JP6429781B2

JP6429781B2 - インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法

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Publication number: JP6429781B2
Application number: JP2015536605A
Authority: JP
Inventors: 友樹篠原; 恭宮澤
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2018-11-28
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Description

本発明は、インフルエンザウイルスのマトリックス１タンパク質（以下、「Ｍ１」と呼ぶことがある）を抗原とするインフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法に関する。

一般的にインフルエンザウイルスを検出する方法として、分離培養法やPCR法、ELISA法、EIA、ウエスタンブロッティング法、イムノクロマト法などが知られているが、インフルエンザウイルスは季節性の病原体であり、実際の臨床現場においては短期間に集中して患者が訪れ、短時間に大量のウイルス検査が行われる。そのため、医療現場においては、迅速性、簡便性に優れているイムノクロマト法が近年急速に広まっている。

一般的なイムノクロマト法では、ニトロセルロース等のメンブレンを用いた方法が知られている。この方法は被検出物質に特異的に結合するリガンドをメンブレン上に固定化し、これが被検出物質を介して被検出物質に特異的に結合するリガンドを標識した標識物質の複合体を捉え、検体中の被検出物質の有無を測定する方法である。標識物質としては、被検出物と特異的に結合するリガンドにアルカリフォスファターゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド及び色素で染色した着色ポリスチレン粒子が一般的であり、特に金コロイド粒子や着色ポリスチレン粒子を用いる場合が多い。

現在市販されているインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマト法のほとんどは、核タンパク質（NP）を検出することにより、検体中のインフルエンザウイルスの有無を測定する方法が用いられている。しかし、この方法では、検出感度が必ずしも十分であるとは言えず、発熱後6時間以内の患者検体からはインフルエンザウイルスを検出することが難しく、さらなる検出感度の向上が求められている。

インフルエンザウイルスを構成するタンパク質として良く知られているのは、HAタンパク質、NAタンパク質、核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質1および2（M1およびM2）などが挙げられる。インフルエンザウイルス1粒子あたりの数が最も多いのは、M1タンパク質であり、NPタンパク質のおよそ3倍量と報告されている（非特許文献1）。

一方、特許文献１や特許文献２に記載されているように、免疫測定に供する検体を界面活性剤で処理することも公知である。

特許第4976068号特開2012-73270

標準微生物学第10版医学書院

本願発明者らは、インフルエンザウイルスのM1タンパク質を検出するイムノクロマト法を構築しようとした。しかし、M1タンパク質検出イムノクロマトにおいては、特許文献１の第００３１段落や特許文献2の第００２６〜００２７段落に記載されるような、従来からよく使用されている界面活性剤であるTriton X100（商品名）やBrij35（商品名）を含んだ検体処理液による検体抽出方法を行った場合、感度が明らかに低く、実用的ではなかった（下記実施例4、表5参照）。

本発明の目的は、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質を抗原として検体中のインフルエンザウイルスを測定する免疫測定において、十分な感度で免疫測定が可能となる手段を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、インフルエンザウイルスを含む検体を、特定の界面活性剤と接触させることにより、免疫測定によるインフルエンザＭ１タンパク質の測定感度が向上することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスのマトリックス１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いてインフルエンザウイルスを免疫測定する際、インフルエンザウイルスを含む検体を、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含む検体処理液と接触させることを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により処理した検体を、インフルエンザウイルスのマトリックス１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定法に供し、検体中のインフルエンザウイルスを測定することを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定法を提供する。

本発明によれば、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質を抗原として検体中のインフルエンザウイルスを測定する免疫測定において、免疫測定の感度が向上する。

（検体）
本発明が適用可能な検体は、インフルエンザウイルスの存在が疑われるものであれば特に限定されないが、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液、唾液等の鼻咽頭由来検体（以下、鼻咽頭由来検体という）が好ましく、このうち鼻腔拭い液、鼻腔吸引液が特に好ましい。

