CN113325178A - 一种用于卵巢癌早期诊断及预后评估的检测试剂盒 - Google Patents

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CN113325178A CN202110584898.1A CN202110584898A CN113325178A CN 113325178 A CN113325178 A CN 113325178A CN 202110584898 A CN202110584898 A CN 202110584898A CN 113325178 A CN113325178 A CN 113325178A
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Abstract

本发明公开了一种卵巢癌生物标记物紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒，其特征在于它由CLDN3标准品、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体，质控品和辅助试剂组成，可用于卵巢肿瘤的良、恶性鉴别诊断，尤以是卵巢癌的早期诊断和卵巢癌术后化疗效果监测及预后评估。

Description

一种用于卵巢癌早期诊断及预后评估的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于卵巢癌早期诊断及预后评估的特异蛋白酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率居第三位，而死亡率却位居首位，近年来其发病率还呈现出逐年上升的流行特征。卵巢癌发病隐匿，70％的患者确诊时已为晚期，卵巢癌已成为严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤。因卵巢癌具有死亡率高和复发率高的特点，因此积极发现客观、可靠的科学指标，尽早发现、诊断以及治疗卵巢癌对提高卵巢癌患者的生存质量意义重大，也是卵巢癌研究的重点和难点。生物标志物检测在卵巢癌的早期诊断、良恶性鉴别诊断以及预后评估中的作用不可忽视，研究针对卵巢癌的特异性生物标志物对卵巢癌的诊断及预后具有重要意义。
体外肿瘤生物标志物检测成为最便捷、有效的诊断方法，可通过酶联免疫吸附试验对患者血清中的生物标志物水平进行检测，有效反应机体内肿瘤生物标志物水平的异常分泌情况，从而为卵巢癌的早期诊断提供重要依据。虽然临床研究中发现一些肿瘤生物标记物，如糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、人附睾蛋白4(HE4)等，给临床卵巢癌的诊断和预后评估带来一定的应用价值，但上述指标的检测存在敏感度低以及特异性差的缺陷。紧密连接蛋白3(CLDN3)作为卵巢癌的一种肿瘤生物标记物，与肿瘤细胞增殖率的提高有关，其在卵巢癌患者中过度表达，且与患者的不良预后有关。本研究中结果显示，卵巢癌组织中CLDN3的表达率为93.2％，且CLDN3表达阳性率随临床分期的增加而提高，表明CLDN3与卵巢癌的发生发展具有密切的相关性，同期随访数据表明，CLDN3表达阴性的生存率显著优于表达阳性的患者，且多因素分析显示，CLDN3是预测上皮性卵巢癌生存的独立预后因素，CLDN3表达阳性患者预后不良，进一步，CLDN3对卵巢癌细胞的侵袭和迁移的影响进行检测，结果表明，CLDN3对卵巢癌的侵袭、迁移以及增殖具有显著的促进作用。正常情况下，当癌细胞在扩散大10E+5级以上时，在末梢血液中即可检出CLDN3，一般认为与人体肿瘤癌前病变过程有关，提示单独采用CLDN3检测可作为卵巢癌中重要的指标之一。因此，以CLDN3为生物标志物对卵巢癌的早期诊断及预后评估进行检测具有可行性。
本发明提供了一种卵巢癌生物标记物蛋白紧密连接蛋白3(CLDN3)检测试剂盒，可用于卵巢肿瘤的良、恶性鉴别诊断，尤以是卵巢癌的早期诊断和卵巢癌术后化疗效果监测及预后评估。
发明内容
首先，本发明提供了一种卵巢癌生物标记物紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒具体包括：CLDN3标准品A-F、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体，质控品(阳性对照和阴性对照)和辅助试剂；
具体地，CLDN3检测试剂盒具体包括：ELISA酶标板、冻干标准品A-F、阳性对照、阴性对照、HRP标记的CLDN3多克隆抗体、浓缩洗涤液(25x)、底物反应液(TMB)、反应终止液、封板膜；
具体地，本发明试剂盒的CLDN3标准品A-F提取自人血浆，其中HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒检测均为阴性，标准品A、B、C、D、E、F中抗CLDN3抗体浓度分别为调至100±10ng/ml，50±10ng/ml，25±2.5ng/ml，12.5±1.2ng/ml，6.25±0.6ng/ml，3.125±0.3ng/ml，将所获得的6份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成梯度浓度CLDN3标准品；
具体地，本发明试剂盒中的多克隆抗体包被板可用CLDN3纯品对Balb/c小鼠免疫获得的多克隆抗体包被酶标板制作而成，具体步骤如下：
(1)制备多克隆抗体：用CLDN3纯品采取腹腔注射和皮下注射免疫Balb/c小鼠，再在腹腔内注射小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；收集腹水经重组Protein G预装层析柱纯化后即获得CLDN3多克隆抗体；
