CN109420178A

CN109420178A - 多价穿膜肽类生物大分子递送载体及其应用

Info

Publication number: CN109420178A
Application number: CN201710786880.3A
Authority: CN
Inventors: 魏刚; 江宽; 陆伟跃; 高欣
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2019-03-05

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及利用多臂聚乙二醇与穿膜肽或穿膜肽衍生物构建的系列多价穿膜肽递送载体及其复合物。所述多价穿膜肽递送载体具有章鱼样的柔性结构，可与生物大分子尤其是基因自组装形成非共价复合物，具有很强的携载生物大分子、递送生物大分子以及眼组织穿透能力，且不产生眼组织毒性，可通过无创途径实现生物大分子药物向眼内或眼底的有效递送，并增加眼组织对生物大分子药物的摄取。将所述多价穿膜肽递送载体与生物大分子自组装形成的复合物用于滴眼给药，可替代患者顺应性差的眼内注射给药，增强治疗眼内和眼底疾病的便利性和安全性。

Description

多价穿膜肽类生物大分子递送载体及其应用

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及多价穿膜肽类生物大分子递送载体，具体涉及利用多臂聚乙二醇与穿膜肽或穿膜肽衍生物构建的系列多价穿膜肽递送载体及其复合物。所述多价穿膜肽递送载体具有章鱼样的柔性结构，可与生物大分子尤其是基因自组装形成非共价复合物，具有很强的携载生物大分子、递送生物大分子以及眼组织穿透能力，且不产生眼组织毒性，可通过无创途径实现生物大分子药物向眼内或眼底的有效递送，并增加眼组织对生物大分子药物的摄取。

技术背景

据资料显示，眼睛作为人体最重要的感觉器官，其独特的生理结构能保护其免受外源性物质侵入，但也不利于药物的眼内递送；眼部的生理屏障包括静态屏障(如角膜上皮屏障、血-眼屏障等)和动态屏障(如泪液冲刷等)，是阻碍药物吸收的主要原因(DrugDiscovery Today,2008,13(3-4):135-143；Adv.Drug Delivery Rev.,2006,58(11):1131-1135)。研究表明，眼睛是多肽、蛋白质、基因等生物大分子治疗的理想部位，这是因为眼球体积相对较小，需要生物大分子给药剂量小；眼睛具有免疫赦免特权，可以一定程度上减少外源性物质引起的炎症和免疫反应；局部给药方便，能有效避免体内复杂生理环境(Br.J.Ophthalmol., 2011,95(5):604-612.)。

目前市售的眼用制剂以滴眼剂、眼用凝胶剂和眼膏剂等剂型为主。临床实践中，滴眼剂滴入结膜囊后，药物主要透过角膜或结膜向眼内转运；由于人眼结膜囊容积有限，再加上泪液稀释和鼻泪管流失等原因，通常滴眼剂的生物利用度小于5％，而且，由于从眼表面到眼底较长的扩散距离和房水在眼内的对流，极少药物(<0.001％)可以到达眼后段组织(J.Controlled Release,2014,193:100-112)。

全身给药是临床上治疗眼部疾病的另一途径，但实践表明，由于血-眼屏障 (如血-视网膜屏障)的阻碍，药物经全身给药后很难到达视网膜组织和玻璃体腔内；另外，由于大量药物进入体循环，大剂量频繁给药还存在引起全身性副作用的风险(Invest.Ophthalmol.Visual Sci.,2000,41(5):961-964)，生物大分子药物经此途径用于眼部治疗，不仅加剧全身非靶部位副作用的风险，更会带来不必要的药物浪费。

眼内注射(如玻璃体内注射)和眼周注射(如巩膜下注射)是目前临床上生物大分子药物用于治疗眼内疾病和眼底疾病最为有效的给药途径(Eur.J.Pharm. Biopharm.,2015,95:331-342)之一，如对于老年黄斑变性的治疗，临床上主要是通过玻璃体内注射给予血管内皮生长因子抑制剂，如单克隆抗体药物雷珠单抗、贝伐单抗、康柏西普等，以及基因药物哌加他尼钠等，借助这些创伤性的给药方式，药物可直接到达眼内，起效快、生物利用度较高，但反复注射可能会引起多种并发症(如视网膜脱落、眼内炎等)，患者难以接受，顺应性差(EYE,2013, 27(7):787-794)。

综合考虑各种眼内和眼底药物递送方法，滴眼剂对眼部无创伤性，并且制备成本低、使用方便、患者顺应性好，是临床上最理想的眼用剂型，但其主要的问题在于药物难以吸收进入眼内，更难以到达眼底部位。采用药剂学方法，在滴眼剂处方中加入吸收促进剂，可以有效提高药物的眼内递送效率。

穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一种生理条件下荷正电的短肽，可以介导共价或非共价连接的分子(如基因、多肽和蛋白质等)或给药系统(如脂质体、纳米粒等)进入细胞(J.Controlled Release,2011,155(1SI):26-33； Biomaterials,2013,34(32):7980-7993)。来源于果蝇触角足与DNA结合域的穿膜肽penetratin具有很强的眼组织穿透能力，而且不会产生眼部细胞毒性(Mol. Pharm.2014,11(4):1218-1227)。有报道在几种非创伤性的眼部递药系统中， penetratin作为吸收促进剂，可以介导报告基因到达眼后段并在视网膜高效表达 (ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8(30):19256-19267；Nanomedicine:NBM, 2017,13:2091-2100；Int.J Pharmaceut.,2017,529:347-356；中国发明专利申请： CN201610560173.8)。

