(Osakada et al., Nat. Biotechnol., 2008; 26: 215-24).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 망막색소상피(RPE, retinal pigment epithelium)로 보다 효과적으로 분화시킬 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 miR-410의 활성을 억제할 경우, 효과적으로 망막세포상피 유사세포로 분화시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 miR-410 억제제를 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 망막색소상피를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막질환 치료용 세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 효과적으로 중간엽 줄기세포를 망막색소상피(RPE)로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 마이크로 RNA에 주목하게 되었다. 인간의 RPE로부터 유래된 세포주인 ARPE-19세포와 망막조직 세포에서는 매우 낮게 발현되는 반면, 중간엽 줄기세포의 일종인 제대혈 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서는 높은 수준으로 발현되는 마이크로 RNA를 발굴한 결과, 21종의 마이크로 RNA를 선발하였다. 상기 선발된 마이크로 RNA 중에서 RPE-특이적 전사인자와 시각회로-특이적 유전자를 공통적인 표적으로 하여 작용하는 마이크로 RNA를 선발한 결과, 최종적으로 miR-410을 선별하였다. 상기 miR-410의 특성을 분석한 결과, 분화되지 않은 줄기세포에서는 대량으로 발현되지만, RPE 세포에서는 발현수준이 급격히 감소하고, 상기 miR-410의 활성을 억제하는 물질을 UCB-MSC에 처리하여 분화된 세포에서는 RPE 특이적인 마커유전자 및 단백질의 발현수준이 증가함을 확인하였으며, RPE 세포에 특이적인 식균활성이 증가됨을 확인하였으므로, 상기 분화된 세포는 RPE와 유사한 특성을 갖는 세포임을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 중간엽 줄기세포에서 miR-410의 활성을 억제하는 것만으로 상기 줄기세포를 RPE 세포로 분화시키는 기술은 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 miR-410 억제제를 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "miR-410"이란, 서열번호 1의 염기서열(5'-AAUAUAACACAGAUGGCCUGU-3')을 갖는 마이크로 RNA를 의미한다.

본 발명의 용어 "miR-410 억제제"란, 상기 miR-410의 활성을 억제할 수 있는 물질을 의미하는데, 상기 miR-410의 활성을 억제할 수 있는 한, 상기 억제제는 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 폴리뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질, 화합물, 중합체 등이 될 수 있고, 다른 예로서, miR-410에 특이적으로 결합하여 그의 기능을 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 또 다른 예로서, miR-410과 상보적인 염기서열로 구성된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE)"란, 외부 혈관 망막 베리어의 일부분을 형성하는 단층의 색소세포들은 의미한다. 이들 세포들은 망막의 기능을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하며, 광에너지를 흡수, 시각 사이클의 유지를 위한 광수용체와 상호작용, 광수용체와 맥락모세혈관층의 결합구조를 유지하는 다양한 성장인자들을 분비하고, 이온, 물, 대사 산물을 서브레티날 공간으로부터 혈액으로 이송하는 역할, 광수용체의 outer segment의 식세포 작용을 수행할 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 용어 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어지는 현상을 들 수 있다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.

본 발명의 목적상 상기 분화는 망막색소상피 분화 유도용 조성물에 의하여 중간엽줄기세포가 망막색소상피세포로 분화하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, UCB-MSC에서 발현되는 RPE 분화유도에 영향을 미치는 마이크로 RNA를 마이크로 어레이 분석을 통해 발굴한 결과, 망막조직 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 51개의 마이크로 RNA를 발굴하였고, ARPE-19 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 28개의 마이크로 RNA를 발굴하였으며, 망막조직 세포와 ARPE-19 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 21개의 마이크로 RNA를 발굴하였다. 상기 발굴된 21개의 마이크로 RNA 중에서, RPE-특이적 전사인자인 OTX2와 시각회로-특이적 유전자인 RPE65를 공통적인 표적으로 하여 작용하는 마이크로 RNA로서 miR-410를 선별하고(표 2), 상기 miR-410은 RPE 분화유도와 밀접한 연관성이 있을 것으로 예상하였다.

