KR102417981B1 - 각막내피세포 이식용 인공 지지체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편 - Google Patents

각막내피세포 이식용 인공 지지체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 조직공학적으로 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편에 대한 것이다. 본 발명의 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법은 최적의 탈세포화 과정을 통해 투명도가 우수하고 초박막 두께의 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체는 형태학적 안정성이 우수하고, 세포의 생존 및 분화를 위해 적절한 미세환경을 제공할 수 있는바, 본 발명의 상기 지지체에 각막내피세포가 이식되는 경우 우수한 부착성을 보이며 세포가 고르게 분포할 뿐 아니라, 높은 생존율을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 지지체에 각막내피세포를 이식하여 재세포화시킨 데스메막박리 각막내피층판 이식편은 높은 투명도와 더불어 90 내지 120 μm 두께의 초박막 형태를 유지할 수 있으며, 면역거부 반응을 일으킬 수 있는 이종성 물질을 포함하지 않는바, 각막내피세포이식술에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

각막내피세포 이식용 인공 지지체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편{Artificial scaffold for corneal endothelial cell transplantation, manufacturing method thereof, and ultra-thin descemet stripping endothelial graft using the same}
본 발명은 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 조직공학적으로 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편에 대한 것이다.
각막(角膜, cornea)은 눈알 외막의 1/6을 차지하며, 빛을 굴절시켜 주는 주된 기관 중 하나이다. 각막은 각막상피, 보우만층, 각막기질(각막실질), 데스메막, 각막내피의 총 5개 층으로 이루어져 있다. 각막상피는 5~6의 세포층으로 이루어져 있으며, 주변부의 줄기세포로부터 기초 세포가(base cell)가 생성되어 중심부로 이동하며 7일 후 탈락하게 된다. 보우만층은 세포가 없는 아교질 섬유로 되어 있으며, 무색 투명하다. 그러나, 재생이 불가하여 수술이나 외상 시 흉터를 남기게 된다. 각막기질은 각막의 두께의 90%를 차지하며, 세포의 진행방향 및 크기가 일정하다. 데스메막은 3~4층의 세포로 이루어져 있으며, 내피의 기저 막으로 추정되는 곳이다. 각막내피는 1층의 세포로 이루어져 있으며, 내피의 세포는 정해져 있고, 재생은 극히 제한적이며, 나이가 들면 세포의 수가 감소한다. 세포의 수가 감소할 경우, 주변의 세포가 커져 자리를 메우게 된다.
각막내피세포이영양증(corneal endothelial dystrophy: CED)은 심각한 시각 장애의 주요 요인이다. 푹스각막내피이상증 (Fuchs endothelial corneal dystrophy: FECD)은 일반적인 각막 질환으로 내피세포의 점진적인 손실, 데스메막(DM)의 비후화, 안구 돌기 성장물 침적이 특징이다. 상기 질환은 미국에서 40세 이상 인구의 4%에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 각막 이식에 대한 의뢰는 푹스각막내피이상증의 첫 진단에서 이루진다.
각막내피(corneal endothelium)는 생리학적 이온 펌프가 내장된 각막의 후방 표면에 있는 육각형 세포의 단일층으로 구성된다. 각막내피세포(corneal endothelial cell: CEC)는 기질(stroma)에서 물을 안방수(aqueous humor)로 펌핑하여 수화를 제어하여 기계적 강도를 유지한다. 출생시 인간 각막내피세포(CEC)의 평균 밀도는 약 5000 cells/mm2이다. 그러나, 유사 분열 잠재력이 제한되어 있기 때문에, 총 세포수는 연령에 따라 감소한다. 각막내피세포(CEC)가 손상되면 세포는 유사 분열이 아닌 세포 확장 및 이동을 통해 복구된다. 유전 질환이나 노화로 인해 각막내피세포(CEC) 밀도가 500 cells/mm2 아래로 떨어지면 더 이상 일반적인 회복을 통해 손실을 보상할 수 없으며 손상은 영구적으로 유지된다.
현재, 각막내피세포(CEC) 손실에 대한 확립된 치료는 각막 이식이다. 전층각막이식수술(penetrating keratoplasty, PK) 또는 부분층 각막내피층이식술(partial-thickness endothelial keratoplasty, EK)에 의해 각막의 투명도는 공여자 조직의 이식에 의해 회복될 수 있다.
부분층 각막내피층이식술은 전층각막이식수술에 비해 수술 전, 후 위험과 회복 시간을 모두 줄일 수 있다. 심층판 각막내피세포이식술(Deep Lamellar Endothelial Keratoplasty, DLEK), 데스메막박리 각막내피층판이식술(Descemet-stripping endothelial keratoplasty, DSEK) 및 데스메막 각막내피이식술(Descemet membrane endothelia keratoplasty, DMEK)을 포함하여 각막내피세포이식술을 수행하는 몇 가지 방법이 있다. 임상적으로 부분층 각막내피층이식술이 전층각막이식수술 보다 시각적 결과가 더 좋고 각막내피층이식술 이식편의 생존율이 전층각막이식수술 보다 훨씬 높다는 것이 밝혀졌다. 따라서 최근 미국에서는 전층각막이식수술에 비해 각막내피층이식술을 시행하는 경우가 꾸준히 증가하고 있다. 그러나 전세계 공여자 각막 조직의 부족으로 인해 각막 이식은 70명의 환자 중 1명으로 제한되는 실정이다. 따라서, 치료를 위한 새로운 치료법을 찾는 것이 여전히 중요한 과제이다.