基于已公开文献报道对眼组织穿透能力较强的天然来源多肽penetratin，通过人工设计和改造得到一系列penetratin衍生物(中国发明专利申请：CN2017104143347)，此类多肽衍生物作为眼部吸收促进剂，滴入结膜囊后，可以更有效地递送共价连接或非共价连接的药物分子到达眼后段组织，并且保留了野生型penetratin良好的眼部安全性。

穿膜肽能够与基因、多肽和蛋白质等生物大分子自组装形成复合物，并将生物大分子递送至细胞内或携载其穿透生物膜屏障。但是，单个穿膜肽携载生物大分子的能力非常有限，进而导致所形成的复合物粒径较大、稳定性差，而且促进生物大分子被细胞摄取或穿透生物膜屏障的能力也比较弱。因此，穿膜肽需要借助聚合物载体共同携载生物大分子，以实现更有效的生物大分子递送，并帮助生物大分子从细胞的内涵体中逃逸出来，但是，常用的聚合物载体，如聚乙烯亚胺 (PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)等，在体内无法降解，尤其分子量较大时，或在处方中浓度较高时，会产生一定的细胞或组织毒性，因此临床应用具有较大的局限性。

如何增强穿膜肽携载生物大分子的能力，使其能够更好地发挥递送生物大分子的作用，同时确保所构建的递送系统具有良好的生物安全性，并且能够在体内降解和消除，是现有技术尚未解决的问题。

基于现有技术的现状，本发明拟提供一系列多价穿膜肽类生物大分子递送载体。此类载体由穿膜肽或其衍生物修饰在多臂聚乙二醇的末端制备而成，具有章鱼样的柔性结构，每个分子中含有多个穿膜肽或其衍生物，可以与生物大分子自组装形成非共价复合物，进而提高对基因、多肽和蛋白质等生物大分子的携载效率，能够更有效地将生物大分子递送至细胞内或携载生物大分子穿透生物膜屏障，并利用“质子海绵”效应帮助生物大分子从内涵体中逃逸。利用此类载体制备的生物大分子复合物，通过结膜囊内滴眼给药，能够突破眼部的吸收屏障，将生物大分子高效递送至眼内或眼底，随后此类载体能够在酶的作用下降解并最终从眼内消除，具有良好的生物安全性。这种无创给药方式可改善生物大分子的局部吸收，避免生物大分子在非靶组织蓄积，显著提高利用生物大分子进行治疗的顺应性和安全性。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术中聚合物类生物大分子递送载体眼部应用递送效率低而且易产生眼组织毒性等问题，提供一类人工合成的多价穿膜肽类生物大分子递送载体及其制备方法。所述的多价穿膜肽递送载体具有章鱼样的柔性结构，可生物降解，能够与基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物自组装形成复合物，通过非创伤途径滴眼给药可将生物大分子药物递送至眼内或眼底部位，进而促进此类药物发挥治疗作用。

本发明针对目前临床实践中存在的问题，如，利用生物大分子药物对眼内或眼底疾病进行治疗时，主要给药方式为玻璃体内注射，但患者顺应性差，且可能导致严重的并发症；穿膜肽或其衍生物作为眼部吸收促进剂，可以与基因、多肽和蛋白质等生物大分子自组装形成复合物，并介导与其非共价结合的生物大分子穿透眼部吸收屏障，但是，穿膜肽携载生物大分子的能力非常有限，进而导致所形成的复合物粒径较大、稳定性差，而且促进生物大分子被细胞摄取或穿透生物膜屏障的能力也比较弱，等等。

本发明提供了多价穿膜肽类生物大分子递送载体，将穿膜肽或其衍生物共价修饰到多臂聚乙二醇的末端，制得含有多个穿膜肽且具有章鱼样多臂、柔性结构的递送载体，其结构如图1所示；与游离的穿膜肽或其衍生物相比，本发明制备的多价穿膜肽递送载体具有更强的携载生物大分子的能力，并保留穿膜肽或其衍生物固有的促进吸收功能，能够与基因、多肽和蛋白质等生物大分子形成粒径更小、结构更紧密的复合物，显著改善生物大分子的递送效果，不仅能够促进细胞对生物大分子进行摄取，而且还有助于生物大分子逃逸到细胞浆中发挥其生物功能。尤其是，所述多价穿膜肽递送载体在体内能够被酶所降解，与现有的聚合物载体相比具有更好的生物安全性，所述多价穿膜肽递送载体与生物大分子形成的复合物对眼组织穿透能力强、生物安全性高，用于眼部给药能够介导生物大分子药物尤其是基因药物高效地透过眼部的吸收屏障，可通过非创伤途径将基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物递送至眼内或眼底部位，进而提高生物大分子药物的眼部生物利用度和疾病治疗效果。

更具体的，本发明提供的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其包括，将穿膜肽或其衍生物共价修饰在多臂聚乙二醇侧臂的末端，形成具有章鱼样多臂、柔性结构的多价穿膜肽递送载体；其中，所述多臂聚乙二醇以甘油(glycerol)、季戊四醇(pentaerythritol)、二季戊四醇(dipentaerythritol)、三季戊四醇(tripentaerythritol)或六聚甘油(hexaglycerol)等多元醇为内核，在内核的醇羟基上延伸出聚乙二醇侧臂；所述的多臂聚乙二醇主要包括3臂、4臂、6臂及8 臂聚乙二醇，每条聚乙二醇侧臂含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度n介于1至225，优选2至100，进一步优选5至50；

