WO2022075503A1 - 블록킹제, 이를 사용하는 분석 재료의 검출 방법 및 이를 포함하는 분석 재료의 검출 키트 - Google Patents

블록킹제, 이를 사용하는 분석 재료의 검출 방법 및 이를 포함하는 분석 재료의 검출 키트 Download PDF

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WO2022075503A1
WO2022075503A1 PCT/KR2020/013725 KR2020013725W WO2022075503A1 WO 2022075503 A1 WO2022075503 A1 WO 2022075503A1 KR 2020013725 W KR2020013725 W KR 2020013725W WO 2022075503 A1 WO2022075503 A1 WO 2022075503A1
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blocking
solution
blocking agent
analyte
minutes
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PCT/KR2020/013725
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Inventor
전민재
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전민재
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a blocking agent, a method for detecting an analyte using the same, and a kit for detecting an analyte containing the same.
  • Immunochemical methods are widely used to analyze the presence or absence of proteins such as antigens and antibodies, or to analyze the content of these proteins.
  • Western blot and ELISA analysis methods are used. Specifically, the protein is moved by a method such as SDS PAGE, and then the transferred protein is transferred to a nitrocellulose or PVDF membrane, and then the primary antibody and the secondary antibody are sequentially reacted to measure the presence or content of the protein. is composed
  • the blocking process is a process that prevents contaminants other than the protein to be analyzed or binding between the measurement device and the primary antibody.
  • the blocking process is an essential process to increase the analytical reliability and analytical sensitivity of the analyte material.
  • a blocking agent which is one or more compounds of non-fat dry milk (skim milk powder), casein, bovine serum albumin, and PVP (polyvinylpyrrolidone), is dissolved in a predetermined buffer, and then the membrane This is done by processing in
  • the conventional blocking agent takes a long time to analyze the analyte material because the reaction time is long from 30 minutes to 1 hour, and it cannot completely prevent non-specific binding, which may interfere with the specific binding of the analyte material.
  • organic substances such as non-fat dry milk, casein, and bovine serum albumin among existing blocking agents should be stored at about 4° C. when stored as an organic substance, and the storage period is also short, about 1 week. There is a lot of risk of contamination by breeding.
  • the flow of the existing blocking agent is stopped as a blocking solution, it is hardened in the nozzle in the equipment, so it is difficult to use it in an automated device.
  • An object of the present invention is to provide a blocking agent capable of shortening the analysis time of the analyte material by reducing the blocking reaction time.
  • Another object of the present invention is to provide a blocking agent that can be stored at room temperature for a long time and does not cause contamination with bacteria.
  • Another object of the present invention is to provide a blocking agent that completely blocks non-specific binding to an antibody and does not affect specific binding between antigen-antibody, thereby increasing analysis reliability.
  • Another object of the present invention is to provide a blocking agent that is easy to automate analysis because it does not solidify even in a solution state.
  • One aspect of the present invention is a blocking agent.
  • the blocking agent includes polyoxyethylene alkyl ether or a salt thereof.
  • the polyoxyethylene alkyl ether is polyoxyethylene lauryl ether; polyoxyethylene cetyl ether; one or more of polyoxyethylene oleyl ethers.
  • the polyoxyethylene alkyl ether may be polyoxyethylene oleyl ether.
  • Another aspect of the invention is a method for detecting an analyte.
  • a method for detecting an analyte includes the step of using the blocking agent of the present invention.
  • the blocking process may include treating a blocking solution containing 0.01% to 5% of the blocking agent at 20°C to 30°C for 3 minutes to 20 minutes.
  • the method of detecting the assay material is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a fluorescence-linked immunosorbent assay (FLISA), a fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay Fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay (FELISA), fluorescence immunoassay (FLIA), Chemiluminescence immunoassay (CLIA), Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay (ELISPOT), It may include one or more of an enzyme immunoassay (EIA), a radioimmunoassay (RIA), a Western Blot, a Southern Blot, and a Northern Blot.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • FLISA fluorescence-linked immunosorbent assay
  • FELISA fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay
  • FLIA fluorescence immunoassay
  • CLIA Chemiluminescence immunoassay
  • ELISPOT Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay
  • EIA enzyme
  • the method of detecting the analyte may be based on an immune response.
  • Another aspect of the present invention is the detection of an analyte comprising the blocking agent of the present invention.
  • the present invention provides a blocking agent capable of shortening the analysis time of the analyte material by reducing the blocking reaction time.
  • the present invention provides a blocking agent that can be stored at room temperature for a long period of time and does not cause contamination with bacteria.
  • the present invention provides a blocking agent that completely blocks non-specific binding to an antibody and has no effect on specific binding between antigen-antibody, thereby enhancing analysis reliability.
  • the present invention provides a blocking agent that is easy to automate analysis because it does not solidify even in a solution state.
  • FIG. 7 is an evaluation result in Experimental Example 6.
  • the solid line is the blocking solution I
  • the dotted line is the blocking solution II
  • the dashed-dotted line is the result of the blocking solution VI.
  • the analyte is generally analyzed by specific binding between detection materials.
  • the analyte material may be an antigen, a protein including an antibody, and the like, or a nucleic acid including DNA, RNA, a probe, a primer, and the like.
  • a blocking process is essential to prevent non-specific binding of the detection material to contaminant materials other than the analyte material or to prevent binding to the surface of the device. The blocking process is generally performed prior to dosing of the detection material.
  • the present invention provides a blocking agent that can shorten the analysis time of the analyte material by reducing the blocking reaction time, can be stored at room temperature for a long period of time, and does not cause contamination with bacteria.