한편, 유도만능줄기세포(iPSC) 및 중간엽 줄기세포의 각막내피세포로의 유도와 같은 줄기 세포의 분화에 대한 새로운 연구가 최근 임상 치료를 위해 수행되었다. 특히, 유도만능줄기세포(iPSC)가 무한 각막내피유사세포(iCEC)로 분화될 수 있는 능력은 수술 후 면역억제에 대한 필요성을 제거하는 유망한 환자 특이적 접근법이다. 2016년 보고된 연구에서는 BJ 인간 포피 섬유아세포로부터 유래된 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 각막내피유사세포(CEC)의 도출을 기술하였다 (Zhao and Afshari. 2016). 유사하게, 또 다른 연구에서는 각막내피유사세포(CEC)의 유도를 위한 성인 섬유아세포 유래 유도만능줄기세포(iPSC)에 대한 절차가 고안된바 있다(Wagoner et al. 2018). 이러한 줄기세포와 관련된 연구는 활발히 수행되었지만, 상기 세포의 생존 및 분화를 위해 적절한 미세환경을 제공할 수 있는 임상적으로 이용 가능한 최적의 스캐폴드에 대한 연구가 없어, 제약을 받고 있다.
각막 기증자 부족을 극복하기 위해 연구원들은 생체 내 모방과 우수한 생체적합성을 제공하는 적절한 생체 재료를 사용하여 각막 조직 공학에 관심을 집중하고 있다. 콜라겐 시트, 젤라틴 필름, 하이드로겔 렌즈 및 양막과 같은 각막 내피 이식을 위한 다양한 유형의 물질이 보고된 바 있다(Ishino 등 2004, Kennedy 등 2019, Mimura 등 2004, Watanabe 등 2011)). 상기 물질들 중에서 탈세포화된 조직은, 고유한 장기 유래 미세환경(microenvironment)이 있는 특성으로 인해 주목을 받고 있다. 물리적, 화학적 및 생물학적 방법을 포함하여, 임상 용도에 대한 그들의 적합성을 확인하기 위해 각막의 탈세포화를 위한 다른 기술이 연구되었다.
그러나 탈세포화된 각막의 생산은 주로 부분적인 두께가 아니라 각막 전체에 집중되어 왔으며, 또한, 탈세포화법을 이용한 초박형 데스메막박리 각막내피층판의 생산에 관한 연구가 부족한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 인간 각막의 대안으로 돼지 각막을 사용하여 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 제조하였으며, 상기 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 제조하였다. 본 발명의 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편은 투명성이 매우 우수할 뿐 아니라 90 ~ 120 μm 범위의 초박막 두께를 갖는바, 각막내피세포이식술에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1029887호
따라서 본 발명의 목적은 각막내피세포 이식용 인공 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법을 통해 제조된 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 제공한는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 a) 동물의 각막을 준비하는 단계; b) 상기 각막에서 각막내피(corneal endothelium), 데스메막(Descemet membrane) 및 후방 기질(posterior stroma)의 양 끝부분을 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 후 탈세포화시키는 단계; c) 탈세포화된 각막에서 데스메막박리 각막내피층판을 박리하는 단계; d) 박리된 데스메막박리 각막내피층판을 탈세포화시키는 단계; 및 e) 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판을 건조시키는 단계를 포함하는, 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 d) 단계에서 탈세포화는 0.1 내지 0.5% SDS 농도 조건 하에서 진행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 d) 단계에서 탈세포화는 실온에서 8시간 내지 12시간 진행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 e) 단계에서 건조는 15 내지 45℃에서 진행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 제공한다,
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 유래된 각막내피세포(corneal endothelial cells)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이식편은 90 내지 120 μm 두께를 가질 수 있다.
본 발명의 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법은 최적의 탈세포화 과정을 통해 투명도가 우수하고 초박막 두께의 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체는 형태학적 안정성이 우수하고, 세포의 생존 및 분화를 위해 적절한 미세환경을 제공할 수 있는바, 본 발명의 상기 지지체에 각막내피세포가 이식되는 경우 우수한 부착성을 보이며 세포가 고르게 분포할 뿐 아니라, 높은 생존율을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 지지체에 각막내피세포를 이식하여 재세포화시킨 데스메막박리 각막내피층판 이식편은 높은 투명도와 더불어 90 내지 120 μm 두께의 초박막 형태를 유지할 수 있으며, 면역거부 반응을 일으킬 수 있는 이종성 물질을 포함하지 않는바, 각막내피세포이식술에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 방법 A와 방법 B의 공정을 간략하게 보여주는 모식도이다(Endo, Endothelium, DM, Descemet’s membrane; EPI, Epithelium; Full, Full-thickness cornea; DSE, Descemet stripping endothelial graft; DC, Decellularization).
도 2A는 방법 A 및 방법 B의 단계별 각막의 총 모양을 관찰한 것이다. 도 2B는 0.1% SDS를 사용하여 10시간 동안 탈세포화시킨 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 투명도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(CON: 대조군(투명한 슬라이드 유리), Full: 전체 두께 각막, A10h: 방법 A, B10h: 방법 B). 도 2C는 0.1% SDS를 사용하여 0시간, 10시간 동안 탈세포화시킨 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 두께를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(Full: 전체 두께 각막, A: 방법 A, B: 방법 B).
도 3A는 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 실온(RT)에서 0.1% SDS에서 0h, 4h, 6h, 10h 동안 탈세포화시킨 후 DAPI 염색을 진행한 이미지이다. 도 3B는 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 4℃ 및 실온(RT) 조건에서 10시간 동안 탈세포화시킨 후 DAPI 염색을 진행한 이미지이다. 도 3C는 탈세포화를 거치지 않은 데스메막박리 각막내피층판 이식편(DSE) 및 10시간의 탈세포화 과정을 거친 데스메막박리 각막내피층판 이식편(DSE-DC 10h)에서 돼지 유래 면역원성 항원을 검출을 위해 PCR 검사를 진행한 결과이다.