本发明中，根据侧臂数目和侧臂所含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度不同，多臂聚乙二醇的分子量介于200至80000；

本发明中，每条聚乙二醇侧臂的游离末端可进行特定的化学基团修饰以方便与穿膜肽或穿膜肽衍生物相互连接，常见的修饰基团为马来酰亚胺基、异硫氰基或羧基。

本发明中，所述穿膜肽或穿膜肽衍生物选自但不限于从HIV病毒中发现的反式激活蛋白TAT(Science 1999，285:1569–1572)、来源于果蝇触角足与DNA 结合域的penetratin(Nat.Cell Biol.2004，6:189–196)、人工合成的寡聚精氨酸 poly(arginine)_n(其中n＝4-20)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97:13003–13008)、鱼类精子细胞核中与DNA结合的核精蛋白protamine和截取自其部分功能序列的低分子量protamine；本发明所述穿膜肽不仅包括野生型多肽penetratin(氨基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK)，还包括其一系列亲脂性衍生物；

所述的Penetratin亲脂性衍生物的氨基酸序列如表1所示(参见中国发明专利申请CN2017104143347，)此处引述如下：

表1Penetratin衍生物氨基酸序列

本发明所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体保留了穿膜肽的特性，可以与基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物自组装形成复合物；由于多个穿膜肽分子被多臂聚乙二醇连接在一起，相比于单个的游离穿膜肽，所述的多价穿膜肽与生物大分子结合更紧密、稳定性更好，更利于实现生物大分子药物的体内递送。

本发明中，上述生物大分子药物选自但不局限于下列药物中的一种或它们的复方：

1)基因药物：选自质粒DNA(pDNA)、哌加他尼(Pegaptanib)、贝伐西尼(Bevasiranib)、反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide)、小干扰RNA等；

2)单克隆抗体药物：选自贝伐单抗(Bevacizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)等；

3)其他多肽蛋白类药物：选自抗血管内皮生长因子(VEGF)融合蛋白康柏西普(Conbercept)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、干扰素α (Interferon-α)等。

本发明中，所述的多价穿膜肽递送载体与基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物自组装形成非共价复合物，经结膜囊内滴眼给药后，可促进药物穿过诸多眼部吸收屏障(角膜、结膜、巩膜等)进入眼内，甚至将其携带的基因、多肽和蛋白质等生物大分子药物递送至眼后段的视网膜部位。

本发明中，所述利用多价穿膜肽递送载体与生物大分子构建的非共价复合物中，所含穿膜肽的浓度折算为单分子穿膜肽后介于0.1μM至1200μM，优选1μM 至600μM，进一步优选1μM至100μM。

本发明中，所述利用多价穿膜肽递送载体与生物大分子构建的非共价复合物中，所含多价穿膜肽与生物大分子的摩尔比介于1:2至300:1(多价穿膜肽:生物大分子，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)；优选1:1至200:1 (多价穿膜肽:生物大分子，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)；进一步优选1:1至100:1(多价穿膜肽:生物大分子，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)。

本发明中，所述利用多价穿膜肽递送载体与生物大分子构建的非共价复合物，粒径介于1nm至1000nm，优选10nm至800nm，进一步优选50nm至500 nm；这种通过非创伤途径给药的眼内递药系统有助于促进生物大分子药物在眼部的吸收，提高生物大分子药物的眼部生物利用度，在临床上可替代眼内注射等患者顺应度低的给药方式。

为了直观地展示本发明中所述的多价穿膜肽递送载体对生物大分子药物的眼部吸收促进效果，本发明以多价penetratin为例，以反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotide)、质粒DNA(pDNA)等作为生物大分子药物模型，分别构建了携载反义寡核苷酸和携载质粒DNA的非共价复合物。通过一系列体外和体内实验，考察了基于多价penetratin构建的非共价复合物的眼部细胞摄取能力以及经结膜囊内滴眼给药后在活体动物眼部的吸收与分布，结果表明，与游离的单分子 penetratin相比，多价penetratin具有显著增强基因眼内递送效果的能力。

本发明所述的多价穿膜肽递送载体的优点在于，相对于现有的生物大分子递送载体，该多价穿膜肽无致病性，且易于在体内降解，因而生物安全性更好；另一方面，多价穿膜肽保留了游离穿膜肽固有的良好眼内药物递送能力，可通过非创伤性的给药途径实现生物大分子药物的眼内递送，有利于提高患者顺应性，而且，所述的多价穿膜肽相对于游离穿膜肽具有更强的携载生物大分子和向眼内递送生物大分子的能力。

附图说明

图1：多价穿膜肽类生物大分子递送载体结构示意图。

图2：多价penetratin的合成。

图3：多价penetratin的结构表征，

其中，HPLC检测中样品浓度为5mg/mL。核磁氢谱表征中，样品浓度为3 mg/mL。

图4：多价penetratin细胞毒性评价，

其中，人角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞与多价penetratin分别孵育12h，采用MTT法检测实验组相对于阴性对照组细胞存活率。

图5：多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞摄取定性评价，

其中，人角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞与多价penetratin-FAM共价复合物分别孵育4h后测定，样品浓度为3μM(以单分子penetratin计)。

图6：多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞内分布评价，

图7：多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞摄取定量评价，

其中，人角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞与多价penetratin衍生物-FAM共价复合物分别孵育4h后测定，Fm为细胞平均荧光强度值。