(2)包被：使用新鲜配制的0.02-0.08mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH8-10)溶液将CLDN3多克隆抗体稀释至2-10mg/L，0-8℃过夜，用Tween-20的PBS洗涤；加入100-500μl含有5-20g/LBSA的PBST，37℃封闭1-3h，用PBST洗涤后甩干晾晒，即获得多克隆抗体包被酶标板；
优选地，Na2CO3-NaHCO3的浓度为0.05mol/L；
优选地，Na2CO3-NaHCO3 pH为9.6；
优选地，将CLDN3多克隆抗体稀释至5mg/L；
优选地，过夜温度为4℃；
具体地，本发明试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记CLDN3多克隆抗体制备而成，具体步骤如下：
(1)取HRP 2-8mg溶于0.1-0.5M碳酸氢钠溶液中，电磁搅拌；
(2)加0.5-2％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.05-0.3ml，室温避光搅拌；
(3)加0.01-0.1M过碘酸钠0.5-2ml，室温避光搅拌10-50min；
(4)加0.1-0.2M乙二醇0.1-2ml，室温避光搅拌30-90min；在0.005-0.02M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4℃透析10-40h，中间换液3-8次；
(5)加入纯化CLDN3多克隆抗体2-10mg的0.05-0.2M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.5-2ml，室温避光搅拌100-200min；
(6)加入2-10mg硼氢化钠，置4℃静置100-300min；
(7)0.02M(pH7.4)PBS，4℃透析12-36h，换液1-5次，即获得HRP酶标多克隆抗体；
优选地，HRP为5mg；
优选地，1ml 0.3M碳酸氢钠溶液中；
优选地，加1％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml；
优选地，过碘酸钠为0.06M 1ml；
优选地，乙二醇为0.16M 1ml；
优选地，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为0.01M(pH9.5)；
具体地，本发明试剂盒中的质控品是用混合人血清(HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒检测均为阴性)，按照本试剂盒的标准曲线范围要求进行稀释而制成，具体步骤如下：1
(1)收集正常人血清，-20℃保存备用；
(2)稀释后含有CLDN3抗体的人血清(阳性质控品)；
(3)稀释后不含有CLDN3抗体的人血清(阴性质控品)，将所获得的血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成质控品；
具体地，本发明试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液，反应终止液和清洗缓冲液，具体配制辅助试剂方法如下：
(1)底物溶液：磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的1-5％过氧化氢溶液；
(2)显色液：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.05-0.2mg/ml；
(3)反应终止液：1-4M硫酸；④清洗缓冲液(20倍浓缩液，20X)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；
优选地，具体为2％过氧化氢溶液。
其次，本发明还提供了一种检测卵巢癌的方法，包括使用上述的紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒；
具体检测步骤如下：
(1)实验开始前，平衡各试剂至室温，进行试剂配制，充分混匀，避免产生气泡；
(2)加样：于微孔板分别设空白空、标准孔、待测样品孔。在微孔中分别加入50-200μl已稀释好的不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品(避免产生气泡)，轻微晃动混匀，37℃孵育30-120min，1x清洗缓冲液洗板；
(3)将HRP标记的多克隆抗体溶液加入各孔，每孔加入工作液50-200μl，37℃孵育30-100min，1x清洗缓冲液洗板；
(4)弃去液体，甩干，每孔依次加入底物溶液、显色液各20-100μl，37℃孵育5-20min，每孔再加入30-100μl反应终止液结束反应；
(5)比色：以空白对照孔的吸光值调零，酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度OD值并记录。
(6)结果计算：
E.制作标准曲线：每个标准品的OD值减去空白孔的OD值，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2>0.98时本次测定有效；
F.评判质控品浓度：根据质控品的OD值，从标准曲线上读取相应的浓度值；当低值质控品、高值质控品的浓度均在给定范围内时，本次测定判为有效；