도 4A는 0.1% 및 1% SDS에서 각각 탈세포화에 따른 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 데스메막(DM) 및 후방 기질(posterior stromal) 구조를 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색법을 통해 확인한 결과이다(DM, Descemet’s membrane; EPI, Epithelium; S, Stroma). 도 4B는 탈세포화를 거치지 않은 데스메막박리 각막내피층판 이식편(DSE) 및 10시간의 탈세포화 과정을 거친 데스메막박리 각막내피층판 이식편(DSE-DC 10h)의 콜라겐 매트릭스를 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법을 사용하여 측정한 결과이다.
도 5A는 습식(wet) 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 세포 시딩(cell seeding) 배지에서 배양하였을 때 이식편이 팽창되고 말려서 투명성이 상실되는 것을 보여주는 사진이다. 도 5B는 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 다양한 온도 조건(40℃, 60℃, -70℃)에서 건조시켰을 때 형태변화를 보여주는 사진이다. 도 5C는 40℃에서 건조 과정을 거친 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판 이식편에 세포 시딩(cell seeding) 후 배양 동안 투명성이 유지됨을 보여주는 사진이다. 도 5D는 재세포화 후 습식(wet) 및 건조(dry) 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 투명도(왼쪽) 및 두께(오른쪽)를 비교한 사진이다. 도 5E는 대조군 (깨끗한 슬라이드 유리)과 비교하여, 재세포화된 습식(wet) 및 건조(dry) 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 투명도를 측정한 결과이다. 도 5F는 재세포화된 습식(wet) 및 건조(dry) 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 살아있는 세포(녹색)와 죽은세포(붉은색)를 염색하여 나타낸 것이다. 도 5G는 재세포화를 위한 배양 전·후 습식(wet) 및 건조(dry) 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 두께를 측정한 결과이다.
도 6A는 인간 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 각막내피세포(CEC)로 분화되는 과정을 0일차(D0), 12일차(D13), 22일차(D22)에 관찰한 것이다. 도 6B는 분화 된 세포에서 신경능선유사세포(NCC) 및 각막내피세포(CEC) 마커 발현을 면역조직 화학에 의해 확인한 결과이다. 도 6C는 iPSC로부터 분화된 각막내피세포(iCEC)로 재세포화된 데스메막박리 각막내피층판 이식편의 투명도를 보여주는 사진이다(아래의 글자가 명확하게 보임). 도 6D는 재세포화된 iCEC가 고르게 퍼지고, 대부분의 세포가 살아남 았으며, 건조(dry) 데스메막박리 각막내피층판 이식편에 잘 부착되어 있음을 확인한 것이다. 도 6E 탈세포화된 건조 이식편(DC Dry graft, 왼쪽 칼럼) 및 iCEC 재세포화된 이식편(iCEC RC graft, 오른쪽 칼럼)의 구조를 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색법을 통해 확인한 결과이다. 도 6F는 재세포화된 이식편 및 제핵된(enucleated) 돼지 눈을 사용하여 데스메막박리 각막내피층판 이식술(DSEK)를 시연한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법은, a) 동물의 각막을 준비하는 단계; b) 상기 각막에서 각막내피(corneal endothelium), 데스메막(Descemet membrane) 및 후방 기질(posterior stroma)의 양 끝부분을 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 후 탈세포화시키는 단계; c) 탈세포화된 각막에서 데스메막박리 각막내피층판을 박리하는 단계; d) 박리된 데스메막박리 각막내피층판을 탈세포화시키는 단계; 및 e) 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 건조시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 a) 단계는 동물의 각막을 준비하는 단계로서, 자세하게는 동물로부터 말초 공막 및 결막을 포함한 온전한 각막을 절제하여 준비하는 단계이다.
본 발명의 상기 b) 단계는 상기 온전한 각막을 탈세포화시키는 단계로서, 자세하게는 상기 a) 단계를 통해 준비된 온전한 각막에서 각막내피(corneal endothelium), 데스메막(Descemet membrane) 및 후방 기질(posterior stroma)의 양 끝부분을 5 ~ 15mm 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 후 탈세포화시키는 단계이다.
온전한 각막은 각막상피, 보우만층, 각막기질(각막실질), 데스메막, 각막내피의 총 5개 층으로 이루어져 있는데, 본 발명의 상기 b) 단계에서는 각막기질의 후방(posterior), 데스메막 및 각막내피 3개의 부위에서 양 끝부분(말단)을 5 ~ 15mm 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 다음, 0.1% SDS에서 5시간 동안 탈세포화시킬 수 있다.
본 발명의 상기 c) 단계는 데스메막박리 각막내피층판을 박리하는 단계로서, 자세하게는 상기 b) 단계를 거친 탈세포화된 각막에서 데스메막박리 각막내피층판을 박리하는 단계이다.
데스메막은 각막내피세포의 기저막으로 각막내피세포층에서 합성되어 분비되는 산물이 헤미데스모좀(hemidesmosome) 결합으로 내피세포와 단단한 결합을 이루고 있다. 한편, 데스메막과 각막실질 간은 단단한 결합이 없이 불안정한 상태로 존재하기 때문에, 안구 내 수술 중 데스메막과 각막실질층 사이에서 분리가 일어날 수 있다. 이를 ‘데스메막박리’라고 한다. 데스메막이 분리되었다 함은 결국 각막 내피가 분리된 것을 의미하기 때문에, 각막 내피의 기능인 각막의 수분 조절기능이 소실되어, 각막은 만성적인 부종 상태에 빠지게 된다.
한편, 데스메막박리 각막내피층판 이식술(Descemet’s stripping endothelial keratoplasty, DSEK)이라 함은, 호스트(host)의 각막내피 및 데스메막이 소량의 후방 기질(posterior stroma)과 함께 기증자의 각막내피와 데스메막으로 대체되는 각막층판이식술의 한 유형이다. 상기 이식술은 이식편의 고정을 위해 봉합이 필요 없기 때문에 봉합으로 인해서 생기는 고도 및 불규칙 난시를 예방할 수 있고, 수술 후 조직거부반응이 적으며 시력회복도 빠른 장점을 가지고 있다.