  • the present invention provides a blocking agent that completely blocks non-specific binding to contaminant materials other than the analyte material and does not affect the specific binding between the analyte material and the detection material, thereby increasing the analysis reliability.
  • the present invention provides a blocking agent capable of realizing automation of analysis because it is not solidified even in a solution state, so it is easy to automate analysis.
  • the blocking agent according to an embodiment of the present invention is used in an analysis method by specific binding of a biological analysis material, and polyoxyethylene alkyl ether (polyoxyethylene alkyl ether).
  • the analysis method is described in more detail below.
  • Polyoxyethylene alkyl ethers can shorten the reaction and/or coagulation time of about 3 minutes to about 5 minutes, thereby reducing the blocking reaction time, thereby shortening the analysis time of the analyte material.
  • Polyoxyethylene alkyl ether does not have an amine group, so it can be stored in solution for a long period of time, for example, at room temperature for more than 6 months, so there is no possibility of contamination with bacteria.
  • Polyoxyethylene alkyl ether completely blocks non-specific binding to contaminant materials other than the analyte material, and does not affect the specific binding between the analyte material and the detection material, thereby enhancing analysis reliability.
  • polyoxyethylene alkyl ether may be represented by the following formula (1):
  • n is an integer from 2 to 100;
  • R is a straight-chain or branched-chain alkyl group having 10 to 20 carbon atoms or a straight-chain or branched-chain alkenyl group having 10 to 20 carbon atoms
  • n may be specifically 10 to 100. Within the above range, it can be easily used as a blocking agent in the analysis of the antigen-antibody, and the reliability of the analysis of the antigen-antibody can be increased.
  • R is specifically a linear or branched alkyl group having 10 to 18 carbon atoms or an alkenyl group having 10 to 18 carbon atoms, more specifically a straight or branched chain alkenyl group having 12 to 18 carbon atoms can
  • R may be an oleyl group, a lauryl group, or a cetyl group. Most preferably R may be an oleyl group.
  • the polyoxyethylene alkyl ether is polyoxyethylene lauryl ether, including polyoxyethylene (4) lauryl ether and the like; polyoxyethylene cetyl ether including polyoxyethylene (2) cetyl ether, polyoxyethylene (20) cetyl ether, and the like; polyoxyethylene (2) oleyl ether, polyoxyethylene (10) oleyl ether, polyoxyethylene (20) oleyl ether, and the like.
  • the polyoxyethylene alkyl ether may be polyoxyethylene oleyl ether.
  • the polyoxyethylene alkyl ether may have an average molecular weight of 300 to 1200, specifically 700 to 1200, more specifically 1000 to 1200. In the above range, it may be easy to use as a blocking agent.
  • Polyoxyethylene alkyl ethers can be prepared by conventional methods known to those skilled in the art or used as commercially available products.
  • the blocking agents of the present invention include salts of polyoxyethylene alkyl ethers.
  • Salts of polyoxyethylene alkyl ethers may include salts prepared through acid-base reaction of polyoxyethylene alkyl ethers. Examples include, but are not limited to, sulfonates of polyoxyethylene alkyl ethers, phosphonates of polyoxyethylene alkyl ethers, and the like.
  • the method for detecting an analyte according to an embodiment of the present invention includes performing a blocking process using the blocking agent according to an embodiment of the present invention.
  • the method for detecting an analyte according to an embodiment of the present invention may be used to detect a biological analyte.
  • the biological assay material may include, but is not limited to, proteins including antigens, antibodies, and the like, nucleic acids including DNA, RNA, probes, primers, and the like.
  • the blocking process may include preparing a blocking solution in which the blocking agent of the present invention is dissolved in a predetermined buffer, and treating the film and/or substrate containing the analyte material with the blocking solution.
  • the treatment may include treating in a blocking solution at 20° C. to 30° C., specifically, 20° C. to 25° C. for 3 minutes to 20 minutes, specifically 3 minutes to 10 minutes, and more specifically, treatment for 3 minutes to 5 minutes.
  • a blocking solution at 20° C. to 30° C., specifically, 20° C. to 25° C. for 3 minutes to 20 minutes, specifically 3 minutes to 10 minutes, and more specifically, treatment for 3 minutes to 5 minutes.
  • the blocking agent of the present invention can obtain the effects of the present invention described above.
  • the blocking agent in the blocking solution may be included in an amount of 0.01% to 5%, specifically 0.01% to 1%. In the above range, it is possible to properly produce a blocking effect, and to lower the influence due to the remaining of the unreacted blocking agent.
  • the buffer in the blocking solution may be used by employing a conventional type known to those skilled in the art.
  • the buffer may include, but is not limited to, one or more of a TBST buffer and a PBS buffer.
  • the detection method of the analysis material is a detection method for the purpose of sensitivity and specificity based on an immune response, and automation of rapid diagnostic kits including cellulose-based diagnostic kits, protein chips, chemiluminescence immunoassay, etc. It can be applied to methods requiring blocking in diagnostic equipment.
  • the method for detecting the analyte may specifically include an immunochemical analysis method.
  • the detection method of the assay material may be an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a fluorescence-linked immunosorbent assay (FLISA), or a fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay.
  • fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay, FELISA fluorescence immunoassay
  • FLIA fluorescence immunoassay
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • ELISPOT Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • the kit for detecting an analyte according to an embodiment of the present invention includes the blocking agent according to an embodiment of the present invention.
  • the detection kit of the present invention may include a kit to which the above detection method is applied.