G.计算待测血清样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，从标准曲线计算出待测血清样品的CLDN3浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
H.若样品的OD值高于标准曲线上线，适当稀释后重新检测，计算浓度乘以稀释倍数。
本发明的有益效果
(1)本试剂盒以CLDN3作为卵巢癌早期筛查、诊断及预后评估的指标，能更好地兼顾灵敏度和特异性，尤其对上皮性卵巢癌诊断效能较好。
(2)与已有的卵巢癌检测指标CA125相比较，本发明试剂盒以CLDN3作为卵巢癌早期筛查、诊断及预后评估的指标，克服了CA125对早期卵巢癌不明感的缺陷，如CA125在50％的I期卵巢癌患者中仅轻度增高及100％的黏液性卵巢癌组织中无显著增高，而CLDN3在83.3％的卵巢癌组织中显著增高。因此，CLDN3作为筛查卵巢癌的一种手段，克服了CA125检测的敏感度和特异度较低，对卵巢癌筛查出现较高的漏诊率和误诊率的缺陷。
(3)与已有的卵巢癌检测指标HE4相比较，本发明试剂盒以CLDN3作为卵巢癌早期筛查、诊断及预后评估的指标，克服了HE4在诊断卵巢癌中特异性较高、敏感性不足的缺陷。
(4)与已有的卵巢癌检测指标ROMA指数比较，本发明试剂盒以CLDN3作为卵巢癌早期筛查、诊断及预后评估的指标，克服了ROMA指数在诊断卵巢癌中敏感性较高、特异性较差的不足缺陷。
(5)本发明检测试剂盒灵敏度、检测范围、特异性和重复性均显著优于现有卵巢癌评估指标(例如CA125、HE4以及ROMA指数等)，具体如下：
灵敏度：最小可测：6.13ng/mL
检测范围：15.4-40ng/mL
重复性：板内，板间变异系数均<10％。
特异性:可检测人源CLDN3蛋白，且与其它相关蛋白无交叉反应。
附图说明
图1为试验例1中的蛋白表达定量检测图。
图2为试验例2中SKOV3细胞的增殖活性检测结果图。
图3为试验例3中SKOV3细胞的迁移检测。
图4为试验例4中SKOV3细胞的增殖检测结果图。
图5为实施例8中肿瘤标志物检测卵巢癌ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实验试剂：酶联免疫吸附试验(ELISA)
本发明试剂盒中的CLDN3标准品是从人血浆中提取制备的，具体步骤为：收集正常血浆，经饱和硫酸铵沉淀，离子交换层析和亲和层析等方法对CLDN3进行分离纯化，将获得的CLDN3纯标准品按试剂盒的标准曲线浓度进行稀释，然后分装、冷冻保存，即获得CLDN3标准品。
本发明中的多克隆抗体包被板用人源CLDN3纯品对小鼠免疫而获得的多克隆抗体包被酶标板。酶标板(ThermoFisher Scientific提供)规格为96孔平板。
本发明中的酶标多克隆抗体是羊抗小鼠辣根过氧化酶(HRP)标记的CLDN3多克隆抗体而制备的。
本发明中的ELISA酶标板(可拆卸)：固体，96孔/块，1块；冻干标准品A-F：液体，1.2ml/L，6支；阳性对照：液体，1.2ml/L，1支；阴性对照：液体，1.2ml/L，1支；HRP标记的CLDN3多克隆抗体：液体，15ml/瓶，1支；浓缩洗涤液(25x)：液体，30ml/瓶，1瓶；底物反应液(TMB)：液体，10ml/瓶，1瓶；反应终止液：液体，10ml/瓶，1瓶；封板膜：固体，5张。
本发明试剂盒的CLDN3标准品A-F提取自人血浆(HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒检测均为阴性)，标准品A、B、C、D、E、F中抗CLDN3抗体浓度分别为调至100±10ng/ml，50±10ng/ml，25±2.5ng/ml，12.5±1.2ng/ml，6.25±0.6ng/ml，3.125±0.3ng/ml；将所获得的6份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成梯度浓度CLDN3标准品。
实施例1
本实施例试剂盒中的多克隆抗体包被板用CLDN3纯品对Balb/c小鼠免疫获得的多克隆抗体包被酶标板制作而成，具体步骤如下：
(1)制备多克隆抗体：用CLDN3纯品采取腹腔注射和皮下注射免疫Balb/c小鼠，共免疫3次，再在腹腔内注射小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；收集腹水经重组Protein G预装层析柱纯化后即获得CLDN3多克隆抗体；
(2)包被：使用新鲜配制的0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH9.6)溶液将CLDN3多克隆抗体稀释至5mg/L，每孔100μl，4℃过夜，使用5ml/LTween-20的PBS洗涤3次，每次10min；加入300μl含有10g/L BSA的PBST，37℃封闭2h，用PBST洗涤3次，每次10min，甩干后晾晒，即获得多克隆抗体包被酶标板。
实施例2
本实施例试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记CLDN3多克隆抗体制备而成，具体步骤如下：
(1)取HRP 5mg溶于1ml 0.3M碳酸氢钠溶液中，电磁搅拌；
(2)加1％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温避光搅拌60min；
(3)加0.06M过碘酸钠1ml，室温避光搅拌30min；
(4)加0.16M乙二醇1ml，室温避光搅拌60min；在0.01M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4℃透析24h，中间换液5次；