한편, 공지된 방법에 따라, UCB-MSC에 액티빈 A와 니코틴아미드를 처리하여 분화된 RPE 유사세포를 수득하거나 또는 miR-410 억제제를 처리하여 분화된 RPE 유사세포를 수득한 다음, 이들 RPE 유사세포를 대상으로 RPE 마커의 발현수준을 분석한 결과, 유전자 수준(도 2b) 및 단백질 수준(도 2c)에서 모두 RPE 마커가 발현됨을 확인하였다. 특히, 상기 RPE 마커 중에서 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 발현수준은 면역형광염색 분석을 통해 확인하였다(도 3a 내지 3c). 끝으로, RPE 세포에서 확인된 식균활성을 분석한 결과, 분화되지 않은 UCB-MSC에 비하여 RPE 유사세포는 높은 수준의 식균활성을 나타냄을 확인하였다(도 4a 및 4b).

따라서, miR-410 억제제를 중간엽 줄기세포에 처리하는 것 만으로도 상기 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시킬 수 있다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 것을 유도할 수 있다. 본 발명의 망막색소상피 분화 유도용 키트에는 상기 miR-410 억제제 이외에도 상기 억제제의 처리와 중간엽줄기세포의 분화과정에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 miR-410 억제제를 중간엽 줄기세포에 효과적으로 처리하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 완충액 농도는 다양) 등을 포함할 수 있다.

다른 예로서, 본 발명의 키트는 중간엽 줄기세포의 분화를 효과적으로 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 배양용기, 배양용 배지, 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 방법 및 상기 방법으로 분화된 망막색소상피를 제공한다.

본 발명의 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"란, 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등으로 분화될 수 있는 미분화된 줄기세포를 의미하는데, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 중간엽 줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 사람의 편도로부터 유래되어 서로 다른 개체에서 유래된 각각의 중간엽 줄기세포와 혼합배양이 가능한 세포가 될 수 있고, 지방세포, 골세포, 연골세포 등의 중배엽성 조직세포로 분화될 수 있을 뿐만 아니라, 부갑상선 조직세포 등의 내배엽성 조직세포로도 분화될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용된 중간엽 줄기세포는 ZNF281을 발현시키는 중간엽 줄기세포가 될 수 있다. 본 발명에서는 상기 중간엽 줄기세포로서 제대혈로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 UCB-MSC를 사용하였다.

상기 망막색소상피 분화 유도용 조성물에 포함된 miR-410 억제제를 중간엽 줄기세포를 처리하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 한번 또는 여러번에 걸쳐 중간엽 줄기세포에 처리하는 방식으로 처리할 수 있다, 예를 들어, 본 발명에서는 UCB-MSC를 배양하면서 0, 3, 10 및 17일이 경과된 시점에서 4회 처리하여 21일이 경과된 후에 망막색소상피 유사세포로의 분화를 유도하였다.

한편, 상기 방법에 의하여 중간엽 줄기세포로부터 분화된 망막색소상피는 중간엽 줄기세포에 비하여, 망막색소상피의 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀를 높은 수준으로 발현하고, 높은 수준의 식균활성을 나타낸다는 점에서, 분화이전의 중간엽 줄기세포와 상이하고, 통상적인 망막색소상피와 유사하다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 망막색소상피 분화 유도용 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 miR-410 억제제 또는 이를 포함하는 조성물은 중간엽 줄기세포를 망막색소상피 유사세포로 분화시킬 수 있으므로, 상기 miR-410 억제제 또는 이를 포함하는 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포는 망막색소상피의 이상 또는 손상으로 인하여 유래된 질환을 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "망막질환"이란, 외래적인, 내재적인 또는 유전적인 원인으로 인하여 망막의 이상 또는 손상이 발생하여 발병되는 질환을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 망막질환은 망막색소상피의 이상 또는 손상으로 인하여 유래된 질환으로 해석될 수 있는데, 상기 망막질환은 본 발명에서 제공하는 약학 조성물에 의하여 경감, 완화, 개선 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 망막미형성, 망막 변성 (retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 및 외상 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "세포 치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 치료제는 상기 망막색소상피 분화 유도용 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하여, 상술한 망막질환의 원인이 되는 망막색소상피를 재생시킬 수 있는 세포 치료제로 해석될 수 있다.