  • 3T3L1 cells Korea Cell Line Bank, preadipocytes
  • 1uM insulin and 1uM Dexametasone for 5 days to differentiate them into adipocytes
  • Cell Lysis buffer (20mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA, 140mM NACl, 1 % NP-40, 1mM Na3VO4, 50mM NaF and 10ug/ml aprotinin) was used to dissolve differentiated 3T3L1, and a solution containing Nrf1, a protein to be isolated, was obtained.
  • 12% SDS PAGE was prepared by Laemmli method, and the protein-containing solution was electrophoresed. An electric charge was applied to the gel in which the protein was electrophoresed and transferred to a nitrocellulose membrane by a semi-dry transfer process. Blocking treatment was performed by immersing the nitrocellulose membrane in the blocking solution of Table 1 under the conditions of Table 1 below. Then, the primary antibody Nrf1 (Abcam, cat#:ab34682) was treated and after 1 hour reaction, it was washed 3 times over 5 minutes with PBST buffer.
  • Nrf1 Abcam, cat#:ab34682
  • Blocking Solution I Blocking Solution II Blocking Solution III total amount of protein ( ⁇ g) 20 15 10 20 15 10 20 15 10 blocking temperature (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 blocking time (minute) 60 60 60 10 10 10 10 10 10 Results in Figure 1 A B C D E F G H I
  • the blocking solution III containing the blocking agent of the present invention can completely block in 10 minutes, so it can be seen that the band of the target protein is darkened.
  • the blocking agent of the present invention has an excellent blocking effect even at a concentration of 0.2%.
  • blocking solution I it can be seen that a band of the target protein was produced by blocking for 1 hour.
  • blocking solution II showed a blocking effect in 10 minutes, but blocking was not perfect, so it can be seen that a signal was strongly generated in the background.
  • Blocking Solution I Blocking Solution II Blocking Solution III Total amount of protein ( ⁇ g) 10 5 10 5 10 5 Blocking temperature (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Blocking time (minutes) 60 60 10 10 10 10 Film exposure time (seconds) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
  • Blocking Solution I Blocking Solution II Blocking Solution III Total amount of protein ( ⁇ g) 10 5 10 5 10 5 Blocking temperature (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Blocking time (minutes) 60 60 10 10 10 10 Film exposure time (seconds) 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180
  • the blocking solution III containing the blocking agent of the present invention did not lower the blocking efficiency even if overexposed to the film, and a perfect blocking effect was obtained in 10 minutes.
  • blocking solution I was blocked, but the antigen-antibody reaction was poor.
  • Blocking solution II showed a strong background when overexposed, resulting in poor blocking efficiency.
  • Blocking Solution IV blocking solution Blocking Solution V Blocking Solution III Total amount of protein ( ⁇ g) 20 15 10 20 15 10 20 15 10 Blocking temperature (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Blocking time (minutes) 60 60 60 60 60 60 10 10 10 Results in Figure 4 A B C D E F G H I
  • the blocking solution III containing the blocking agent of the present invention increases the specific binding between antigens and antibodies and has a perfect blocking effect even after blocking for 10 minutes with a 0.2% solution.
  • the blocking solution IV and the blocking solution V contain 1 to 5% and have a blocking effect for 1 hour.
  • Blocking efficiency was evaluated using only the HRP-conjugated antibody as the secondary antibody after blocking the nitrocellulose membrane under the blocking conditions in Table 5 by performing dot blot.
  • the nitrocellulose membrane was cut into rounds with a diameter of 1 cm, it was immersed in the blocking solution shown in Table 5 below for 10 minutes. Then, the nitrocellulose membrane was washed 3 times with PBST solution for 5 minutes. Secondary antibody HRP-conjugated Ab (Jackson immuno, Cat#: 115-035-003) was reacted for 30 minutes and washed 3 times for 5 minutes. Thereafter, the blocking effect was evaluated by confirming whether the secondary antibody binds to the nitrocellulose membrane by ECL reaction in the dark.
  • the blocking solution shown in Table 5 below for 10 minutes. Then, the nitrocellulose membrane was washed 3 times with PBST solution for 5 minutes. Secondary antibody HRP-conjugated Ab (Jackson immuno, Cat#: 115-035-003) was reacted for 30 minutes and washed 3 times for 5 minutes. Thereafter, the blocking effect was evaluated by confirming whether the secondary antibody binds to the nitrocellulose membrane by ECL reaction in the dark.
  • Total amount of protein ( ⁇ g) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Blocking temperature (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Blocking time (minutes) 10 10 10 10 10 10 Results in Figure 5 One 2 3 4 5 6
  • the blocking solution (6) containing the blocking agent of the present invention exhibited a blocking effect even in the process for 10 minutes. However, it can be seen that the blocking solutions (1) to (5) have no blocking effect in the process for 10 minutes.
  • BSA vitamin D manufactured in-house, 4°C, O/N
  • Vitamine D mAb manufactured in-house, concentration changed from 0 to 250ng/ml
  • Table 6 ELISA analysis under the conditions. The ELISA method was performed as follows.
  • BSA-Vitamin D was diluted with PBS in a 96-well ELISA plate, and the solution was immersed so that 100ng per well was put, and then left at room temperature for 1 hour and washed three times with PBST solution.
  • the 96-well plate was immersed in the blocking solution of Table 6 under the conditions shown in Table 6 to perform blocking treatment.
  • the primary antibody Vitamin D mAb was treated and after 1 hour reaction, it was washed 3 times over 5 minutes with PBST buffer.
  • the plate was reacted with the secondary antibody HRP-conjugated Ab (Jackson immuno, Cat#: 115-035-003) for 30 minutes, washed 3 times in 5 minutes, reacted with TMB solution for 3 minutes, and then using an ELISA reader Thus, the results were confirmed at a wavelength of 450 nm.