(5)加入纯化CLDN3多克隆抗体5mg的0.1M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液1ml，室温避光搅拌180min；
(6)加入5mg硼氢化钠，置4℃静置180min；
(7)0.02M(pH7.4)PBS，4℃透析24h，换液3次，即获得HRP酶标多克隆抗体。
实施例3
本实施例试剂盒中的质控品是用混合人血清(HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒检测均为阴性)，按照本试剂盒的标准曲线范围要求进行稀释而制成，具体步骤如下：
(1)收集正常人血清，-20℃保存备用；
(2)稀释后含有CLDN3抗体的人血清(阳性质控品)；
(3)稀释后不含有CLDN3抗体的人血清(阴性质控品)，将所获得的2份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成质控品；
具体地，本发明试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液，反应终止液和清洗缓冲液，具体配制辅助试剂方法如下：
(1)底物溶液：磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；
(2)显色液：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
(3)反应终止液：2M硫酸；④清洗缓冲液(25倍浓缩液，25X)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
实施例4
一种检测卵巢癌的方法，包括使用实施例1-3制备的紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒，具体检测步骤如下：
(1)实验开始前，平衡各试剂至室温，进行试剂配制，充分混匀，避免产生气泡；
(2)加样：于微孔板分别设空白空、标准孔、待测样品孔。在微孔中分别加入100μl已稀释好的不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品(避免产生气泡)，轻微晃动混匀，37℃孵育90min，1x清洗缓冲液洗板4次，每次15min；
(3)将HRP标记的多克隆抗体溶液加入各孔，每孔加入工作液100μl，37℃孵育60min，1x清洗缓冲液洗板4次，每次15min；
(4)弃去液体，甩干，每孔依次加入底物溶液、显色液各50μl，37℃孵育10min，每孔再加入50μl反应终止液结束反应；
(5)比色：以空白对照孔的吸光值调零，酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度OD值并记录。
(6)结果计算：
A.制作标准曲线：每个标准品的OD值减去空白孔的OD值，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2>0.98时本次测定有效；
B.评判质控品浓度：根据质控品的OD值，从标准曲线上读取相应的浓度值；当低值质控品、高值质控品的浓度均在给定范围内时，本次测定判为有效；
C.计算待测血清样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，从标准曲线计算出待测血清样品的CLDN3浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
D.若样品的OD值高于标准曲线上线，适当稀释后重新检测，计算浓度乘以稀释倍数。
试验例1卵巢癌组织中CLDN3的表达水平
采用免疫组化对蛋白表达进行定位及定量检测，见图1，其中，N为卵巢正常组织，T为卵巢癌组织。
结果显示，25例(83.3％)卵巢癌组织中CLDN3蛋白表达水平显著上调，而癌旁组织中仅7例(23.3％)蛋白表达上调；且CLDN3蛋白主要表达于细胞质中，以上结果提示，CLDN3基因在卵巢癌组织中的表达明显高于卵巢正常组织，差异具有显著性。
试验例2 CLDN3基因对SKOV3细胞增殖活性的影响
分别将pcDNA3.1-CLDN3质粒、pcDNA3.1空载体质粒转染于SKOV3细胞，采用MTT法分析卵巢癌细胞的增殖活性情况，以此评估CLDN3基因对卵巢癌细胞增殖活性的影响。以相对于各组0h(100％)细胞活性的百分率表示，结果表明，与mock组比较，转染pcDNA3.1-CLDN3质粒48h，SKOV3细胞增殖活性呈现显著升高，两组差异具有统计学意义(P<0.01)，而pcDNA3.1空载体组与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05，图2)。
试验例3 CLDN3基因对SKOV3细胞迁移的影响
本实施例利用8μm孔径聚碳酸酯膜的培养小室(Transwell unit)，采用Transwell实验，检测CLDN3基因对卵巢癌细胞迁移能力的影响，计数进入下室的细胞数量反映卵巢癌细胞的迁移能力。数据表明，转染pcDNA3.1-CLDN3质粒48h后，发生迁移的SKOV3细胞数量为PBS组2.92倍，两组比较具有显著差异(P<0.01)，而pcDNA3.1空载体作用于卵巢癌细胞，实验结果显示与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05，如图3所示)。
试验例4 CLDN3基因对SKOV3细胞增殖的影响