상기 본 발명의 세포 치료제는, 상기 중간엽 줄기세포의 활성을 유지시키기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는, 망막질환의 치료를 위한 이식용 조성물의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 세포 치료제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에서 제공하는 miR-410 억제제를 포함하는 조성물은 특별한 조건없이 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시킬 수 있으므로, 망막색소상피의 손상으로 인한 다양한 망막질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 각 조직별로 상이한 발현수준을 나타내는 마이크로 RNA를 발굴한 결과를 나타내는 다이어그램이다.
도 1b는 실시예 1-1에서 발굴된 21종의 마이크로 RNA와 14종의 유전자를 대상으로 하여 3가지 마이크로 어레이 표적 예측 프로그램(TargetScan, miRanda 및 DIANA)을 사용한 표적예측 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 음성대조군인 UCB-MSC, miR-410 억제제가 처리된 UCB-MSC 및 양성대조군인 ARPE-19 세포를 대상으로, 이들로부터 발현되는 miR-410의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 UCB-MSC를 사용하여 RPE 분화를 유도하는 방법의 전체적인 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 2b는 UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서 발현된 RPE 특이적 마커의 발현수준을 실시간 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2c는 UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서 발현된 RPE 특이적 마커의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a는 UCB-MSC, 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포 및 ARPE-19 세포애서 발현된 RPE 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 수준을 면역형광염색을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 miR control 및 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like)애서 발현된 RPE 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 수준을 면역형광염색을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3c는 UCB-MSC, miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410) 및 ARPE-19 세포에서 EMMPRIN 또는 베스트로핀이 발현되는 양성세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 UCB-MSC 또는 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410)의 식균활성을 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 하단의 사진은 상단의 사진을 확대한 사진이며, 상단사진의 크기바는 50 ㎛를 나타내고, 하단의 크기바는 5 ㎛를 나타낸다.
도 4b는 UCB-MSC, miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410) 또는 ARPE-19 세포의 식균활성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: UCB - MSC에서 발현되는 RPE 분화유도에 영향을 미치는 마이크로 RNA의 분석

실시예 1-1: UCB - MSC에서 발현되는 RPE 분화유도에 영향을 미치는 마이크로 RNA의 발굴

UCB-MSC에서 높은 수준으로 발현되고 RPE 발달관련 유전자를 표적으로 하는 후보 마이크로 RNA를 규명하기 위하여, 인간의 망막조직 세포 및 인간의 RPE 세포주의 일종인 ARPE-19 세포에서는 발현수준이 감소되고, UCB-MSC에서는 발현수준이 증가되는 마이크로 RNA를 발굴하기 위하여, 마이크로 어레이 분석을 수행하였다. 대략적으로, 상기 각 세포에 TRIzol울 사용하여 각각의 총 RNA를 수득하고, 상기 수득한 총 RNA를 Human microRNA Microarray(G4851a; Agilent Technologies, USA)에 적용하여 마이크로 어레이 분석을 수행하였으며, 얻어진 데이터는 GeneSpring GX software(version 11.5.1)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 망막조직 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 51개의 마이크로 RNA를 발굴하였고, ARPE-19 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 28개의 마이크로 RNA를 발굴하였으며, 망막조직 세포와 ARPE-19 세포에서는 낮은 발현수준을 나타내는 반면 UCB-MSC에서는 높은 발현수준을 나타내는 21개의 마이크로 RNA를 발굴하였다(도 1a 및 표 1). 도 1a는 각 조직별로 상이한 발현수준을 나타내는 마이크로 RNA를 발굴한 결과를 나타내는 다이어그램이다.