  • the blocking solution VI containing the blocking agent of the present invention showed a perfect blocking effect in 10 minutes with a 0.02% solution, and increased sensitivity by 30% or more due to excellent antigen-antibody binding.
  • Blocking was performed by varying the blocking time to 0 min, 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, and 30 min as shown in Table 7 below.
  • Other experimental methods were performed in the same manner as in Experimental Example 5. The results are shown in Table 7 and FIG. 7 below.

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Abstract

폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 그의 염을 포함하는 블록킹제, 본 발명의 블록킹제를 사용하는 단계를 포함하는 분석 재료의 검출 방법, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 분석 재료의 검출 키트가 제공된다.

Description

블록킹제, 이를 사용하는 분석 재료의 검출 방법 및 이를 포함하는 분석 재료의 검출 키트
본 발명은 블록킹제, 이를 사용하는 분석 재료의 검출 방법 및 이를 포함하는 분석 재료의 검출 키트에 관한 것이다.
항원, 항체 등의 단백질의 존재 여부를 분석하거나 이들 단백질의 함량을 분석하기 위하여 면역화학적 방법이 폭넓게 사용되고 있다. 대표적으로는 웨스턴 블롯, ELISA 분석 방법이 사용되고 있다. 구체적으로는 단백질을 SDS PAGE 등의 방법에 의해 이동시킨 다음 이동된 단백질을 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로 트랜스퍼시킨 후 1차 항체, 2차 항체를 순차적으로 반응시켜 단백질의 존부 또는 함량을 측정하는 방법으로 구성된다.
이때 단백질을 막으로 트랜스퍼시킨 후 블록킹 공정이 수행되어야 한다. 블록킹 공정은 분석하고자 하는 단백질 이외의 오염 물질이나 측정 장치와 1차 항체 간의 결합이 생기지 않도록 하는 공정이다. 블록킹 공정은 분석 재료의 분석 신뢰성과 분석 민감도를 높이기 위한 필수적인 공정이다.
블록킹 공정은 non-fat dry milk(탈지 분유), 카세인, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), PVP(폴리비닐피롤리돈) 중 1종 이상의 화합물인 블록킹제를 소정의 버퍼에 용해시킨 다음 상기 막에 처리하는 것으로 수행된다. 그러나, 기존의 블록킹제는 반응 시간이 30분 내지 1시간으로 길어서 분석 재료를 분석하는데 시간이 많이 걸리고, 비특이적인 결합을 완전히 막아주지 못하여 분석 재료의 특이적인 결합을 방해할 수 있다. 또한, 기존의 블록킹제 중 유기물인 non-fat dry milk, 카세인, 소 혈청 알부민 등은 유기물로서 용액으로 보관시 약 4℃에서 보관해야 하며 보관 기간 역시 대략 1주일 정도로 짧고, 보관시 박테이라 또는 곰팡이 번식으로 오염의 우려가 많다. 또한, 기존의 블록킹제는 블록킹 용액으로 제조시 흐름이 멈추면 장비 내의 노즐에서 굳거나 하여 자동화 장치에 사용하는데 어려움이 있었다.
본 발명의 목적은 블록킹 반응 시간을 줄여 분석 재료의 분석 시간을 단축시킬 수 있는 블록킹제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 장기간 상온에서의 보관이 가능하고 세균에 대한 오염 발생이 없는 블록킹제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체에 대한 비특이적인 결합을 완전히 차단하고 항원 항체 간의 특이적인 결합에 영향을 주지 않아 분석 신뢰성을 높인 블록킹제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 용액 상태에서도 고체화되지 않아서 분석 자동화가 용이한 블록킹제를 제공하는 것이다.
본 발명의 상술 목적은 이하의 수단에 의해 해결된다.
본 발명의 일 관점은 블록킹제이다.
1.블록킹제는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 그의 염을 포함한다.
2.1에서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르; 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
3.1-2에서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르일 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 분석 재료의 검출 방법이다.
4.분석 재료의 검출 방법은 본 발명의 블록킹제를 사용하는 단계를 포함한다.
5.4에서, 상기 블록킹 공정은 상기 블록킹제를 0.01% 내지 5% 포함하는 블록킹 용액을 20℃ 내지 30℃에서 3분 내지 20분 동안 처리하는 것을 포함할 수 있다.
6.4-5에서, 상기 분석 재료의 검출 방법은 효소-결합 면역 흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 형광-결합 면역 흡착 검사(fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA), 형광 효소-결합 면역 흡착 검사(fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay, FELISA), 형광 면역 검사(fluorescence immunoassay, FLIA), 화학 발광 면역 검사 (Chemiluminescence immunoassay, CLIA), 효소 결합 면역 흡착 스폿 검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay, ELISPOT), 효소 면역 검사(enzyme immunoassay, EIA), 방사성 면역 검사(radioimmunoassay, RIA), 웨스턴 블롯(Western Blot), 서던 블롯(Southern Blot) 및 노던 블롯(Northern Blot) 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
7.4-6에서, 상기 분석 재료의 검출 방법은 면역 반응에 기초할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 블록킹제를 포함하는 분석 재료의 검출 이다.
본 발명은 블록킹 반응 시간을 줄여 분석 재료의 분석 시간을 단축시킬 수 있는 블록킹제를 제공하였다.
본 발명은 장기간 상온에서의 보관이 가능하고 세균에 대한 오염 발생이 없는 블록킹제를 제공하였다.
본 발명은 항체에 대한 비특이적인 결합을 완전히 차단하고 항원 항체 간의 특이적인 결합에 영향을 주지 않아 분석 신뢰성을 높인 블록킹제를 제공하였다.