본 발명에서 ‘데스메막박리 각막내피층판’이라 함은, 각막내피 및 데스메막과 함께 소량의 후방 기질(posterior stroma)을 포함하는 각막의 후부층판을 의미한다.
본 발명의 상기 d) 단계는 데스메막박리 각막내피층판을 탈세포화시키는 단계로서, 자세하게는 상기 c) 단계를 거쳐 수득되는 박리된 데스메막박리 각막내피층판을 0.1 내지 0.5% SDS 농도 조건 및 실온에서 8시간 내지 12시간 동안 탈세포화시키는 단계이다.
본 발명의 상기 e) 단계는 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 건조시키는 단계로서, 자세하게는 상기 d) 단계를 거친 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 15 내지 45℃ 온도 조건에서 건조시키는 단계이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 각막내피세포 이식용 인공 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 각막내피세포 이식용 인공 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편을 제공한다.
본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 유래된 각막내피세포(corneal endothelial cells) 또는 각막내피유사세포(corneal endothelial-like cell)일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 데스메막박리 각막내피층판 이식편은 90 내지 120 μm 두께를 가진 초박형(ultrathin)일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편
방법 A: 도축장에서 신선한 돼지 안구를 구입하였다. 말초 공막 및 결막을 포함한 각막을 절제하였다. 데스메막(DM) 및 각막내피세포(CEC)를 0.1 % 트리판 블루 용액 (Sigma, Rockford, IL)으로 염색하였다. 둥근 팁 집게를 사용하여 최소한의 기질층을 포함하는 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편을 수동으로 제거하였다. 박리된 이식편을 70 rpm의 속도로 완만하게 교반하면서 실온 (RT, 20℃)에서 10시간 동안 0.1 % 소듐 도데실 설페이트 (SDS; Sigma)에서 탈세포화시켰다. 2% antibiotic-antimycotic solution(Welgene, Gyeongsan, Korea)을 포함하는 인산완충액 (PBS)으로 4시간 씩 3반복하여 세척하였으며. 이어서, 이식편을 약산성 전해수 (SAEW; Medilox-S, Susan, Seoul, Korea)에서 1.5 시간 동안 멸균하고, PBS로 각각 30분 동안 3회 세척하였다. 사용하기 전 차가운 PBS에서 이식편을 4℃에서 최대 1주 동안 유지시켰다(도 1A 참조).
방법 B: 도축장에서 신선한 돼지 안구를 구입하였다. 말초 공막 및 결막을 포함한 각막을 절제하였다. 각막내피세포(CEC), 데스메막(DM) 및 후방 기질의 양 끝부분 영역을 12mm 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)하였다. 이후, 말초 공막 및 결막을 포함한 전체 각막 조직을 부드럽게 교반하면서 실온에서 5시간 동안 0.1% SDS에서 탈세포화시켰다. 그 후, 최소한의 기질층을 포함한 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편을 둥근 팁 집게를 사용하여 박리하였다. 분리된 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편을 다시 0.1% SDS에서 10시간 동안 탈세포화 후 세척하고, 방법 A에 기재된 바와 같이 멸균 절차를 수행하였다(도 1B 참조).
이식편 분석
돼지 유래의 이종 이식 세포가 탈세포화된 이식편으로부터 제거되었는지를 확인하기 위해, 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma) 마운팅 미디엄 한 방울을 유리 슬라이드 상에 샘플에 적용하였다. 남아있는 이식핵을 관찰하기 위해, 형광현미경 (LionHeart FX, BioTek, Winoosky, VT)을 사용하여 z-stack 이미징을 수행하였다. 각 샘플의 두께는 디지털 마이크로 캘리퍼스 ((Mitutoyo, Kawasaki, Japan)를 사용하여 측정하였다. 각막의 투명도를 평가하기 위해 투명 유리 슬라이드에 샘플을 놓은 다음 로마 알파벳 (Calibri 16 font, bold)이 인쇄된 종이에 놓았다. 각막 이식편의 투명성을 정량화하기 위해, Neo imager 소프트웨어(Neoscience, Seoul, Korea)를 사용하여 슬라이드 유리 아래의 알파벳 글자의 가시성을 샘플이 없는 슬라이드 유리 아래의 글자와 대조적으로 비교하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색을 위해, 샘플을 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 일련의 등급화된 에탄올 및 자일렌을 통해 탈수시켰다. 파라핀에 매립하고 두께 4 μm로 절단하였다. 섹션을 파라핀 제거하고 통상적인 방식으로 H & E로 염색하였다. 제조업체의 프로토콜 (Polysciences, PA, Warrington, PA)에 따라 샘플에서 콜라겐 물질을 평가하기 위해 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법을 수행하였다.