UCB-MSC에서 발현되는 RPE 분화관련 마이크로 RNA

마이크로 RNA	유전자 발현수준
마이크로 RNA	망막세포	ARPE-19 세포
hsa-miR-100 hsa-miR-127-3p hsa-miR-136 hsa-miR-146a hsa-miR-199a-5p hsa-miR-214 hsa-miR-224 hsa-miR-299-5p hsa-miR-337-5p hsa-miR-34a hsa-miR-376a hsa-miR-376c hsa-miR-377 hsa-miR-379 hsa-miR-381 hsa-miR-409-3p hsa-miR-410 hsa-miR-424 hsa-miR-654-3p hsa-miR-758 hsa-miR-762	3.57 2.29 5.64 4.27 4.86 2.17 3.94 2.09 3.21 56.10 5.05 6.35 4.02 3.16 3.00 2.46 2.06 6.44 2.84 2.18 5.00	2.56 3.96 5.49 11.59 8.63 10.55 2.22 3.71 3.24 2.39 6.10 8.13 5.72 3.53 3.05 2.81 2.57 7.20 3.56 2.32 6.27

상기 표 1에서 보듯이, 상기 발굴된 21개의 마이크로 RNA는 모두 공통적으로 망막세포 및 ARPE-19 세포 보다 UCB-MSC에서 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 예를 들어, miR-410의 경우 망막세포에서 발현되는 수준의 약 2배 수준 및 ARPE-19 세포에서 발현되는 수준의 약 2.5배 수준으로 UCB-MSC에서 발현됨을 알 수 있었다.

실시예 1-2: 발굴된 마이크로 RNA의 표적예측 분석

상기 실시예 1-1에서 발굴된 21종의 마이크로 RNA가 어떠한 단백질을 표적으로 하여 작용하는지 확인하기 위하여, 상기 21종의 마이크로 RNA와 14종의 유전자를 대상으로 하여 3가지 마이크로 어레이 표적 예측 프로그램(TargetScan, miRanda 및 DIANA)을 사용한 표적예측 분석을 수행하였다(도 1b). 이때, 상기 14종의 유전자로는 3종의 RPE-특이적 전사인자(OTX2, MITF 및 PAX6), 3종의 시각회로-특이적 유전자(RPE65, LRAT 및 CRALBP), 3종의 막관련 단백질 유전자(BEST1, PEDF 및 ZO-1), 4종의 포식작용-특이적 유전자(MERTK, GULP1, LAMP2 및 VDP) 및 1종의 색소합성-특이적 유전자를 사용하였다.

도 1b는 실시예 1-1에서 발굴된 21종의 마이크로 RNA와 14종의 유전자를 대상으로 하여 3가지 마이크로 어레이 표적 예측 프로그램(TargetScan, miRanda 및 DIANA)을 사용한 표적예측 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 21종의 마이크로 RNA는 서로 다른 유전자를 표적으로 하여 작용함을 알 수 있었다.

상기 14종의 유전자 중에서도 RPE-특이적 전사인자와 시각회로-특이적 유전자를 공통적인 표적으로 하여 작용하는 마이크로 RNA를 선발하기 위하여, RPE-특이적 전사인자인 OTX2와 시각회로-특이적 유전자인 RPE65를 대상으로 표적예측 분석을 수행하였다(표 2).