본 발명은 용액 상태에서도 고체화되지 않아서 분석 자동화가 용이한 블록킹제를 제공하였다.
도 1은 실험예 1에서의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2는 실험예 2에서의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 실험예 2에서의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 실험예 3에서의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 실험예 4에서의 평가 결과이다.
도 6은 실험예 5에서의 평가 결과이다. 도 6에서, ●은 블록킹 용액 VI, ■은 블록킹 용액 II, ◆은 블록킹 용액 I의 결과이다.
도 7은 실험예 6에서의 평가 결과이다. 도 7에서, 실선은 블록킹 용액 I, 점선은 블록킹 용액 II, 2점 쇄선은 블록킹 용액 VI의 결과이다.
이하, 본 발명을 첨부 실시예를 참고하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
분석 재료를 분석하는 방법 및/또는 장치에 있어서 분석 재료는 검출 재료 간의 특이적인 결합에 의해 분석되는 것이 일반적이다. 예를 들면, 분석 재료는 항원, 항체 등을 포함하는 단백질, DNA, RNA, 프로브, 프라이머 등을 포함하는 핵산이 될 수 있다. 이때 분석 재료에 대한 신뢰성을 높이기 위해서는 검출 재료가 분석 재료 이외의 오염 재료에 비특이적으로 결합하는 것을 차단하거나 장치의 표면 등에 결합이 생기지 않도록 하는 블록킹 과정이 필수적으로 필요하다. 블록킹 과정은 일반적으로 검출 재료의 투입 전에 수행된다.
본 발명은 블록킹 반응 시간을 줄여 분석 재료의 분석 시간을 단축시킬 수 있고, 장기간 상온에서의 보관이 가능하고 세균에 대한 오염 발생이 없는 블록킹제를 제공하였다. 또한, 본 발명은 분석 재료 이외의 오염 재료에 대한 비특이적인 결합을 완전히 차단하고 분석 재료와 검출 재료 간의 특이적인 결합에 영향을 주지 않아 분석 신뢰성을 높인 블록킹제를 제공하였다. 또한, 본 명은 용액 상태에서도 고체화되지 않아서 분석 자동화가 용이하여 분석 자동화를 실현할 수 있는 블록킹제를 제공하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 블록킹제는 생물학적 분석 재료의 특이적인 결합에 의한 분석 방법에 사용되며, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(polyoxyethylene alkyl ether)를 포함한다. 상기 분석 방법에 대해서는 하기에서 보다 상세하게 설명된다.
폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 반응 및/또는 응고 시간이 약 3분 내지 약 5분으로 짧아서 블록킹 반응 시간을 줄여 분석 재료의 분석 시간을 단축시킬 수 있다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 아민기가 없어 용액 상태로 장기간 예를 들면 6개월 이상 상온에서 보관이 가능하여 세균에 대한 오염 가능성이 전혀 없다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 분석 재료 이외의 오염 재료에 대한 비특이적인 결합을 완전히 차단하고 분석 재료와 검출 재료 간의 특이적인 결합에 영향을 주지 않아 분석 신뢰성을 높였다.
일 구체예에서, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
HO-[-CH2-CH2-O-]n-R
(상기 화학식 1에서,
n은 2 내지 100의 정수,
R은 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 10 내지 탄소수 20의 알킬기 또는 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 10 내지 탄소수 20의 알케닐기)
일 구체예에서, 상기 화학식 1에서 n은 구체적으로 10 내지 100이 될 수 있다. 상기 범위에서, 항원 항체의 분석에서 블록킹제로 용이하게 사용될 수 있고, 항원 항체의 분석 신뢰성을 높다 높일 수 있다.
일 구체예에서, R은 구체적으로 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 10 내지 탄소수 18의 알킬기 또는 탄소수 10 내지 탄소수 18의 알케닐기, 더 구체적으로 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 12 내지 탄소수 18의 알케닐기일 수 있다. 예를 들면, R은 올레일기, 라우릴기 또는 세틸기 등이 될 수 있다. 가장 바람직하게는 R은 올레일기가 될 수 있다.
일 구체예에서, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르 등을 포함하는 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르; 폴리옥시에틸렌(2) 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르 등을 포함하는 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르; 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌(10) 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르 등을 포함하는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르일 수 있다.
폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 평균 분자량이 300 내지 1200, 구체적으로 700 내지 1200, 더 구체적으로 1000 내지 1200이 될 수 있다. 상기 범위에서, 블록킹제로 사용하기가 용이할 수 있다.
폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 제조되거나 상업적으로 판매되는 제품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 블록킹제는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 염을 포함한다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 염은 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 산 염기 반응을 통해 제조되는 염을 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 술폰산염, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 포스폰산염 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명 일 실시예의 분석 재료의 검출 방법은 본 발명의 일 실시예의 블록킹제를 사용하여 블록킹 공정을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명 일 실시예의 분석 재료의 검출 방법은 생물학적 분석 재료의 검출에 사용될 수 있다. 생물학적 분석 재료는 항원, 항체 등을 포함하는 단백질, DNA, RNA, 프로브, 프라이머 등을 포함하는 핵산 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
블록킹 공정은 본 발명의 블록킹제를 소정의 버퍼에 용해시킨 블록킹 용액을 제조하고, 분석 재료를 함유하는 막 및/또는 기판을 상기 블록킹 용액으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 처리는 블록킹 용액에서 20℃ 내지 30℃, 구체적으로 20℃ 내지 25℃에서 3분 내지 20분 구체적으로 3분 내지 10분 더 구체적으로 3분 내지 5분 동안 처리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 범위에서, 본 발명의 블록킹제는 상술한 본 발명의 효과를 얻을 수 있다.