图8：多价penetratin与反义寡核苷酸构建非共价连接复合物处方筛选，

其中，图A为不同摩尔比(其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)条件下，多价penetratin与反义寡核苷酸非共价复合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；图B为不同摩尔比(其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)条件下8价penetratin与反义寡核苷酸非共价复合物与角膜上皮细胞孵育 1h后摄取情况；图C为不同摩尔比(其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量)条件下8价penetratin与反义寡核苷酸非共价复合物与结膜上皮细胞孵育1h后摄取情况。

图9：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物粒径、电势与稳定性评价，

其中，图A为各组非共价复合物粒径值；图B为各组非共价复合物表面电势；图C为不同时间点(0,0.5h,1h,2h,4h,6h,12h,24h,48h)各组非共价复合物粒径变化情况。

图10：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物形态学评价，

其中，A列标尺为200nm，B列标尺为100nm，C列标尺为50nm。

图11：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞内分布评价，

其中，人角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞与多价penetratin/反义寡核苷酸非共价复合物分别孵育4h后测定，每组复合物均含1.32μg反义寡核苷酸。其中，LIPO/ASO为市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000与反义寡核苷酸的非共价复合物。

图12：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞摄取定量评价，

图13：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞毒性评价，

其中，人角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞与复合物Pe/ASO、4VP/ASO、 8VP/ASO分别孵育12h，采用MTT法检测实验组相对于阴性对照组细胞存活率。

图14：多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物在活体小鼠眼内的分布，

其中，图A为结膜囊给药后10min，各组非共价复合物在小鼠全眼分布情况；图B为结膜囊给药后10min，各组非共价复合物在小鼠眼前段(角膜)和眼后段(视网膜)分布情况。

图15多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物的眼部消除评价，

其中，结膜囊给药后，不同时间点(10min,30min,1h,2h,4h,6h) 游离反义寡核苷酸以及各组非共价复合物(Pe/ASO,4VP/ASO,8VP/ASO)在小鼠视网膜分布情况。

图16多价penetratin与质粒DNA(pDNA)非共价连接复合物的细胞转染效果评价，

其中，293T细胞与多价penetratin/质粒DNA非共价复合物以及 Lipofectamine2000/质粒DNA非共价复合物分别孵育4h，换液继续培养48h 后测定，质粒浓度为1μg/mL。

具体实施方式

以下结合本发明的具体实施例进一步阐明本发明，但并不限制其保护范围。

实施例1

多价穿膜肽(multi-valent peptide)的制备：由4臂聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(4-arm PEG，分子量5000±500Da)或8臂聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(8-arm PEG，分子量10000±1000Da)与N末端修饰半胱氨酸的penetratin (Cys-penetratin)经一步反应得到。具体的，将4-arm PEG(1.0mg)溶于磷酸缓冲溶液(10mM,pH7.2)中，在搅拌状态下加入溶于相同介质中的Cys-penetratin (2.0mg)，继续搅拌过夜使反应完全。反应结束后，将所得混合物在冰浴条件下透析2天，冷冻干燥得到白色絮状物4价penetratin(4-valentpenetratin，4VP)。 8价penetratin(8-valent penetratin，8VP)采用相同的合成方法制备；

其他多价穿膜肽的制备方法相同，由多臂聚乙二醇衍生物(multi-arm PEG) 与穿膜肽经一步反应得到，包括多臂聚乙二醇末端马来酰亚胺基团与穿膜肽分子中半胱氨酸的巯基、多臂聚乙二醇末端异硫氰基与穿膜肽分子中的游离氨基以及多臂聚乙二醇末端羧基与穿膜肽分子中的游离氨基之间发生一步反应，反应路线如下：

multi-arm PEG+peptide→multi-valent peptide

对于多臂聚乙二醇衍生物的选择，包括3臂聚乙二醇衍生物、4臂聚乙二醇衍生物、6臂聚乙二醇衍生物以及8臂聚乙二醇衍生物等，末端修饰基团包括马来酰亚胺基、异硫氰基、羧基等。聚乙二醇侧链含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度 n介于1至225，优选2至100，进一步优选5至50，或多臂聚乙二醇分子量介于200至80000；

对于多肽的选择，包括TAT、penetratin、poly(arginine)_n(其中n＝4-20)、protamine或低分子量protamine等穿膜肽，以及上述穿膜肽的衍生物。其中，穿膜肽penetratin的氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK，其衍生物的氨基酸序列见表1。为了方便与多臂聚乙二醇末端基团反应，上述穿膜肽及其衍生物的 N-端或C-端可额外增加一个半胱氨酸(cysteine,C)或赖氨酸(lysine，K)。

实施例2

多价penetratin的表征：利用高效液相色谱进行表征，选择Sepax Bio-C4柱 (4.6×150mm,5μm)；柱温25℃；流动相乙腈(0.1％三氟乙酸):水(0.1％三氟乙酸)，5～65％乙腈梯度，30min；流速0.8mL/min；检测波长214nm；进样量20μL；样品浓度5mg/mL；

结果表明，与多臂聚乙二醇马来酰亚胺衍生物相比，多价penetratin出峰时间提前2min左右，表明产物极性增大。此外，液相图谱也表明所得产物纯度在 95％以上；