本实施例中卵巢癌细胞的增殖采用3H-TdR渗入法进行检测，以cpm绝对值表示(cpm/106卵巢癌细胞)卵巢癌细胞增殖的数量，以此评估CLDN3基因对卵巢癌细胞增殖能力的影响。结果显示，转染pcDNA3.1-CLDN3质粒48h，SKOV3细胞增殖是PBS组的3.42倍，两组比较具有显著的统计学差异(P<0.01)，而pcDNA3.1空载体作用体外培养的卵巢癌细胞，与PBS组比较增殖能力无改变，差异无统计学意义(P>0.05，如图4所示)。
试验例5 CA125和CLDN3诊断卵巢癌的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较
结果见表1，对CA125和CLDN3的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率进行比较。数据显示，CLDN3敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率均高CA125，差异具有统计学意义(x2＝5.079，5.963，4.947，6.095，10.909，均P<0.05)。
表1 CA125和CLDN3检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较(％)
Figure BDA0003086804280000101
注：*表示与同指标CA125比较，P＜0.05。
试验例6 HE4和CLDN3诊断卵巢癌的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较
结果见表2，对生物学指标HE4和CLDN3的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率进行比较。数据显示，CLDN3检测特异度与HE4比较，差异无统计学意义(x2＝3.750，P>0.05)；但CLDN3敏感度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率均高于HE4，差异具有统计学意义(x2＝5.079，4.249，4.456，8.711，均P<0.05)。
表2 HE4和CLDN3检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较(％)
Figure BDA0003086804280000102
注：*表示与同指标HE4比较，P＜0.05；#表示与同指标HE4比较，P>0.05。
试验例7 ROMA指数和CLDN3诊断卵巢癌的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较
结果见表3，对生物学指标ROMA指数和CLDN3的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率进行比较。数据显示，CLDN3敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率均高于ROMA指数，差异具有统计学意义(x2＝4.022，4.812，3.925，4.090，8.711，均P<0.05)。
表3 ROMA指数和CLDN3检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、诊断效率比较(％)
Figure BDA0003086804280000111
注：*表示与同指标ROMA指数比较，P＜0.05。
试验例8四种生物学标志物诊断卵巢癌ROC曲线下面积比较
结果见表4，分别绘制CA125，HE4，ROMA和CLDN3检测用于卵巢癌诊断ROC曲线图(见图5)，CA125，HE4和ROMA检测卵巢癌ROC曲线下面积分别为0.676，0.655，0.654，而CLDN3检测卵巢癌ROC曲线下面积为0.784，显著高于CA125，HE4和ROMA指数。
表4检测ROC曲线下面积比较
Figure BDA0003086804280000112

Claims (10)

1.一种卵巢癌生物标记物紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒具体包括：CLDN3标准品A-F、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体、阳性对照质控品、阴性对照质控品和辅助试剂。
2.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括：ELISA酶标板、冻干标准品A-F、阳性对照、阴性对照、HRP标记的CLDN3多克隆抗体、25x浓缩洗涤液、底物反应液、反应终止液和封板膜。
3.如权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒中的冻干标准品，其特征在于，其中A-F提取自人血浆，标准品A、B、C、D、E、F中抗CLDN3抗体浓度分别为调至100±10ng/ml，50±10ng/ml，25±2.5ng/ml，12.5±1.2ng/ml，6.25±0.6ng/ml，3.125±0.3ng/ml，将所获得的6份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成梯度浓度CLDN3标准品。
4.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的多克隆抗体包被板可用CLDN3纯品对Balb/c小鼠免疫获得的多克隆抗体包被酶标板制作而成，具体步骤如下：
(1)制备多克隆抗体：用CLDN3纯品采取腹腔注射和皮下注射免疫Balb/c小鼠，再在腹腔内注射小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；收集腹水经重组Protein G预装层析柱纯化后即获得CLDN3多克隆抗体；