블록킹 용액 중 블록킹제는 0.01% 내지 5% 구체적으로 0.01% 내지 1%로 포함될 수 있다. 상기 범위에서, 블록킹 효과를 제대로 낼 수 있고, 미 반응된 블록킹제가 잔류함으로 인한 영향을 낮출 수 있다.
블록킹 용액 중 버퍼는 당업자에게 알려진 통상의 종류를 채용하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 버퍼는 TBST 버퍼, PBS 버퍼 중 1종 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 분석 재료의 검출 방법은 면역 반응을 기반으로 민감도와 특이도를 목적으로 하는 검출 방법으로서, 셀룰로오즈 기반의 진단 키트를 포함하는 신속 진단 키트, 단백질 칩, 화학 발광 면역 검사(Chemiluminescence immunoassay) 등의 자동화 진단 장비에서 블록킹을 요하는 방법에 적용될 수 있다.
상기 분석 재료의 검출 방법은 구체적으로 면역화학적 분석 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 분석 재료의 검출 방법은 효소-결합 면역 흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 형광-결합 면역 흡착 검사(fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA), 형광 효소-결합 면역 흡착 검사(fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay, FELISA), 형광 면역 검사(fluorescence immunoassay, FLIA), 화학발광 면역 검사 (Chemiluminescence immunoassay, CLIA), 효소 결합 면역 흡착 스폿 검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay, ELISPOT), 효소 면역 검사(enzyme immunoassay, EIA), 방사성 면역 검사(radioimmunoassay, RIA), 웨스턴 블롯(Western Blot), 서던 블롯(Southern Blot) 및 노던 블롯(Northern Blot) 중 1종 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명 일 실시예의 분석 재료의 검출 키트는 본 발명의 일 실시예의 블록킹제를 포함한다.
본 발명의 검출 키트는 상술 검출 방법이 적용된 키트를 포함할 수 있다.
본 발명의 효과를 이하의 실시예 및 비교예를 사용해서 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위가 이하의 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1: 웨스턴 블롯에서의 블록킹 민감도 평가]
3T3L1 세포(한국세포주은행, 전지방세포)를 5일간 1uM insulin과 1uM Dexametasone으로 처리하여 지방 세포로 분화시킨 후, Cell Lysis buffer(20mM Tris-HCl(pH7.4), 1mM EDTA, 140mM NACl, 1% NP-40, 1mM Na3VO4, 50mM NaF and 10ug/ml aprotinin)를 이용하여 분화된 3T3L1를 용해시킨 후, 분리하고자 하는 단백질인 Nrf1 함유 용액을 얻었다.
Laemmli 방법으로 12% SDS PAGE를 제조하고 상기 단백질 함유 용액을 전기영동하였다. 상기 단백질이 전기 영동된 겔에 전하를 인가하고 반건조 트랜스퍼공정에 의해 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하였다. 상기 니트로셀룰로스 막을 하기 표 1의 블록킹 용액 내에서 하기 표 1의 조건으로 침지하여 블록킹 처리하였다. 그런 다음, 1차 항체 Nrf1(Abcam, cat#:ab34682)을 처리하고 1시간 반응 후, PBST 버퍼로 5분에 걸쳐 3번 와싱(washing)하였다.
2차 항체 HRP-conjugated Ab(Jackson immuno, Cat#:115-035-003)으로 30분 반응하고 5분에 3번 와싱한후, 암실에서 ECL 반응을 하여 표적 단백질의 밴드를 확인하였다. 그 결과를 표 1, 도 1에 나타내었다.
블록킹 용액 I 블록킹 용액 II 블록킹 용액 III
단백질 총량
(㎍)		 20 15 10 20 15 10 20 15 10
블록킹 온도
(℃)		 25 25 25 25 25 25 25 25 25
블록킹 시간
(분)		 60 60 60 10 10 10 10 10 10
도 1에서의 결과 A B C D E F G H I
*블록킹 용액 I: Casein Blocking Buffer 10X(Sigma, cat#: B6429)
*블록킹 용액 II: SuperBlock T20(Thermo fisher, cat#: 37536)
*블록킹 용액 III: 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.2%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 1, 도 1에서 도시된 바와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 III은 10분 만에 완벽한 블록킹이 가능하여 표적 단백질의 밴드가 진하게 나왔음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 블록킹제는 0.2% 농도에서도 블록킹 효과가 탁월함을 알 수 있다.
반면에, 블록킹 용액 I은 1시간 동안의 블록킹에 의해 표적 단백질의 밴드가 나왔음을 알 수 있다. 또한, 블록킹 용액 II는 10분 만에 블록킹 효과가 나왔으나, 블록킹이 완벽하게 되지 않아서 백그라운드에도 시그널이 강하게 나왔음을 알 수 있다.
[실험예 2: 웨스턴 블롯에서의 블록킹 완벽도 평가]
하기 표 2, 표 3에서의 조건을 변경한 것을 제외하고는 실험예 1에 준하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 본 평가는 웨스턴 실험의 마지막 단계로 ECL 용액을 니트로셀롤로스 막에 반응시킨 후 필름에 과도하게 노출하였을때, 블록킹이 조금이라도 안되었으면 니트로셀롤로스 막에 비특이적으로 결합한 미량의 2차 항체 HRP-conjugated Ab로 인해 필름이 검게 감광되는 특성을 이용하여 최적의 노출시간 보다 과도한 노출을 수행하였다. 구체적으로 ECL 반응을 시킨 니트로셀룰로스 막을 암실로 옮겨 카세트에 넣고 그 위에 필름을 올려 놓아 ECL 반응에 노출시켰다. 30초 후에 필름을 회수한 후 현상액(developer)에 넣고 이후 고정액(fixer)으로 씻어내 표적 단백질의 밴드를 확인하였다. 동일한 방법으로 3분간 필름에 감광하고 위와 동일한 반응으로 필름을 현상한다. 그 결과를 하기 표 2, 표 3, 도 2, 도 3에 나타내었다.