（検体処理液）
上記の通り、本発明の方法では、検体と、界面活性剤とを接触させる。これは、通常、該界面活性剤を含む検体処理液を、上記検体で処理することにより行われる。検体処理液は、通常、緩衝液中に界面活性剤を含むものである。緩衝液としては、特に限定されないが、MES、HEPES、TES、ADA、ACES、bis-Tris、Tris、TES、CAPS、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を挙げることができる。界面活性剤は、パルミチル基、ステアリル基およびオレイル基から成る群より選ばれる少なくとも１つの基を持つ界面活性剤である。これらのアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよい。好ましくは、ポリオキシエチレン鎖に少なくとも１個の上記脂肪族基が結合した非イオン界面活性剤である。ポリオキシエチレン鎖の鎖長は、特に限定されないが、通常、オキシエチレン単位の重合度が５〜４０、好ましくは１０〜２０である。ポリオキシエチレン鎖を有する界面活性剤の好ましい例として、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルを挙げることができる。これらの界面活性剤は単独でも２種以上を組み合わせても用いることができる。検体処理液中の該界面活性剤の終濃度（複数の該界面活性剤が含まれる場合にはその合計終濃度）は、0.005(w/v)%〜8(w/v)%が好ましく、さらに好ましくは0.5(w/v)%〜4(w/v)%である。界面活性剤は、単独で用いることも２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の方法では、塩化物の存在下で前記界面活性剤と検体を接触させることが好ましく、従って、検体処理液は、さらに塩化物を含むことが好ましい。塩化物としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等のアルカリ金属塩化物が好ましい。検体処理液中の塩化物の終濃度は、0.05M〜1.5Mが好ましく、特に0.1M〜1.0Mが好ましい。塩化物は、単独で用いることもできるし２種以上を組み合わせて用いることもできる。

（検体処理液中の他の含有成分）
前記検体処理液には、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば、Triton（登録商標）X-100）等の非イオン性界面活性剤、BSAなどの非特異反応抑制剤、スクロースなどの安定化剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。水酸化ナトリウム、塩化水素など緩衝液のｐＨを調整する工程で使用するものも含んでもよい。

（検体処理方法）
本発明の検体処理方法は、鼻咽頭由来等の検体と本発明の前記検体処理液を接触させることにより行われる。例えば、検体が鼻腔吸引検体の場合は、鼻腔吸引液に綿棒等を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体処理液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。また、検体が鼻腔拭い検体の場合は、綿棒で鼻腔を拭い、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体処理液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。この操作は室温で行うことができ、綿棒を浸す検体処理液の量は、綿棒の綿部分の全体を浸漬できる量であれば特に限定されないが、通常、０．０５mL〜５mLでよい。

（免疫測定）
上記のように処理した検体を、次に、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定法に供し、検体中のインフルエンザウイルスを測定する。以下、この免疫測定について説明する。

（被測定ウイルス）
本発明の免疫測定において測定されるウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスやＢ型インフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルスである。なお、本発明において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。

（抗体）
本発明の免疫測定は、インフルエンザウイルスＭ１タンパク質を抗原とするものであり、従って、免疫測定には、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が用いられる。

Ａ型インフルエンザウイルスの測定のためには、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１（以下Ａ−Ｍ１と略すことがある）と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が用いられる。Ａ−Ｍ１は２５２アミノ酸残基から構成されるタンパク質であり、ウェスタンブロット法による検出に該抗体を用いることで、分子量２０〜３５ｋＤに抗原抗体反応による特異的なシグナルを検知することができる。なお、本明細書において「特異的」とは、タンパク質と該抗体が混じり合う液系において、該抗体がＡ−Ｍ１以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、または何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体のＡ−Ｍ１との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。Ａ−Ｍ１のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＤ３７４９０等に記載されている。抗Ａ−Ｍ１抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、再現性の観点からモノクローナル抗体が好ましい。抗Ａ−Ｍ１モノクローナル抗体は、Ａ−Ｍ１又はその部分ペプチドで動物を免疫し、常法であるケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に作出することが可能である。また、モノクローナル抗体のクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭやＩｇＹでもよい。

抗原結合部位のみを分離させた抗原結合性断片も免疫測定に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いることもできる。

Ｂ型インフルエンザウイルスの測定のためには、Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１（以下Ｂ−Ｍ１と略すことがある）と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が用いられる。Ｂ−Ｍ１は２４８アミノ酸残基から構成されるタンパク質であり、ウェスタンブロット法による検出に該抗体を用いることで、分子量２０〜３５ｋＤに抗原抗体反応による特異的なシグナルを検知することができる。Ｂ−Ｍ１のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＮ７９４２４等に記載されている。Ｂ型インフルエンザウイルスについてもＡ型の場合と同様、抗原結合性断片を用いることができる。