OTX2 및 RPE65에 대한 UCB-MSC에서 발현되는 RPE 분화관련 마이크로 RNA의 표적 예측 분석결과

마이크로 RNA	표적예측
마이크로 RNA	OTX2	RPE65
hsa-miR-100 hsa-miR-127-3p hsa-miR-136 hsa-miR-146a hsa-miR-199a-5p hsa-miR-214 hsa-miR-224 hsa-miR-299-5p hsa-miR-337-5p hsa-miR-34a hsa-miR-376a hsa-miR-376c hsa-miR-377 hsa-miR-379 hsa-miR-381 hsa-miR-409-3p hsa-miR-410 hsa-miR-424 hsa-miR-654-3p hsa-miR-758 hsa-miR-762	× × × × × × × × × × × × ○ × × × ○ × × × ×	× × × × × × × × × × × × × × × × ○ × × × ×

상기 표 2에서 보듯이, RPE-특이적 전사인자인 OTX2와 시각회로-특이적 유전자인 RPE65를 공통적인 표적으로 하여 작용하는 마이크로 RNA로서 miR-410이 선별되었다.

따라서, miR-410은 RPE 분화유도와 밀접한 연관성이 있을 것으로 분석되었다.

실시예 1-3: 다양한 세포에서 miR -410의 발현수준 분석

UCB-MSC에서 RPE 분화와 miR-410의 발현수준이 연관되는지를 확인하기 위하여, 음성대조군인 UCB-MSC, miR-410 억제제가 처리된 UCB-MSC 및 양성대조군인 ARPE-19 세포를 대상으로, 이들로부터 발현되는 miR-410의 발현수준을 정량적 RT-PCR을 통해 분석하였다(도 1c). 이때, miR-410 억제제로는 miR-410을 구성하는 염기서열과 상보적인 염기서열로 구성된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하였다.

도 1c는 음성대조군인 UCB-MSC, miR-410 억제제가 처리된 UCB-MSC 및 양성대조군인 ARPE-19 세포를 대상으로, 이들로부터 발현되는 miR-410의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, RPE 세포의 일종인 ARPE-19 세포에서는 miR-410이 상대적으로 낮은 수준으로 발현되고, 분화되지 않은 UCB-MSC에서는 miR-410이 상대적으로 높은 수준으로 발현되며, miR-410 억제제가 처리된 UCB-MSC에서는 UCB-MSC 보다는 낮지만, ARPE-19 세포보다는 높은 수준으로 miR-410 이 발현됨을 확인하였다.

상기 결과로부터, RPE로의 분화가 유도될 경우, miR-410 의 발현수준이 억제되는 것으로 분석되었다.

실시예 2: UCB - MSC에서의 miR -410 발현억제가 RPE 분화에 미치는 영향분석

상기 실시예 1의 결과와 공지된 방법에 따라, 두 가지 방법으로 UCB-MSC를 RPE 세포로 분화시켰다.

하나는, UCB-MSC를 80%의 포화도로 배양한 후, 100 ng/㎖ 액티빈 A(Activin A) 및 10mM 니코틴아미드(nicotinamide)를 배지에 처리하고, 3일마다 배지를 교체하면서 9주동안 배양하여, RPE 유사세포(2F-RPE-like cell)로 분화시키는 방법이고, 다른 하나는, UCB-MSC를 80%의 포화도로 배양한 후, 3주동안 배양하면서 0, 3, 10 및 17이 경과된 시점에서 miR-410 억제제를 처리하여, RPE 유사세포(miR-RPE-like cell)로 분화시키는 방법을 사용하였다(도 2a).

도 2a는 UCB-MSC를 사용하여 RPE 분화를 유도하는 방법의 전체적인 흐름을 나타내는 개략도이다.

다음으로, 상기 두 가지 방법으로 유도된 RPE 유사세포를 대상으로 실시간 RT-PCR을 통하여 RPE 특이적 마커 분석을 수행하였다(도 2b). 이때, 대조군으로서 UCB-MSCs, miR control 및 ARPE-19 세포를 사용하고, 실험군으로는 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like), miR-410 억제제를 1회 처리하고 2일 동안 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like(2 days)), miR-410 억제제를 4회 처리하고 21일 동안 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like(21 days))를 사용하였으며, RPE 특이적 마커로는 RPE 전구체-특이적 전사인자인 MITF와 성숙한 RPE 특이적 마커인 LRAT, RPE65, 베스트로핀(Bestrophin) 및 EMMPRIN를 사용하였고, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다. 상기 miR control은 음성대조군으로는 UCB-MSC에 miR ctl (Anti-miR Negative Control; Ambion)을 도입하고 21일동안 배양하여 수득한 음성대조군으로서, miR-410이 아닌 다른 염기서열을 가진 불특정 miRNA에 대한 억제제로써 작용한다.