在核磁氢谱表征中，将多臂聚乙二醇马来酰亚胺衍生物和多价penetratin分别溶于重水中，浓度3mg/mL，在室温条件下进行扫描测试，扫描次数120次；

结果表明，与多臂聚乙二醇马来酰亚胺衍生物相比，多价penetratin图谱中马来酰亚胺特征峰(δ6.8)消失，证明多肽penetratin已成功连接到聚乙二醇的末端。

实施例3

多价penetratin细胞毒性评价：取对数期生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²浓度分别铺于96孔板中间60孔中，边缘用无菌PBS缓冲溶液填充，在37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层铺满板底，弃去培液，无菌 PBS缓冲液洗3次后，加入200μL含不同浓度多价penetratin的培液，细胞培养箱中孵育12h后，弃去药液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入完全培养基继续培养12h。之后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，小心弃去液体，PBS缓冲液洗三次后每孔加入150μL DMSO，在摇床上低速振荡20 min后，于酶标仪OD490nm处测定各孔吸光度值。同时设置空白调零孔(培养基、MTT、DMSO)和阴性对照孔(细胞、培养基、MTT、DMSO)；

结果表明，当所用材料penetratin、4VP和8VP浓度(以penetratin计)小于 100μM时，HCEC和NHC细胞生长状态良好，所用材料对细胞无毒。

实施例4

多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞摄取定性评价：取生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²接种到24孔板中。细胞在37℃、 5％CO₂条件下，在500μL含10％FBS的DMEM培养基中培养24h后进行实验。弃去培液后，无菌PBS洗三次，分别加入含3μM(以penetratin计)荧光素5-FAM 标记的penetratin和多价penetratin的无血清DMEM溶液，37℃、5％CO₂条件下孵育一定时间。结束后弃去药液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS缓冲溶液洗去正电性吸附物质，PBS/甘油覆盖后在激光共聚焦显微镜下观察；

结果表明，对于penetratin组，即使孵育时间长达4h，HCEC和NHC细胞仍无明显荧光信号。而对于多价penetratin组，孵育1h后细胞即有较强绿色荧光信号。甚至在孵育4h后，对于HCEC细胞，4VP和8VP所产生的绿色荧光信号几乎弥散在整个细胞中，表明多价penetratin的良好入胞能力。

实施例5

多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞内分布评价：取生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²接种到35mm四格共聚焦皿中。细胞在37℃、5％CO₂条件下，在500μL含10％FBS的DMEM培养基中培养 24h后进行实验。弃去培液后，无菌PBS洗三次，分别加入含3μM(以penetratin 计)荧光素5-FAM标记的penetratin和多价penetratin的无血清DMEM溶液，37℃、 5％CO₂条件下孵育一定时间。结束后弃去药液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS 缓冲溶液洗去正电性吸附物质，PBS/甘油覆盖后在激光共聚焦显微镜下观察；

结果表明，给药4h后，HCEC和NHC细胞对penetratin摄取量较少，而4VP 和8VP可以被大量摄取进入细胞并分布于细胞质中。此外，部分绿色荧光信号不与红色荧光标记的溶酶体共定位，表明多价penetratin递送载体具备内涵体逃逸特性。

实施例6

多价penetratin与小分子物质共价连接复合物细胞摄取定量评价：取生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²分别接种到12孔板中，接种后每天换液一次，培养2～3天后进行实验。弃去培液后，无菌PBS洗三次，分别加入含3μM(以penetratin计)荧光标记的penetratin和多价penetratin的无血清 DMEM溶液，37℃、5％CO₂条件下孵育4h。结束后弃去药液，用含0.02mg/mL 肝素钠的PBS缓冲溶液洗去正电性吸附物质，将细胞消化下来，重悬于200μL 无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后进行流式检测，每个样品细胞计数在10⁴，未给药细胞作为阴性对照组；

结果表明，4VP和8VP的细胞摄取显著高于penetratin(p<0.001)。在HCEC 细胞中，4VP组的平均荧光强度是penetratin组的18倍，8VP组的平均荧光强度是penetratin组的8倍。在NHC细胞中，4VP组的平均荧光强度是penetratin组的24倍，8VP组的平均荧光强度是penetratin组的14倍。

实施例7

多价penetratin与反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,ASO)非共价连接复合物处方筛选：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对基因递送系统进行初步处方筛选。将游离穿膜肽penetratin与多价penetratin(4VP,8VP)分别与1.32 μgASO按不同的摩尔比(多价penetratin折算成单分子penetratin与ASO摩尔比，自左至右依次为3:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、40:1、50:1和60:1；其中，多价penetratin折算成单分子penetratin的浓度分别为50μM、100μM、200 μM、300μM、400μM、500μM、600μM、800μM、1000μM和1200μM)混合于20μL DEPC水中，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30min得到复合物 Pe/ASO,4VP/ASO以及8VP/ASO。将复合物分别小心加入PAGE胶加样孔中，并设游离ASO组。电泳结束后，用GelRed工作液避光泡染30min，在紫外302 nm条件下进行凝胶成像；

结果表明，对于复合物Pe/ASO，在摩尔比20:1条件下仍有较明显的游离 ASO斑点，表明该比例条件下游离penetratin没有完全屏蔽ASO的负电荷，也没有完全压缩ASO。而对于多价penetratin构建的4VP/ASO和8VP/ASO复合物，在摩尔比20:1时几乎观察不到游离ASO斑点，表明二者在该比例条件下可以有效屏蔽ASO的负电荷，对ASO压缩效果更好；