免疫測定自体は周知であり、サンドイッチ法、凝集法、競合法等、種々の周知の免疫測定のいずれをも採用することができる。これらのうち、サンドイッチ法が好ましく、サンドイッチ法としてはイムノクロマト法やELISA法が好ましく、特に、操作が簡便なイムノクロマト法が好ましい。サンドイッチ法の場合、抗原となるインフルエンザウイルスＭ１タンパク質に同時に結合可能な２種類の抗体又はその抗原結合性断片が用いられる。以下、好ましいサンドイッチ法であるイムノクロマト法についてさらに説明する。なお、イムノクロマト法自体は、周知であり、広く用いられており、本発明においても、イムノクロマト法自体は、周知の方法を用いることができる。

（被検出物質を検出するイムノクロマト法）
本発明の被検出をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法（イムノクロマト法）は、被検出物質に対する抗体（以下、抗被検出物質抗体ということがある。）を用いた免疫学的検出方法であれば特に限定されないが、抗被検出物質抗体と標識抗被検出物質抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。さらに、抗被検出物質抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。上記イムノクロマト法は、上記検体処理方法により抽出された被検出物質と抗被検出物質抗体を固定化したストリップ等を接触させることにより行われる。なお、本発明におけるイムノクロマト法は、定性的な検出、定量的な測定のいずれにも用いることができることはいうまでもない。

（標識物）
これらの抗体に標識する標識物としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特にカラーラテックスが好ましい。
カラーラテックスは、例えば特開平6-306108号公報の〔0022〕記載の方法に従い、乳化剤を使用しないソープフリー重合によりポリスチレン系粒子を作製し、同〔0025〕から〔0035〕までに記載された方法に準じて作製可能であり、Seradyn社やMagsphere社などから市販されている着色粒子を用いることも出来る。
以下の説明では、標識物としてカラーラテックス粒子を用いた場合について詳述する。

（標識抗体固定化方法）
上記抗体のカラーラテックスへの固定化は、通常化学結合によって行うが、この際、抗体濃度は1mg/mL〜5mg/mLに調製されるのが好ましく、緩衝液及びｐＨは、20mM MES緩衝液（pH5.5〜6.5）または50ｍＭホウ酸緩衝液（pH8〜9）が好ましく、さらに好ましくは２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（pH6.5）である。また、カラーラテックス上の抗体が結合していない領域は、ＢＳＡなどを結合させブロッキングするのが好適である。このようにして作製されたカラーラテックス標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、ＢＳＡなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。

（固相）
また、固相の素材としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、あるいはセラミックス等が挙げられる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社、ライデル社などより販売されているガラス繊維ろ紙や、セルロースろ紙などの他、ポリスチレンプレート、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。以下、固相の素材としてニトロセルロース膜を用いた場合について詳述する。

（固相への捕捉用抗体の固定化）
被検出物質としての抗原（例えば、インフルエンザウイルス）と標識抗体との複合体を検出するための捕捉用抗体のニトロセルロース膜への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、ラテラルフロー式の場合には、ノズルから捕捉用抗体を含む液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状にニトロセルロース膜に捕捉用抗体液を塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は0.1mg/mL〜5mg/mLが好ましく、0.5mg/mL〜2mg/mLがさらに好適である。また、上記の抗体液は、通常、所定の緩衝液を用いて調製され得る。前記緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のpHはpH6.0〜9.5の範囲が好ましく、pH6.5〜8.5がより好ましく、pH7.0〜8.0がさらに好ましい。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
ニトロセルロース膜に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
ニトロセルロース膜の孔径を適宜選択することにより、カラーラテックス標識抗体と被検出物質である抗原（例えば、インフルエンザウイルス）との免疫複合体が膜中を流れる速度を制御することが可能である。この流れる速度により、膜に固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、適切な孔径を有する膜を選択することが好ましい。好適には、ミリポア社、Hi Flow Plus HF180などが用いられる。

（イムノクロマト試薬、イムノクロマト試薬キット）
本発明の検体処理液は、従来のイムノクロマト試薬とともに用いることができ、両者を併せてイムノクロマト試薬またはイムノクロマト試薬キットとして用いることもできる。
尚、「イムノクロマト試薬」とは、イムノクロマト法による測定に必要な試薬成分や、テストストリップ等の部材をも含めたものである。