블록킹 용액 I 블록킹 용액 II
 블록킹 용액 III
단백질 총량(㎍) 10 5 10 5 10 5
블록킹 온도(℃) 25 25 25 25 25 25
블록킹 시간(분) 60 60 10 10 10 10
필름 노출 시간(초) 30 30 30 30 30 30
도 2에서의 결과 A B C D E F
블록킹 용액 I
 블록킹 용액 II
 블록킹 용액 III
단백질 총량(㎍) 10 5 10 5 10 5
블록킹 온도(℃) 25 25 25 25 25 25
블록킹 시간(분) 60 60 10 10 10 10
필름 노출 시간(초) 180 180 180 180 180 180
도 3에서의 결과 A B C D E F
*블록킹 용액 I: Casein Blocking Buffer 10X(Sigma, cat#: B6429)
*블록킹 용액 II: SuperBlock T20(Thermo fisher, cat#: 37536)
*블록킹 용액 III: 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.2%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 2, 표 3, 도 2, 도 3에서와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 III은 필름에 과다 노출되더라도 블록킹 효율이 낮아지지 않았고 10분 만에 완벽한 블록킹 효과를 얻었다.
반면에, 블록킹 용액 I은 블록킹이 되지만 항원 항체 반응이 떨어졌다. 블록킹 용액 II는 과다 노출시 백그라운드가 강하게 나와 블록킹 효율이 떨어졌다.
[실험예 3: 웨스턴 블롯에서의 블록킹 평가]
하기 표 4에서의 조건으로 실험예 1에 준하여 동일한 방식으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 경제적인 이유 등으로 실험실에서 블록킹 용액을 직접 제조하여 사용할 때 많이 사용하는 용액이 하기 표 4 의 블록킹 용액 IV와 블롯킹 용액 V이다. 블롯킹 용액 III과 비교하여 그 결과를 하기 표 4, 도 4에 나타내었다.
블록킹 용액 IV 블록킹 용액 V 블록킹 용액 III
단백질 총량(㎍) 20 15 10 20 15 10 20 15 10
블록킹 온도(℃) 25 25 25 25 25 25 25 25 25
블록킹 시간(분) 60 60 60 60 60 60 10 10 10
도 4에서의 결과 A B C D E F G H I
*블록킹 용액 IV: non-fat dry milk 5%의 TBS-T 버퍼 용액
*블록킹 용액 V: casein 1%의 TBS-T 버퍼 용액
*블록킹 용액 III: 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.2%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 4, 도 4에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 III은 0.2%의 용액으로 10분만 블록킹 하여도 항원 항체 간의 특이적인 결합이 증가하고 완벽한 블록킹 효과가 있음을 알 수 있다. 한편, 블록킹 용액 IV, 블록킹 용액 V은 1~5%를 포함하고 1시간이 되어야 블록킹 효과가 있음을 알 수 있다.
또한, 모든 블록킹 용액은 비특이적으로 코팅을 하기 때문에 니트로셀룰로스 막뿐만 아니라 단백질이 있는 곳에도 코팅을 하여 항원 항체의 결합을 방해하여 도 4와 같이 타겟 단백질에 항체가 결합하지 못해 밴드가 흐리거나 없는 경우가 생기는데 본 발명의 블록킹제는 0.2%의 적은 양으로 코팅을 하기 때문에 항원 항체의 결합에 영향 없이 진한 타겟 단백질밴드를 확인할 수 있다.
[실험예 4: 블록킹 평가]
닷 블롯(dot blot)을 수행하여 니트로셀룰로스 막에 하기 표 5에서의 블록킹 조건으로 블록킹한 후 2차 항체로 HRP conjugated 항체만을 사용하여 블록킹 효율을 평가하였다.
니트로셀룰로스 막을 직경 1cm로 둥글게 자른 후, 하기 표 5에서의 블록킹 용액에 10분간 담가 두었다. 그런 다음, 니트로셀룰로스 막을 PBST 용액으로 5분 동안 3번에 걸쳐 와싱하였다. 2차 항체 HRP-conjugated Ab(Jackson immuno, Cat#:115-035-003)으로 30분 반응하고 5분 동안 3번 와싱하였다. 이후, 암실에서 ECL 반응을 하여 2차 항체가 니트로셀룰로스 막에 결합하는지 확인함으로써 블록킹 효과를 평가하였다.
그 결과를 하기 표 5, 도 5에 나타내었다.
블록킹
용액(1)		 블록킹
용액(2)		 블록킹
용액(3)		 블록킹
용액(4)		 블록킹
용액(5)		 블록킹
용액(6)
단백질 총량(㎍) 20 20 20 20 20 20
블록킹 온도(℃) 25 25 25 25 25 25
블록킹 시간(분) 10 10 10 10 10 10
도 5에서의 결과 1 2 3 4 5 6
*블록킹 용액 (1): Casein Blocking Buffer 10X(Sigma, cat#: B6429)
*블록킹 용액 (2): SuperBlock T20(Thermo fisher, cat#: 37536)
*블록킹 용액 (3): non-fat dry milk 5%의 TBS-T 버퍼 용액
*블록킹 용액 (4): casein 1%의 TBS-T 버퍼 용액
*블록킹 용액 (5): bovine serum albumin 1%의 TBS-T 버퍼 용액
*블록킹 용액 (6): 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.2%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 5, 도 5에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 (6)은 10분 동안 공정에서도 블록킹 효과를 나타내었다. 그러나, 블록킹 용액 (1) 내지 (5)는 10분 동안의 공정에서는 블록킹 효과가 없음을 알 수 있다.