이종 항원의 유무를 평가하기 위해, 다음 프로토콜을 사용하여 AccuPower® Taq PCR PreMix & Master Mix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분 동안 변성한 후 95℃ 20초, 어닐링(51 ~ 55 ℃) 30초, 72℃에서 30초간 35회 사이클을 진행하였으며, 72℃에서 10분 동안 최종 연장을 진행하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 G-spin™ Total DNA Extraction Mini Kit (Intron, Seongnam, Korea) 를 사용하여 샘플당 4 개의 각막 조직으로부터 DNA를 수득하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표에서 자세히 나타내었다. PCR 산물을 1.5 % 아가로스겔 (Bioneer)에서 분리하고 RedSafe 핵산 염색 용액 (Chembio, Medford, NY)으로 시각화하였다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 서열(5‘-3’)
porcine endogenous retrovirus-gag (PERV) 포워드 CTACCCCGAGATTGAGGAGC
리버스 GGGGGATGGTTAGTTTTCCA
PERV polymerase 포워드 CTACAACCATTAGGAAAACTAAAAG
리버스 AACCAGGACTGTATATCTTGATCAG
swine leukocyte antigen DR alpha(SLA-DRA) 포워드 CGAGAAGAGGTGGCAAGACA
리버스 GTCCTGGAGGATTCCCTTGA
swine leukocyte antigen 2(SLA-2) 포워드 GTCACCTTGAGGTGCTGGG
리버스 TGGCAGGTGTAGCTCTGCTC
porcine beta-actin 포워드 TGTCATGGACTCTGGGGATG
리버스 GGGCAGCTCGTAGCTCTTCT
인간 각막 내피 세포주 세포 배양
hCEC-B4G12 세포주 배양을 위해, 코팅된 세포 배양 접시를 10 ㎍/mL 라미닌(Sigma) 및 10 ng/mL 콘드로이틴 설페이트(Sigma)를 사용하여 준비하였다. 제조자의 지시에 따라, 세포를 10 ng/mL 인간 재조합 섬유아세포 성장인자 (FGF)-2를 함유하는 인간 내피 무혈청 배지 (SFM; Gibco, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 37℃에서 2분 동안 0.25 % 트립신/EDTA (Welgene)를 사용하여 세포를 계대배양하였다. 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail, Sigma)로 효소 활성을 차단하였다.
인간 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 및 iPSC-유래된 각막내피세포 분화
가톨릭대학교에서 제공한 국립줄기세포은행(국립보건원)으로부터 인간줄기세포주 CMC-hiPSC-003을 수득하였다. 상기 세포를 growth factor-reduced Matrigel (Gibco, Carlsbad, USA)이 코팅된 세포 배양 플레이트상에서 배양하고, 제조사의 지시에 따라 TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technology, Vancouver, Canada)를 사용하여 유지시켰다. 본 발명에서는 각막내피세포로 분화시키기 위해 이전 프로토콜(Wagoner et al. 2018)을 약간 수정하였다.
간략하게는, 인간 유도만능줄기세포(iPSC)를 Gentle cell dissociation reagent (Gibco)을 사용하여 계대배양하고, 다음날, 배지를 DMEM/F12 (Gibco), 2 % bovine serum albumin (Sigma), 2 mM GlutaMAX (Gibco), 0.1 mM MEM non-essential amino acid solution (Gibco), 1×trace elements A, B, 및 C (Gibco), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (Gibco), 50 μg/mL (+)-sodium L-ascorbate (Sigma), 10 μg/mL transferrin (Sigma), 10 ng/mL recombinant human Heregulin β-1 (Peprotech; Rocky Hill, USA), 200 ng/mL recombinant human LONGR3 IGF-I (Sigma), 8 ng/mL recombinant human FGF2 (Peprotech), 및 0.2 % primocin (InvivoGen; San Diego, USA)를 함유하는 분화 기본배지로 교체하였다. 초기 단계로서, 인간 유도만능줄기세포(iPSC)를 기본배지에 10 μM SB431542 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 및 3 μM CHIR99021 (Miltenyi Biotec, Bergish Glabach, Germany)를 첨가하여 17일 동안 배양시켜 신경능세포(neural crest cells)로 유도하였다. 배지는 매일 교체해 주었다. 이후, CEC 유도 배지로 교체하였다. CEC 유도 배지는 기본배지 및 CEC 인자로 이루어져 있으며, CEC 인자는 0.1×B27 (Gibco), 10 ng/mL recombinant human PDGF-BB (Peprotech), 및 10 ng/mL recombinant human DKK-2 (Peprotech)를 포함한다. CEC 유도 배지는 30 일 동안 매일 교체해 주었다.
탈세포화된 이식편의 재세포화
탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판(DSE)을 롤링 방향을 아래로하여 48 웰 디쉬 상에 편평하게 놓고 40℃에서 밤새 건조 챔버에서 인큐베이션 하였다. hCEC-B4G12 세포주 또는 유도만능줄기세포(iPSC)를 수확하고, 세포 현탁액을 추가적인 세포외 기질 없이 0.5 mL의 배지에서 3×105 cells 최종 농도로 하여 이식편 상에 시딩(seeding)하였다. 시드된 스캐폴드를 정적 조건 하에서 5% CO2를 함유한 가습조건(humidified atmosphere)에서 37℃에서 7 일 동안 배양하였다. 배지는 매일 교체해 주었다.
세포 염색
유도만능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 각막내피세포(iCEC)의 면역세포화학적 검출을 위해, 마우스 및 래빗 특이적 HRP/DAB (ABC) 검출 키트 (Abcam, Cambridge, UK)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. P75/NGF 수용체 (Cell signaling Technology, Danvers, MA), Sox10 (Cell Signaling Technology), N-cadherin (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 Na+/K+ 펌프 (Millipore, MA, Burlington, MA)에 대한 1차 항체를 각막내피세포(CEC)에 사용하였다. 이식편에서 재분화된 세포의 생존력을 확인하기 위해, a live/dead cell viability/cytotoxicity assay kit(Thermo, MA, Waltham, MA)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 슬라이드 유리상의 염색된 조직의 영상화를 위해, z-적층된 이미지를 fluorescence imager(LionHeart FX)를 사용하여 처리 하였다.
조직 공학적 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식을 이용한 데스메막 각막내피이식술(DSEK)
유도각막내피세포(iCEC)-재세포화된 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편이 각막 내부 표면에 위치할 수 있는지 확인하기 위해, 이식편을 명확한 각막 절개를 통해 적출된 돼지 눈의 전방 챔버에 삽입하였다. 8-0 나일론 (NJ, Somerville, Ethicon)을 사용하여 각막 봉합사를 적용한 후, 기포 및 균형 잡힌 염용액을 30G 캐뉼라를 사용하여 주사하였다. 삽입된 이식편의 위치를 확인하기 위해 초음파 촬영 (ProSound Alpha7; Hitachi Healthcare Americas, OH 트윈스 버그)을 수행하였다.