采用流式细胞术进一步进行处方筛选。取生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²分别接种到12孔板中，接种后每天换液一次，培养2～3 天后进行实验。弃去培液后，无菌PBS洗三次，分别加入含不同电荷比复合物的无血清DMEM溶液，37℃、5％CO₂条件下孵育1h。结束后弃去药液，用PBS 缓冲溶液洗3次，将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后进行流式检测，每个样品细胞计数在10⁴，未给药细胞作为阴性对照组；

结果表明，随着多价penetratin与ASO的摩尔比增加，ASO在角膜和结膜细胞中的摄取量也随之增加，表明多价穿膜肽对基因的递送效率随着二者摩尔比增加而升高。

实施例8

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物粒径、电势与稳定性评价：根据例7中方法制备多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物，并进行粒径与电势测定；

结果表明(表2)，与游离penetratin形成的复合物Pe/ASO相比，多价penetratin压缩ASO得到的复合物粒径相对更小，特别是复合物8VP/ASO粒径相比于 Pe/ASO减小了60nm左右；三种复合物多分散系数均小于0.3，表明粒径分布较为均匀；复合物Pe/ASO和8VP/ASO的表面电势在+20mV左右，而且8VP/ASO 的粒子计数显著高于Pe/ASO，表明其结构更为致密；

表2反义寡核苷酸非共价复合物的粒径、多分散系数及电势表征

将复合物在34℃条件下孵育，在不同时间点(0,0.5h,1h,2h,4h,6h,12h, 24h,48h)进行粒径测定，考察复合物的粒径稳定性；

结果表明，在34℃孵育条件下，多价penetratin压缩ASO形成的复合物稳定性较游离penetratin形成的复合物Pe/ASO更好，前者在48h内粒径仍保持稳定，而复合物Pe/ASO在48h后粒径增大到800nm左右，表明该复合物已经产生聚集现象。

实施例9

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物形态学评价：根据例7中方法制备多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物，并在电镜下观察复合物形态；

结果表明，四种复合物整体上均呈球状，且粒径分布与例8中结果一致。对于复合物Pe/ASO，粒径分布在100至200nm之间，对于复合物4VP/ASO，粒径分布在100至150nm之间，对于复合物8VP/ASO，粒径分布在100nm左右，而基于Lipofectamine 2000所构建得到的复合物粒径较大，并且特别容易团聚。

实施例10

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞毒性评价：取对数期生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²浓度分别铺于96孔板中间60孔中，边缘用无菌PBS缓冲溶液填充，在37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层铺满板底，弃去培液，无菌PBS缓冲液洗3次后，加入200μL含不同浓度复合物的培液，细胞培养箱中孵育12h后，弃去药液，无菌PBS缓冲液洗3 次后，加入完全培养基继续培养12h。之后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，小心弃去液体，PBS缓冲液洗三次后每孔加入150μLDMSO，在摇床上低速振荡20min后，于酶标仪OD490nm处测定各孔吸光度值。同时设置空白调零孔(培养基、MTT、DMSO)和阴性对照孔(细胞、培养基、MTT、 DMSO)；

结果表明，在16倍实验浓度(3.2μM ASO)的条件下，HCEC和NHC细胞生长状态良好，复合物对眼部细胞未见毒性作用。

实施例11

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞内分布评价：将生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²的密度接种于35mm四格共聚焦皿中，接种后每天换液一次，培养2～3天后进行实验。弃去培液后，无菌 PBS洗三次，分别加入含不同复合物(均含1.32μg绿色荧光标记的ASO)的无血清DMEM溶液，37℃、5％CO₂条件下孵育4h。结束后弃去药液，用PBS缓冲溶液洗3次，LysoTracker染溶酶体、DAPI染细胞核后在激光共聚焦显微镜下观察；

结果表明，对于游离ASO组，HCEC和NHC细胞中几乎不见荧光标记ASO 分布；对于游离penetratin形成的复合物Pe/ASO组，有少量ASO可以进入细胞，但多数与红色荧光标记的溶酶体共定位；而对于多价penetratin形成的复合物 4VP/ASO和8VP/ASO组，有较多ASO进入细胞，并且相当一部分ASO不与溶酶体共定位。市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000与反义寡核苷酸的非共价复合物LIPO/ASO，在相同条件下进入胞内的量相对较少。

实施例12

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物细胞摄取定量评价：将生长状态良好的HCEC和NHC细胞按5×10³cells/cm²的密度接种于12孔板中，接种后每天换液一次，培养2～3天后进行实验。弃去培液后，无菌PBS洗三次，分别加入含不同复合物(均含1.32μg绿色荧光标记的ASO)的无血清DMEM 溶液，37℃、5％CO₂条件下孵育4h。结束后弃去药液，用PBS缓冲溶液洗3 次，将细胞消化下来，重悬于200μL无菌PBS缓冲溶液中，吹打均匀后进行流式检测，每个样品细胞计数在10⁴，未给药细胞作为阴性对照组；

结果表明，在两种细胞中，对于游离ASO组和游离penetratin形成的复合物 Pe/ASO组，细胞对ASO的摄取量均很少，而多价penetratin和市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000均可以显著增加ASO的摄取。在HCEC细胞中，4VP介导ASO的摄取量是游离ASO的3.7倍(p<0.001)，8VP则是45 倍(p<0.001)。在NHC细胞中，4VP介导ASO摄取量是游离ASO的6.6倍(p <0.01)，而8VP则是90倍(p<0.001)。特别值得注意的是，与市售基因转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000相比，8VP介导ASO摄取量是其8.6和 12.4倍(p<0.001)，基因递送效果显著改善。