(2)包被：使用新鲜配制的0.02-0.08mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH8-10)溶液将CLDN3多克隆抗体稀释至2-10mg/L，0-8℃过夜，用Tween-20的PBS洗涤；加入100-500μl含有5-20g/L BSA的PBST，37℃封闭1-3h，用PBST洗涤后甩干晾晒，即获得多克隆抗体包被酶标板。
5.如权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述地Na2CO3-NaHCO3的浓度为0.05mol/L；
所述地Na2CO3-NaHCO3 pH为9.6；
所述地CLDN3多克隆抗体稀释至5mg/L；
所述地过夜温度为4℃。
6.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其中辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记CLDN3多克隆抗体制备而成，
其特征在于，具体步骤如下：
(1)取HRP 2-8mg溶于0.1-0.5M碳酸氢钠溶液中，电磁搅拌；
(2)加0.5-2％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.05-0.3ml，室温避光搅拌；
(3)加0.01-0.1M过碘酸钠0.5-2ml，室温避光搅拌10-50min；
(4)加0.1-0.2M乙二醇0.1-2ml，室温避光搅拌30-90min；在0.005-0.02M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4℃透析10-40h，中间换液3-8次；
(5)加入纯化CLDN3多克隆抗体2-10mg的0.05-0.2M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.5-2ml，室温避光搅拌100-200min；
(6)加入2-10mg硼氢化钠，置4℃静置100-300min；
(7)0.02M(pH7.4)PBS，4℃透析12-36h，换液1-5次，即获得HRP酶标多克隆抗体。
7.如权利要求6所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述地HRP为5mg；
所述地碳酸氢钠溶液为1ml 0.3M；
所述地，加1％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml；
所述地过碘酸钠为0.06M 1ml；
所述地乙二醇为0.16M 1ml；
所述地碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为0.01M(pH9.5)。
8.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，其中的质控品是用混合人血清，按照试剂盒的标准曲线范围要求进行稀释而制成，具体步骤如下：
(1)收集正常人血清，-20℃保存备用；
(2)稀释后含有CLDN3抗体的人血清，为阳性质控品；
(3)稀释后不含有CLDN3抗体的人血清，为阴性质控品，将所获得的血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成质控品。
9.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液，反应终止液和清洗缓冲液。
10.一种用权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒检测卵巢癌的方法，其特征在于，具体检测步骤如下：
(1)开始前，平衡各试剂至室温，进行试剂配制，充分混匀，避免产生气泡；
(2)加样：于微孔板分别设空白空、标准孔、待测样品孔。在微孔中分别加入50-200μl已稀释好的不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品，轻微晃动混匀，37℃孵育30-120min，1x清洗缓冲液洗板；
(3)将HRP标记的多克隆抗体溶液加入各孔，每孔加入工作液50-200μl，37℃孵育30-100min，1x清洗缓冲液洗板；
(4)弃去液体，甩干，每孔依次加入底物溶液、显色液各20-100μl，37℃孵育5-20min，每孔再加入30-100μl反应终止液结束反应；
(5)比色：以空白对照孔的吸光值调零，酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度OD值并记录；
(6)结果计算：
A.制作标准曲线：每个标准品的OD值减去空白孔的OD值，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2>0.98时本次测定有效；
B.评判质控品浓度：根据质控品的OD值，从标准曲线上读取相应的浓度值；当低值质控品、高值质控品的浓度均在给定范围内时，本次测定判为有效；
C.计算待测血清样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，从标准曲线计算出待测血清样品的CLDN3浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；
D.若样品的OD值高于标准曲线上线，适当稀释后重新检测，计算浓度乘以稀释倍数。
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