本発明の本質として、インフルエンザウイルスを検出するイムノクロマト系において前述の特定の界面活性剤が存在すること、または特定の界面活性剤に加えてさらに特定の塩が存在することが高感度検出に重要であると言える。そのため、以下にインフルエンザウイルスの処理方法として検体処理液として液体の状態で作成した実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではなく、インフルエンザウイルスを検出するイムノクロマト系に上述の特定の界面活性剤、または特定の界面活性剤と特定の塩が含まれている形態であれば本特許の権利範囲とする。

1．抗B型インフルエンザウイルスM1モノクローナル抗体の作製
B型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3×63）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスM1抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を得た。

2．抗B型インフルエンザウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体固定化メンブレンを得た（以下抗体固定化メンブレンとする）。

3．抗B型インフルエンザウイルス抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。

4．抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
3．で得た抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。

5．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
2.4.で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）と貼り合せて5mm幅に切断し、B型インフルエンザウイルス試験片とした。

6．抗A型インフルエンザウイルスM1モノクローナル抗体の作製
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3×63）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスM1抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からプロティンAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、2種類の精製抗A型インフルエンザウイルスM1抗体を得た。

７．抗A型インフルエンザウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
精製した抗A型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗A型インフルエンザウイルスM1抗体固定化メンブレンを得た（以下抗体固定化メンブレンとする）。

8．抗A型インフルエンザウイルス抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗A型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。

9．抗A型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
8．で得た抗A型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。

10．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
7．および9．で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材、バッキングシート、吸収帯、サンプルパッドと貼り合せて5mm幅に切断しA型インフルエンザウイルス試験片とした。

実施例1．最適な界面活性剤の種類の選択
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける最適な界面活性剤を探索するために、界面活性剤の性能を比較した。まず、表1に示す界面活性剤のうち１種類を１(w/v)％の濃度で含み、その他の成分として10mM MES（pH7.0）、3％BSAを含む検体処理液を作製した。なお従来の検体処理方法に相当するのは表1の番号4のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含むものである。表１には、用いた界面活性剤のポリオキシエチレン(POE)鎖の炭素数も併せて示す。なおA型インフルエンザウイルスの試験には表1の番号１〜7を使用し、B型インフルエンザウイルスの試験には、表１の番号2〜4のみを使用した。

次に、作製した検体処理液400μLに不活化A型または不活化B型インフルエンザウイルスを30μL加え、混合した。混合液50μLをA型またはB型インフルエンザウイルス試験片のサンプルパッド部分に滴下し、10分後に目視判定を行った。テストライン上にシグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い2＋、3＋、4＋、5＋とした（表2に結果を記載した）。

結果、アルキル基の炭素数が直鎖16以上の界面活性剤を使用した検体処理方法において高いシグナル強度を示すことが判明した。

表2．界面活性剤によるシグナル強度の違いについて

実施例2．ポリオキシエチレンセチルエーテルの使用濃度について
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける、ポリオキシエチレンセチルエーテルの濃度の影響について調査した。ポリオキシエチレンセチルエーテルを表3-1に示す濃度で含み、その他の成分として10mM MES（pH6.5）、3％BSAを含む検体処理液を作製した。なお対照としてポリオキシエチレンセチルエーテルを含まないサンプルを用意した（表3-1、表3-2の番号1）。

次に、作製した検体処理液400μLに不活化A型または不活化B型インフルエンザウイルスを30μL加え、混合した。混合液50μLをA型またはB型インフルエンザウイルス試験片のサンプルパッド部分に滴下し、10分後に目視判定を行った。テストライン上にシグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い2＋、3＋、4＋、5＋とした（表2に結果を記載した）。なお±は弱いシグナルが観察されたことを示している。

結果、A型、B型ともにポリオキシエチレンセチルエーテルの濃度が0.005〜8(w/v)%である範囲において対照条件（番号1）よりも強いシグナルを観察できた。

実施例3．塩化物の添加効果について
A型およびB型インフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける、塩成分の添加効果を調査した。まず、ポリオキシエチレンセチルエーテルを１(w/v)％含み、塩成分として表7に示す濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムのいずれかを含み、その他の成分として10mM MES（pH7.0）、3％BSAを含む検体処理液を作製した。対照条件として上記の検体処理液のうち塩を含まない検体処理液も同時に作製した。次に、作製した検体処理液400μLに不活化したA型またはB型インフルエンザウイルスを30μL加えて、混合した。混合液50μLをB型インフルエンザウイルス試験片のサンプルパッド部分に滴下し、10分後に目視判定を行った。テストライン上にシグナルを確認できたものを＋とし、シグナルが強くなるに従い2＋、3＋、4＋、5＋と相対的に数値を大きくした（A型は表4-1から表4-3、B型は表5-1から5-3に結果を記載した）。