实施例13

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物在活体小鼠眼内的分布：通过小鼠结膜囊内滴眼给药实验考察各复合物中绿色荧光标记的ASO在眼部分布与药动学特性。分别制备三种复合物Pe/ASO、4VP/ASO与8VP/ASO，每份复合物含2.64μg荧光标记的ASO、溶于5μL模拟泪液中。设置游离ASO组、 Pe/ASO组、4VP/ASO组以及8VP/ASO组和空白对照组(不作任何处理)。将游离ASO或复合物滴入小鼠结膜囊内，轻轻闭合眼睑多次使在眼球表面分布均匀。给药结束时间记为零时刻，在10min后处死小鼠并取出眼球，在Davidson’s溶液中固定30min后于30％蔗糖溶液中脱水过夜，制备DAPI染色的冷冻切片并进行观察；

结果表明，空白组眼球眼前段和眼后段均无绿色荧光信号，表明无荧光背景干扰。游离ASO组无明显绿色荧光信号；对于Pe/ASO组，在眼前段和眼后段可见较弱绿色荧光信号；对于4VP/ASO和8VP/ASO组，在眼前段和眼后段均有较强荧光信号，并且荧光信号主要分布于眼后段。此外，局部放大结果显示(图 14B)，游离ASO或penetrain介导ASO难以进入角膜，而4VP和8VP可以介导ASO进入角膜基质层；在眼后段组织，游离ASO组未见绿色荧光信号， penetratin可以介导部分ASO到达脉络膜，4VP和8VP可以介导ASO分布于整个眼后段组织，包括脉络膜和视网膜，并且8VP递送效果较4VP更好。

实施例14

多价penetratin与反义寡核苷酸非共价连接复合物的眼部消除评价：通过小鼠结膜囊内滴眼给药实验考察各复合物中绿色荧光标记的ASO在眼部分布与药动学特性。分别制备三种复合物Pe/ASO、4VP/ASO与8VP/ASO，每份复合物含2.64μg荧光标记的ASO、溶于5μL模拟泪液中。设置游离ASO组、Pe/ASO 组、4VP/ASO组以及8VP/ASO组和空白对照组(不作任何处理)。将游离ASO 或复合物滴入小鼠结膜囊内，轻轻闭合眼睑多次使在眼球表面分布均匀。给药结束时间记为零时刻，在10min,30min,1h,2h,4h,6h后分别处死小鼠并取出眼球，在Davidson’s溶液中固定30min后于30％蔗糖溶液中脱水过夜，制备DAPI 染色的冷冻切片并进行观察；

结果表明，结膜囊内滴眼给药后，游离ASO组和Pe/ASO组在角膜和视网膜均无绿色荧光信号；对于4VP/ASO和8VP/ASO组，给药10min后ASO即可进入眼内，并主要分布于视网膜组织，荧光信号在1h内达到峰值，此后随时间逐渐减弱，滞留时间长达6h。

实施例15

多价penetratin与质粒DNA(Plasmid-Cas1、Plasmid-Cas2、Plasmid-Cas3) 非共价连接复合物(8VP/plasmid)的制备：将8价penetratin(8VP)分别与质粒DNA按不同的摩尔比(1:1、5:1、10:1、20:1、40:1、60:1、80:1、100:1、150:1、 200:1、250:1和300:1；8价penetratin:质粒DNA，其中8价penetratin摩尔量折算为单分子penetratin摩尔量)混合于100μL超纯水中，涡旋30s，置于37℃ 条件下孵育30min得到复合物8VP/plasmid。

实施例16

多价penetratin与质粒DNA(Plasmid-Cas1、Plasmid-Cas2、Plasmid-Cas3) 非共价连接复合物(8VP/plasmid)的细胞转染效果评价：取生长状态良好的293T 细胞按5×10³cells/cm²接种到24孔板中。细胞在37℃、5％CO₂条件下，在500 μL含10％FBS的DMEM培养基中培养24h后进行实验。弃去培液后，无菌PBS 洗三次，分别加入含复合物8VP/Plasmid-Cas1、8VP/Plasmid-Cas2、 8VP/Plasmid-Cas3、Lipofectamine 2000/Plasmid-Cas1、Lipofectamine 2000/Plasmid-Cas2、Lipofectamine 2000/Plasmid-Cas3的无血清DMEM溶液， 37℃、5％CO₂条件下孵育4h。结束后弃去药液，用含0.02mg/mL肝素钠的PBS 缓冲溶液洗去细胞表面的吸附物质，正常培养条件下继续培养48h后，弃去培液，用PBS缓冲溶液洗3次，PBS/甘油覆盖后在激光共聚焦显微镜下观察。不加药组细胞作为空白对照；

结果表明，所有实验组均有一定的绿色荧光蛋白表达。而与Lipofectamine 2000构建的复合物相比，8VP可以更有效介导质粒DNA进入293T细胞并表达。

实施例17

多价TAT与小干扰RNA(siRNA)非共价复合物的制备：分别利用TAT与 3臂聚乙二醇和6臂聚乙二醇合成3价TAT和6价TAT，将其分别与0.5nM siRNA 按摩尔比(1:2,1:1,5:1,10:1,20:1,40:1,60:1,80:1,100:1,120:1,140:1,160:1, 180:1和200:1；多价TAT:siRNA，其中多价TAT摩尔量折算为单分子TAT摩尔量)混合于50μL DEPC水中，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30min，得到多价TAT与siRNA非共价复合物。