통계분석
실험 데이터는 p-값 (.05)을 갖는 분산 분석 (ANOVA) 및 GraphPad Prism7 통계 프로그램 (San Diego, CA)에 의해 통계적으로 분석되었다.
2. 결과
데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편의 투명도 및 두께
순차적인 단계에 따라 각 방법에서 각막의 총 모양을 관찰하였다(도 2, Method A 및 Method B). 돼지 눈에서 전체 두께의 각막을 제거한 후 사진을 촬영하였다(도 2A, Method A(a)). 방법 A에서, 신선한 각막으로부터 데스메막박리 각막내피층판(DSE)을 분리하여 사진을 찍고(도 2A, Method A(b)), 0.1% SDS에서 5시간 및 10시간 동안 탈세포화하였다. 5시간 동안 탈세포화시킨 DSE(도 2A, Method A(c)), 10시간 탈세포화시킨 DSE(도 2A, Method A(d))를 비교한 결과 탈세포화 시간이 증가함에 따라 투명성이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 방법 B에서, 데스메막(DM) 및 후방 기질의 양 끝부분 영역을 12mm 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 완전 두께의 각막(도 2A, Method B(a))은 5시간 동안 0.1% SDS에 의해 탈세포화로 인해 투명도가 현저하게 감소한 것으로 나타났다(도 2A, Method B(b)). 전체 두께의 각막을 5시간 동안 0.1% SDS에 침지시킨 직후에 분리된 DSE 이식편은 매우 투명한 것으로 나타났다(도 2A, Method B(c)). 상기 DSE 이식편을 10시간 동안 0.1% SDS에서 탈세포화시킨 경우 탈세포화 전 DSE와 비교하여 투명성이 시각적으로 감소하지 않았다(도 2A, Method B(d)). 특히, 방법 B에서 탈세포화 전 DSE 이식편 대비 탈세포화를 거친 DSE 이식편에서 아래 알파벳 문자가 더 잘 보이는 것으로 나타났다.
방법의 종류에 따른 각 단계별 이식편의 투명도를 분석하였다. 자세한 결과는 하기 표 2 및 도 2B에서 자세히 나타내었다.
방법의 종류에 따른 각 단계별 이식편의 투명도 (*p< .05)
방법 A 단계 전체 두께 0h DSE 0h 탈세포화 5h 탈세포화 10h
투명도(%) 84.9±10.8 93.9±2.1 90.7±9.9 69.8±4.8*
방법 B 단계 전체 두께 0h 탈세포화 5h DSE 0h 탈세포화 10h
투명도(%) 87.7±6.8 41.8±2.5* 95.8±2.1 90.0±5.0
*p< .05
방법 A에서 전체 각막 조직의 투명도는 84.9 ± 10.8%로 나타났으며, DSE의 투명도는 93.9 ± 2.1%, 5시간 탈세포화시킨 DSE 투명도는 90.7 ± 9.9%, 10시간 탈세포화시킨 DSE 투명도는 69.8 ± 4.8%인 것으로 나타났다.
한편, 방법 B에서 전체 각막 조직의 투명도는 87.7 ± 6.8%, 전체 각막을 5시간 동안 탈세포화시킨 경우 투명도가 41.8 ± 2.5%로 나타났다. 이후, 전체 각막으로부터 분리시킨 DSE의 투명도는 95.8 ± 2.1%로 나타났으며, 10시간 동안 탈세포화시킨 DSE 투명도는 90.0 ± 5.0 %으로 나타났다.
방법 A 및 방법 B 모두, 탈세포화 시간이 길어질수록 수분 흡수에 따른 투명도가 낮아지는 것으로 나타났다. 한편, 10시간의 탈세포화를 마치고 최종적으로 수득되는 DSE의 투명도의 경우, 방법 A 대비 방법 B가 두드러지게 우수한 것을 보여주었다. 특히, 방법 B를 통해 수득되는 탈세포화 완료된 DSE의 경우 90.0 ± 5.0 % 투명도를 보여주고 있으며, 이러한 수치는 대조군하고 거의 유사한 수치를 보여주었다(도 2B 참조). 참고로, 대조군으로는 투명한 슬라이드 유리를 사용하였다.
또한, 방법의 종류에 따른 각 단계별 이식편의 두께를 분석하였다. 자세한 결과는 도 2C에서 자세히 나타내었다.
그 결과, 각막 전체 두께는 1240 ± 225 μm이고, 전체 각막을 10시간 동안 탈세포시키는 경우 두께가 4237 ± 423 μm인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 전체 두께의 각막이 0.1% SDS에서 탈세포화 동안 물을 함유하여 두께가 3배 이상 증가한 것을 보여준다.
방법 A에서, DSE 두께는 172.9 ± 102 μm이고, 10시간 동안 탈세포화시킨 DSE 두께는 233.4 ± 12 μm로 나타나, 탈세포화 동안 두께가 증가하였다. 방법 B에서, DSE 두께는 70.17 ± 23㎛이고 10시간 동안 탈세포화시킨 DSE 두께는 113.0 ± 35㎛인 것으로 나타났다. 방법 B에서의 탈세포화 완료된 DSE의 두께는 방법 A의 탈세포화 완료된 DSE 두께의 50 % 미만으로, 대략 48.5 %인 것으로 나타났다.
이러한 결과는, 방법 B를 통해 제조된 탈세포화시킨 DSE가 방법 A를 통해 제조된 탈세포화시킨 DSE 대비 수분을 덜 보유하기 때문에, 기질이 적다는 것을 시사한다.