도 2b는 UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서 발현된 RPE 특이적 마커의 발현수준을 실시간 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2b에서 보듯이, UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서는 RPE 특이적 마커인 MITF, 베스트로핀 및 EMMPRIN의 발현수준이 증가함을 확인하였다.

또한, 상기 두 가지 방법으로 유도된 RPE 유사세포를 대상으로 웨스턴블럿 분석을 통하여 RPE 특이적 마커 분석을 수행하였다(도 2c). 대조군으로서 UCB-MSCs 및 ARPE-19 세포를 사용하고, 실험군으로는 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포(2F-RPE-like) 및 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(miR-RPE-like)를 사용하였으며, RPE 특이적 마커로는 베스트로핀 및 EMMPRIN를 사용하고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.

도 2c는 UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서 발현된 RPE 특이적 마커의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2c에서 보듯이, UCB-MSC로 부터 분화유도된 RPE 유사세포에서는 RPE 특이적 마커인 베스트로핀 및 EMMPRIN의 단백질 수준이 증가함을 확인하였다.

따라서, UCB-MSC에 miR-410 억제제를 처리할 경우, RPE로의 분화가 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 3: UCB - MSC로부터 분화된 RPE 유사세포의 특성분석

실시예 3-1: 면역형광염색 분석

먼저, 배양된 UCB-MSC, 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포 및 ARPE-19 세포에 4% 포름알데히드를 10분동안 처리하여 세포를 고정시킨 다음, 실온에서 0.05% Triton X-100를 10분동안 처리하여 고정된 각 세포의 세포막을 천공하였다. 그런 다음, 천공된 각 세포에 실온에서 5% 정상염소 혈청을 1시간 동안 처리하여 블로킹하고, EMMPRIN에 대한 항체 또는 베스트로핀에 대한 항체를 처리한 다음, 4℃에서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 1:1000으로 희석시킨 형광표지된 2차 항체(goat anti-mouse Alexa fluor 488; Invitrogen)를 처리하여 반응시킨 후, 형광염색된 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 수준을 측정하였다(도 3a). 이때, 핵은 DAPI를 사용하여 대조염색하였다.

도 3a는 UCB-MSC, 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포 및 ARPE-19 세포애서 발현된 RPE 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 수준을 면역형광염색을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3a에서 보듯이, EMMPRIN 또는 베스트로핀의 형광염색 수준은 UCB-MSC에서 가장 낮게 나타났고, ARPE-19 세포에서 가장 높게 나타났으며, RPE 유사세포는 중간값을 나타냄을 확인하였다.

다음으로, 배양된 UCB-MSC, 2가지 인자를 사용하여 9주동안 배양함으로써 얻어진 RPE 유사세포 및 ARPE-19 세포 대신에, miR control 및 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like)를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 실험을 수행하였다(도 3b).

도 3b는 miR control 및 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(RPE-like)애서 발현된 RPE 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀의 수준을 면역형광염색을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3b에서 보듯이, EMMPRIN 또는 베스트로핀의 형광염색 수준은 UCB-MSC에서 가장 낮게 나타났고, ARPE-19 세포에서 가장 높게 나타났으며, RPE 유사세포는 중간값을 나타냄을 확인하였다.

끝으로, 배양된 UCB-MSC, miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410) 및 ARPE-19 세포에서 EMMPRIN 또는 베스트로핀이 발현되는 양성세포의 비율을 산출하고 비교하였다(도 3c).