实施例17

多价寡聚精氨酸poly(arginine)_n(其中n＝6,8和12)与哌加他尼(Pegaptanib)非共价复合物的制备：利用poly(arginine)_n与8臂聚乙二醇合成8价 poly(arginine)₆、8价poly(arginine)₈和8价poly(arginine)₁₂，将其分别与100nM哌加他尼按摩尔比(1:1,5:1,10:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1,90:1,100:1, 120:1,140:1和160:1；多价寡聚精氨酸:哌加他尼，其中多价寡聚精氨酸摩尔量折算为单分子寡聚精氨酸摩尔量)混合于30μLDEPC水中，涡旋30s，置于37℃ 条件下孵育30min，得到多价寡聚精氨酸poly(arginine)_n(其中n＝6,8和12)与哌加他尼非共价复合物。

实施例18

多价鱼精蛋白(protamine)与贝伐西尼(Bevasiranib)非共价复合物的制备：利用protamine与6臂聚乙二醇合成6价protamine，将其分别与20nM贝伐西尼按摩尔比(1:1,5:1,10:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1,90:1和100:1；多价protamine:贝伐西尼，其中多价protamine摩尔量折算为单分子protamine摩尔量)混合于20μL DEPC水中，涡旋30s，置于37℃条件下孵育30min得到多价protamine与贝伐西尼非共价复合物。

实施例19

多价penetratin衍生物(28-W)与单克隆抗体药物非共价复合物的制备：利用penetratin衍生物(28-W)与4臂聚乙二醇合成4价penetratin衍生物，将其分别与1nM单克隆抗体药物贝伐单抗(Bevacizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab) 或雷莫芦单抗(Ramucirumab)按摩尔比(1:1,5:1,10:1,15:1,20:1,25:1,30:1,40:1, 50:1,60:1,70:1,80:1,90:1和100:1；多价penetratin衍生物:单克隆抗体，其中多价penetratin衍生物摩尔量折算为单分子penetratin衍生物摩尔量)混合于200μL 超纯水中，轻轻振摇30s，置于37℃条件下孵育30min，得到多价penetratin 衍生物与单克隆抗体药物的非共价复合物。

实施例20

多价penetratin衍生物(289-F)与蛋白药物非共价复合物的制备：利用penetratin衍生物(289-F)与6臂聚乙二醇合成6价penetratin衍生物，将其分别与5nM蛋白药物康柏西普(Conbercept)、表皮生长因子(Epidermal growth factor)或干扰素α(Interferon-α)按摩尔比(1:1,5:1,10:1,20:1,40:1,60:1,80:1 和100:1；多价penetratin衍生物:蛋白药物，其中多价penetratin衍生物摩尔量折算为单分子penetratin衍生物摩尔量)混合于300μL超纯水中，轻轻振摇30s，置于37℃条件下孵育30min，得到多价penetratin衍生物与蛋白药物的非共价复合物。

Claims

1.一种多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，其包括，多价穿膜肽以多臂聚乙二醇为内核，每条聚乙二醇侧臂的末端共价连接穿膜肽或穿膜肽衍生物，形成章鱼样的多臂、柔性多价结构。

2.根据权利要求1所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的作为内核的多臂聚乙二醇选自3臂聚乙二醇、4臂聚乙二醇、6臂聚乙二醇或8臂聚乙二醇，其中，每条所述聚乙二醇侧臂含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度n介于1至225，所述多臂聚乙二醇的分子量介于200至80000。

3.根据权利要求2所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的聚乙二醇侧臂含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度n介于2至100。

4.根据权利要求2所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的聚乙二醇侧臂含乙氧基[(CH₂CH₂O)_n]的聚合度n介于5至50。

5.根据权利要求1所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的共价连接在聚乙二醇侧臂末端的穿膜肽选自TAT、penetratin、poly(arginine)_n，其中n＝4-20、鱼精蛋白(protamine)、低分子量鱼精蛋白，以及上述穿膜肽的衍生物。

6.根据权利要求5所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的共价连接在聚乙二醇侧臂末端的穿膜肽为野生型penetratin及penetratin衍生物，所述野生型penetratin的氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK。

7.根据权利要求1所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成非共价复合物。

8.根据权利要求7所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成的非共价复合物中，所述生物大分子药物选自基因药物质粒DNA(pDNA)、哌加他尼(Pegaptanib)、贝伐西尼(Bevasiranib)、反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide)、小干扰RNA，或选自单克隆抗体药物贝伐单抗(Bevacizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)，或选自多肽蛋白类药物康柏西普(Conbercept)、表皮生长因子(Epidermal growth factor)和干扰素α(Interferon-α)，以及它们的组合物。

9.根据权利要求7所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成的非共价复合物中，多价穿膜肽与生物大分子的摩尔比介于1:2至300:1，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量。

10.根据权利要求7所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成的非共价复合物中，多价穿膜肽与生物大分子的摩尔比为1:1至200:1，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量。

11.根据权利要求7所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成的非共价复合物中，多价穿膜肽与生物大分子的摩尔比为1:1至100:1，其中多价穿膜肽摩尔量折算为单分子穿膜肽摩尔量。

12.根据权利要求7所述的多价穿膜肽类生物大分子递送载体，其特征在于，所述的多价穿膜肽与生物大分子药物自组装形成的非共价复合物的粒径介于1nm至1000nm。