結果、塩化物を添加した検体処理液を使用した場合において若干のシグナル増強を認めた。さらに、塩化カリウムと塩化リチウムに関しては、他の塩化物よりもさらに若干のシグナルの増強を認めた。また塩化カリウムと塩化リチウムを混合した検体処理液（表7、番号7）では、これらを単体で使用するよりもさらにシグナル強度が強くなることが分かった。データには記載しないが、チオシアン酸ナトリウムを使用すると、非特異的な反応が出現する例もあり、塩の種類が重要であることが示唆された。

以上から塩化ナトリウムや塩化カリウム、塩化リチウム等の塩の添加、使用濃度がそれぞれ0.05M〜1.5Mのときに、M1検出イムノクロマトのシグナル強度をさらに増強できることを発見した。

表4．A型インフルエンザウイルス検出における塩の添加効果について

表5．B型インフルエンザウイルス検出における塩の添加効果について

実施例4．A型、B型インフルエンザウイルスM1検出イムノクロマト法における、最適な界面活性剤および塩を組み合わせたM1検出用検体処理方法による高感度化効果についての検証
M1検出用検体処理液として、2%ポリオキシエチレンセチルエーテル、1％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含み、塩成分として0.25M塩化カリウムと0.25M塩化リチウムを、その他の成分として10mM MES（pH7.0）、3％BSAを含む検体処理液を作製した。なお対照条件として10mM MES（pH7.0）、3％BSA、1％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む検体処理方法を作製した。上記の2種の検体処理方法を使用して、イムノクロマト法でのインフルエンザウイルスA型、B型の希釈系列（原液〜1024倍希釈まで）を使用して性能試験を行なった。同時に従来のNP検出イムノクロマト法との比較も行った。

結果、A型インフルエンザウイルスの検出においては、対照の検体処理液では不活化A型インフルエンザウイルス原液を辛うじて検出できるのに対し、M1検出用検体処理液では不活化A型インフルエンザウイルス原液を1024倍希釈した希釈サンプルを検出することができた（表6-1）。なお表の判定結果表記については、テストライン上にシグナルを確認できたものを「＋」とし、シグナルが薄いが反応が確認できたものを「±」、シグナルが確認できなかったものを「−」とした。

B型インフルエンザウイルスの検出においては、A型と同様に対照の検体処理液では不活化B型インフルエンザウイルス原液を辛うじて検出できるのに対し、M1検出用検体処理液では不活化B型インフルエンザウイルス原液を512倍希釈した希釈サンプルを検出することができた（表6-2）。

またM1タンパク質検出イムノクロマト法では、従来のNP検出イムノクロマト法と比較しても、A型、B型インフルエンザウイルスのそれぞれにおいて2倍以上の感度向上が認められた（表6-1、表6-2）。

以上からインフルエンザウイルスM1タンパク質検出イムノクロマトにおける検体処理方法として、界面活性剤成分として、パルミチル基もしくはステアリル基もしくはオレイル基をもつ界面活性剤を含み、また塩成分として、塩化カリウムや塩化リチウム、塩化ナトリウムを含有した検体処理方法が有効であることを見出した。

表6．A型、B型インフルエンザウイルスM1検出イムノクロマト法における、最適な界面活性剤および塩を組み合わせたM1検出用検体処理方法による高感度化効果についての検証

Claims

インフルエンザウイルスのマトリックス１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いてインフルエンザウイルスを免疫測定する際、インフルエンザウイルスを含む検体を、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含む検体処理液と接触させることを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法。
前記検体処理液中の界面活性剤の終濃度が0.005(w/v)%〜8(w/v)%である請求項１記載の方法。
前記終濃度が0.5(w/v)%〜4(w/v)%である請求項２記載の方法。
前記検体処理液が、塩化物をさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記塩化物が、アルカリ金属塩化物である請求項４記載の方法。
前記検体処理液中の前記塩化物の終濃度が0.05M〜1.5Mである請求項４又は５記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により処理した検体を、インフルエンザウイルスのマトリックス１タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定法に供し、検体中のインフルエンザウイルスを測定することを含む、インフルエンザウイルスの免疫測定法。
イムノクロマト法である請求項７記載の免疫測定法。