도 3c는 UCB-MSC, miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410) 및 ARPE-19 세포에서 EMMPRIN 또는 베스트로핀이 발현되는 양성세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, EMMPRIN 및 베스트로핀은 서로 다른 양상을 나타냄을 확인하였다. 즉, EMMPRIN 양성 세포의 비율은 UCB-MSC에서 가장 낮게 나타났고, ARPE-19 세포에서 가장 높게 나타났으며, RPE 유사세포는 중간값을 나타났으나, 베스트로핀은 RPE 유사세포에서 가장 높은 비율을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3-2: 식균활성 분석

RPE 세포는 우수한 식균활성을 나타낸다고 알려져 있으므로, 본 발명에서 분화시킨 RPE 유사세포가 식균활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위하여, 형광이 표지된 미세구체를 사용하여 식균활성 분석을 수행하였다.

구체적으로, 배양된 UCB-MSC 또는 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410)에 ㎖당 1 X 10⁹개의 형광 미세구체(FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres(1 mm, red fluorescent 580/605; Invitrogen))를 가하고 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 형광미세구체를 제거하고, 세포에 1㎖ FBS를 가한 다음, 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, PBS로 각 세포를 세척하고, 핵을 Hoechst로 10분 동안 대조염색한 다음, 공초점 현미경으로 촬영한 후, 정량분석을 수행하였다(도 4a 및 4b). 이때, 정량분석시 대조군으로는 ARPE-19 세포를 사용하였다.

도 4a는 UCB-MSC 또는 miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410)의 식균활성을 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 하단의 사진은 상단의 사진을 확대한 사진이며, 상단사진의 크기바는 50 ㎛를 나타내고, 하단의 크기바는 5 ㎛를 나타낸다. 도 4a에서 보듯이, 분화되지 않은 UCB-MSC는 형광 미세구체를 낮은 수준으로 흡수하였으나, RPE 유사세포(anti-miR-410)는 형광 미세구체를 높은 수준으로 흡수함을 확인하였다.

도 4b는 UCB-MSC, miR-410 억제제를 처리하고 분화유도하여 얻어진 RPE 유사세포(anti-miR-410) 또는 ARPE-19 세포의 식균활성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 분화되지 않은 UCB-MSC는 형광 미세구체의 흡수율이 낮은 수준을 나타내었으나, RPE 유사세포(anti-miR-410)는 형광 미세구체의 흡수율이 대조군인 ARPE-19 세포의 것에 버금가는 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

따라서, 식균활성 분석을 통하여 UCB-MSC에 miR-410 억제제를 처리할 경우, RPE로의 분화가 유도됨을 알 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION Kang Stem Biotech CO., LTD. <120> Composition for inducing differentiation to retinal pigment epithelium <130> KPA151096-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-410 <400> 1 aauauaacac agauggccug u 21

Claims

miR-410 억제제를 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 miR-410는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 마이크로 RNA인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 miR-410 억제제는 miR-410에 특이적으로 결합하여 그의 기능을 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 포함하는 망막색소상피 분화 유도용 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 망막색소상피 분화 유도용 조성물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 망막색소상피로 분화시키는 방법.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 중간엽 줄기세포를 배양하고, 0, 3, 10 및 17일이 경과된 시점에서 배지에 처리하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것인 방법.
제5항의 방법에 의하여 중간엽 줄기세로로부터 분화된 망막색소상피.
제8항에 있어서,
상기 망막색소상피는 중간엽 줄기세포에 비하여, 망막색소상피의 마커인 EMMPRIN 또는 베스트로핀을 상대적으로 높은 수준으로 발현하고, 식균활성을 상대적으로 높은 수준으로 나타내는 것인 망막색소상피.
제8항에 있어서,
상기 망막색소상피는 중간엽 줄기세포로부터 분화를 유도한 후, 21일이 경과된 시점에서 형성되는 것인 망막색소상피.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 망막색소상피 분화 유도용 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막질환 치료용 세포 치료제.
제11항에 있어서,
상기 망막질환은 망막미형성, 망막 변성 (retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma) 및 시신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것인 세포 치료제.