[실험예 5: ELISA에서의 블록킹 효율 평가]
항원으로 100ng/웰의 BSA vitamin D(자체 제작, 4℃, O/N)를 사용하고, 항체로 Vitamine D mAb(자체 제작, 0 내지 250ng/ml로 농도 변경)를 사용하고, 하기 표 6의 조건에서 ELISA 분석하였다. ELISA 방법은 아래와 같이 수행하였다.
96 well ELISA 플레이트에 BSA-Vitamin D를 PBS로 희석하여 well 당 100ng이 들어가도록 용액을 침지한 후, 상온에서 1시간동안 두고 PBST용액으로 3회에 걸쳐 와싱하였다. 상기 96well 플레이트를 하기 표 6의 블록킹 용액 내에서 하기 표 6의 조건으로 침지하여 블록킹 처리하였다.
그런 다음, 1차 항체 Vitamin D mAb를 처리하고 1시간 반응후, PBST 버퍼로 5분에 걸쳐 3번 와싱하였다. 상기 플레이트를 2차 항체 HRP-conjugated Ab(Jackson immuno, Cat#:115-035-003)으로 30분 반응하고 5분에 3번 와싱한 후, TMB solution으로 3분간 반응시킨 후, ELISA 리더기를 이용하여 450nm파장에서 결과를 확인하였다.
그 결과를 하기 표 6, 도 6에 나타내었다:
블록킹 용액 I 블록킹 용액 II 블록킹 용액 VI
블록킹 온도(℃) 25 25 25
블록킹 시간(분) 60 5 5
항체 농도
0 ng/ml 0.0485 0.0515 0.0484
10 ng/ml 0.4139 0.4323 0.4565
50 ng/ml 0.5632 0.6023 0.7326
250 ng/ml 0.557 0.6305 0.9141
*블록킹 용액 I: Casein Blocking Buffer 10X(Sigma, cat#: B6429)
*블록킹 용액 II: SuperBlock T20(Thermo fisher, cat#: 37536)
*블록킹 용액 VI: 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.02%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 6, 도 6에서와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 VI는 0.02%용액으로 10분 만에 완벽한 블록킹 효과를 내고 우수한 항원 항체 결합으로 30% 이상의 민감도 증가를 나타내었다.
[실험예 6: ELISA에서의 블록킹 효율 평가]
실험예 5에서, 하기 표 7과 같이 변경한 후, HRP conjugated 항체(Jackson immuno, Cat#:115-035-003)를 30분 동안 반응시킨 것을 제외하고는 실험예 5와 동일하게 평가하였다.
블록킹 시간을 하기 표 7과 같이 0분, 1분, 3분, 5분, 10분, 30분으로 다르게 하여 블록킹을 수행하였으며 그밖에 실험방법은 상기 실험예 5와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과를 하기 표 7, 도 7에 나타내었다.
블록킹 용액 I 블록킹 용액 II 블록킹 용액 VI
블록킹 온도(℃) 25 25 25
블록킹 시간(분) 60 5 5
블록킹 시간
30분 0.0496 0.0551 0.0481
10분 0.0789 0.0512 0.0473
5분 0.1945 0.0998 0.0501
3분 0.5544 0.3622 0.0553
1분 0.9956 0.7489 0.1492
no block 1.1207 1.0987 1.0784
*블록킹 용액 I: Casein Blocking Buffer 10X(Sigma, cat#: B6429)
*블록킹 용액 II: SuperBlock T20(Thermo fisher, cat#: 37536)
*블록킹 용액 VI: 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 0.02%의 TBS-T 버퍼 용액
상기 표 7, 도 7에서와 같이, 본 발명의 블록킹제를 포함하는 블록킹 용액 VI는 3분 만에 완벽한 블록킹 효과를 내었음을 알 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (8)

  1. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 그의 염을 포함하는 것인, 블록킹제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르; 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 중 1종 이상을 포함하는 것인, 블록킹제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르인 것인, 블록킹제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 블록킹제를 사용하여 블록킹 공정을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 분석 재료의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 블록킹 공정은 상기 블록킹제를 0.01% 내지 5% 포함하는 블록킹 용액을 20℃ 내지 30℃에서 3분 내지 20분 동안 처리하는 것을 포함하는 것인, 분석 재료의 검출 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 분석 재료의 검출 방법은 효소-결합 면역 흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 형광-결합 면역 흡착 검사(fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA), 형광 효소-결합 면역 흡착 검사(fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay, FELISA), 형광 면역 검사(fluorescence immunoassay, FLIA), 화학 발광 면역 검사 (Chemiluminescence immunoassay, CLIA), 효소 결합 면역 흡착 스폿 검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay, ELISPOT), 효소 면역 검사(enzyme immunoassay, EIA), 방사성 면역 검사(radioimmunoassay, RIA), 웨스턴 블롯(Western Blot), 서던 블롯(Southern Blot) 및 노던 블롯(Northern Blot) 중 1종 이상을 포함하는 것인, 분석 재료의 검출 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 분석 재료의 검출 방법은 면역 반응에 기초한 것인, 분석 재료의 검출 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 블록킹제를 포함하는 것인, 분석 재료의 검출 키트.
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