결과적으로, 방법 B를 통해 제조된 탈세포화시킨 데스메막박리 각막내피층판(DSE)이 높은 투명도 및 얇은 두께로 인해 인공 DSE 이식편으로 적합한 것을 알 수 있었다.
탈세포화를 위한 최적 조건
데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편의 최적 탈세포화 시간을 확인하기 위해, DAPI 염색을 실온에서 0.1% SDS에서 0 시간, 4 시간, 6 시간 및 10 시간 동안 탈세포화에 사용하였다. 탈세포화 후 4 시간에서 6 시간이 경과하는 경우 세포가 서서히 사라지는 것으로 나타났으며, 10 시간이 되었을 때 세포가 완전히 사라진 것을 확인할 수 있었다(도 3A 참조).
다음으로, 탈세포화를 위한 온도를 최적화하기 위해 다른 조건을 일정하게 유지하면서 온도 조건 (4℃ vs. RT)을 변경하였다. 각각의 온도에서 10 시간 동안 탈세포화시켰을 때, 4℃에서 탈세포화를 진행한 경우 세포가 유지된 반면, 실온(RT)에서 탈세포화를 진행한 경우 세포가 완전히 제거된 것으로 나타났다(도 3B 참조). 탈세포화 정도는 실온 조건이 4℃ 보다 훨씬 효과적인 것으로 나타났다. SDS에 의한 세포 파괴는 4℃보다 실온에서 상대적으로 더 활발한 것으로 추정되었다.
본 실험에서는 또한, 탈세포화 과정을 통해 돼지 유래 면역원성 항원이 유지되는지 여부를 확인하였다. 그 결과 도 3C에서 나타낸 바와 같이, PERV, PERV 중합 효소, SLA-DRA, SLA-2 및 돼지 베타-액틴의 DNA 서열은 무손상 이식편과 달리 탈세포화된 이식편에서 검출되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 0.1% SDS에서 10시간 동안 탈세포화 과정이 제대로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
한편, 방법 B로 제조된 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편이 온전한 각막과 비교하여 온전한 데스메막(DM) 및 후방 기질(posterior stromal) 구조를 유지함을 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색법을 통해 확인하였다(도 4A). 본 발명에서는 0.1% SDS 농도를 사용하였으나, 일부 이전의 연구에서는 완전 두께 각막의 탈세포화를 위해 1% SDS 사용이 보고된바 있다(Du et al. 2011, He et al. 2016). 따라서, 본 발명자들은 1% SDS와 0.1% SDS 농도에서의 탈세포화 정도를 비교하였다. 결과적으로, 1% SDS를 이용하여 탈세포화를 진행한 경우 데스메막(DM)의 구조가 파괴되고 기질의 매트릭스도 변형되는 것으로 나타났다. 한편, 상기 두 가지 SDS 농도 조건 모두에서 세포가 제거된 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 0.1% SDS가 구조적 열화없이 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편을 탈세포화 하기에 우수함을 알 수 있었다.
메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법을 사용하여 콜라겐 매트릭스를 측정한 결과, 0.1% SDS를 사용하여 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편에서 콜라겐 매트릭스가 남아있는 반면, 기질의 돼지 세포는 탈세포화 후에 제거됨을 확인하였다(도 4B 참조).
탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편의 재세포화 가공화 조건
본 실험에서는 투명하고, 초박막이며 균질하게 재세포화된 DSE 이식편을 생산하기 위해, 세포 시딩(seeding)을 위한 이식 조건을 최적화하였다. 습식의 탈세포화된 DSE 이식편이 세포 시딩을 위한 배지에서 배양 플레이트에 배치될 때, 이식편이 팽창되어 12 시간 내에 두껍게 되고 불투명해지기 시작했다. 또한, 습식 이식편은 배지에서 쉽게 부유하고 말려서 세포 시딩(seeding)에 어려움이 있음을 발견 하였다(도 5A 참조).
따라서 이식편을 다양한 온도(-70, 40 및 60℃) 조건에서 건조해 보았다. 그 결과, 40℃에서 밤새 건조시킨 경우, 롤링 상태가 사라지고 투명도가 증가하는 것을 확인하였다. 한편, 60℃에서 건조된 이식편은 수축되었으며, -70℃에서 동결 건조된 이식편은 불투명하고, 수축되었으며, 플레이트로부터 분리되는 것을 확인하였다(도 5B 참조).
세포 시딩(seeding) 후 습식 대 건식 DSE 이식편의 투명성, 두께, 롤링 및 세포 부착 정도를 비교하기 위해, hCEC-B4G12 세포를 이식편에 재세포화하고, 7일 동안 배양하였다. 건식 DSE 이식편의 경우 배양 중에 이식편이 말리거나(롤링), 뜨거나 부풀어 오르지 않았다. 또한, 습식 이식편과 달리 투명도가 현저히 우수한 것으로 나타났다(도 5C 참조).
슬라이드 글래스에 재세포화된 DSE 이식편의 전체적인 외관에서, 건조 이식편의 투명도는 대조군과 유사하게 나타났으며, 이는 습식 이식편의 투명도보다 훨씬 높은 것을 알 수 있었다(그림 5D 참조).
또한, 본 발명자들은 조직학적으로 재세포화된 건조 이식편이 습식 이식편보다 훨씬 얇다는 것을 확인하였다. 투명도 분석은 대조군을 기준으로 건식 이식편이 91.8 ± 2.38 % 인 반면, 습식 이식편 단지 50.6 ± 6.38 %인 것으로 나타났다(도 5E).
다음으로, 건식 및 습식 조건에서 세포의 분포, 부착 및 생존율을 평가하기 위해 재세포화된 이식편의 살아있는 세포(녹색)/죽은 세포(적색) 염색을 수행하였다. 건식 이식편에 재분배된 세포의 대부분은 생존, 부착 및 분포되어 있는 것으로 나타났다. 반면에, 습식 이식편에 재분배된 세포는 고르게 분포되어 부착되지 못한 것으로 나타났다(도 5F). 이와 같은 이유는, 배양 배지에서 이식편의 말림(rolling)와 부유(floating) 때문일 것으로 사료되었다.
마지막으로, 재세포화된 이식편의 두께를 비교하였다. 재세포화 전에, 방법 B에 의해 제조된 습식 및 건식 이식편의 두께는 각각 113 ± 0.35 μm 및 57.6 ± 7.92 μm로 나타났다. 한편, 배양 7 일 후, 습식 이식편의 두께는 222.6 ± 24.2 μm로 증가한 반면, 건식 이식편은 99.2 ± 5.98 μm로 나타나 초박막인 것을 확인하였다(도 5G).
상기와 같은 결과를 통해, 세포 시딩(seeding) 전에 40℃에서 DSE 이식편을 건조하는 과정을 거치는 것이, 재세포화 이식편의 투명도와 초박형을 유지하는데 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 건조 이식편을 사용하는 것이 세포가 균질하게 재분배된 이식편을 생성하는데 우수하였다.
데스메막박리 각막내피층판(DSE) 이식편에서 유도만능줄기세포로부터 분화된 각막내피세포(iCECs)의 재세포화
인간 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 각막내피세포(CEC)를 생산하기 위해, 첫 번째 단계로서, 인간 유도만능줄기세포(iPSC)를 신경능선유사세포(neural crest-like cells, NCC)로 분화시켰다. 그 결과, 인간 유도만능줄기세포(iPSC)의 군집 상태(도 6A, D0)는 없어지고 형태는 길쭉한 구조로 바뀌었다. 신경능선유사세포(NCC)는 3일 동안 SB431542 및 CHIR99021을 첨가하여 생산되었으며, 약 17 일 동안 신경능선세포 표현형을 유지할 수 있었다(도 6A, D13). 다음 단계로, 신경능선유사세포(NCC)는 B27, PDGF-BB 및 DKK-2에 노출되어 5일 이내에 6각형의 모양이 단단한 각막내피세포(CEC)와 같은 분화를 일으켰다(그림 6A, D22). 유도 후 3 내지 17일에, p75/신경성장인자 수용체(NGFR) 및 SRY-박스 전사인자 10 (SOX10)의 NCC 마커가 양성으로 발현되었다. 각막내피세포(CEC) 분화 23 일에, N- 카드헤린(N-Cad), 졸라오클루덴스-1 (ZO-1) 및 Na+/K+ ATPase 마커의 발현이 확인되었다(도 6B 참조).
배양 7일 후, iCEC-재세포화된 이식편은 hCEC-B4G12 재세포화된 이식편과 유사하게 투명하고 매우 얇은 것으로 나타났다(도 6C). 재세포화된 iCEC가 고르게 퍼지고, 대부분의 세포가 살아남 았으며, hCEC 라인과 유사한 건조 DSE 이식편에 잘 부착되어 있음을 확인하였다(그림 6D). 재세포화된 이식편의 H & E 염색은 초박형 DSE 이식편에 분포된 얇은 iCEC 층을 보여주었다(도 6E). 배양하는 동안, 두께는 초박형으로 유지되었으며, 구조적 변형은 나타나지 않았다.
본 실험에서는 재세포화된 이식편 및 제핵된(enucleated) 돼지 눈을 사용하여 데스메막박리 각막내피층판 이식술(DSEK)를 시연하였다. 데스메막(DM) 및 내피(endothelium) 층이 제거된 돼지 눈의 전방 챔버 내로 재세포화된 이식편을 삽입한 후, 이식편을 각막의 내부에 위치시켰다(도 6F).
이러한 결과는 본 발명의 DSE 이식편이 줄기세포를 사용하여 투명성 및 초박형 인공 DSE 이식편을 생성하는데 유리하다는 것을 시사하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
DSE: Descemet stripping endothelial
iPSC: induced pluripotent stem cell
iCECs: induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived corneal endothelial cells
CED: Corneal endothelial dystrophy
FECD: Fuchs endothelial corneal dystrophy
DM: Descemet’s membrane
CEC: corneal endothelial cell
PK: penetrating keratoplasty
EK: endothelial keratoplasty
ROCK: Rho kinase
DLEK: deep lamellar endothelial keratoplasty
DSEK: Descemet’s stripping endothelial keratoplasty
DMEK: Descemet membrane endothelial keratoplasty

Claims (8)

  1. a) 동물의 각막을 준비하는 단계;
    b) 상기 각막에서 각막내피(corneal endothelium), 데스메막(Descemet membrane) 및 후방 기질(posterior stroma)의 양 끝부분을 생검 펀치를 이용하여 절개(incision)한 후 1차 탈세포화시키는 단계;
    c) 1차 탈세포화된 각막에서 데스메막박리 각막내피층판을 박리하는 단계;
    d) 박리된 데스메막박리 각막내피층판을 2차 탈세포화시키는 단계; 및
    e) 2차 탈세포화된 데스메막박리 각막내피층판을 15 내지 45℃에서 건조시키는 단계를 포함하는, 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계에서 탈세포화는 0.1 내지 0.5% SDS 농도 조건 하에서 진행되는 것을 특징으로 하는 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계에서 탈세포화는 실온에서 8시간 내지 12시간 진행되는 것을 특징으로 하는 각막내피세포 이식용 인공 지지체 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 각막내피세포 이식용 인공 지지체.
  6. 제5항의 지지체에 세포를 이식하여 재세포화시킨 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 유래된 각막내피세포(corneal endothelial cells)인 것을 특징으로 하는 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 이식편은 90 내지 120 μm 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 초박형 데스메막박리 각막내피층판 이식편.
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