WO2018143531A1 - 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법 - Google Patents

단백질의 번역후 변형 모니터링 방법 Download PDF

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WO2018143531A1
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post
translational modification
protein
microbead
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이수현
강지윤
김민호
김윤경
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한국과학기술연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for monitoring a tau protein, and more particularly, to a method for monitoring post-translational modification of a protein.
  • tauopathies Abnormal tau aggregation is a major feature in Alzheimer's disease (AD) and many other neurodegenerative diseases (collectively called tauopathies) (Brandt R, Hundelt M, Shahani N). (2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models.Biochimica. Et biophysica.acta. 1739: 331-354). In healthy nerves, tau stabilizes microtubules by promoting growth from axons and polarization of nerve cells. In the case of pathological hyperphosphorylation, tau separates from microtubules to produce insoluble aggregates (Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
  • the degree of phosphorylation and O-glycosylation of tau protein can be measured, it can be the basis for judging disease progression rate or prognosis. In addition, it can be used as a tool to verify the effects of drug development.
  • the tau protein can be detected accurately, it can be helpful in determining the prognosis of neurodegenerative diseases or in determining the therapeutic effect.
  • Tau PET is currently known as a test method for tau protein.
  • tau PET requires oral administration of radioactive material (contrast agent), which limits the test interval and is expensive.
  • radioactive material contrast agent
  • the tau protein has a low concentration, so that quantitative analysis is very difficult, so that accurate and reliable detection is difficult.
  • the absolute amount of tau protein or phosphorylated tau protein does not exactly match the patient's disease state. Therefore, even if the absolute amount of tau protein or phosphorylated tau protein can be detected, it is difficult to use as an indicator for diagnosing the condition or prognosis of the patient.
  • the technical problem of the present invention was conceived in this respect, and can provide a method for monitoring post-translational modification of a protein that can increase reliability and is easy to perform.
  • a method for monitoring post-translational modification of a protein preparing a first microbead by binding a protein antibody to the surface of the base bead, the protein of the first microbead Preparing a second microbead by binding the antibody to a target protein having a first post-translational modification or a second post-translational modification in inverse proportion to each other, wherein the second microbead is a first post-translational modification of the target protein.
  • Preparing a third microbead by binding to a first post-translational modification antibody that selectively binds to the second post-translational antibody to selectively bind the second microbead to a second post-translational modification of the protein of interest.
  • the target protein is tau protein.
  • the first post-translational modification is a phosphorylated tau protein and the second post-translational modification is an O-glycosylated tau protein.
  • the base bead is a magnetic bead.
  • the reference impedance is an impedance of the first microbead.
  • the reference impedance is an impedance of the second microbead.
  • obtaining the ratio of the first difference to the second difference may include obtaining the ratio of the first difference to the second difference at a first time point, different from the first time point. Obtaining a ratio of the first difference to the second difference at a second time point, and comparing the ratio at the first time point and the ratio at the second time point.
  • measuring the impedance of the third microbead and the fourth microbead is performed by placing the third microbead or the fourth microbead between the first electrode and the second electrode. .
  • a method for monitoring post-translational modification of a protein comprises: binding a first post-translational modification antibody that selectively binds to the first post-translational modification to a first post-translational modification of a target protein, thereby providing a first Preparing a post-translational modification medium, a second post-translational antibody that selectively binds to the second post-translational modification to a second post-translational modification of the target protein in inverse relationship with the first post-translational modification Combining to prepare a second post-translational modification medium, wherein the first post-translational modification medium of the first post-translational modification medium is subject to physical or chemical properties that vary with the amount of the first post-translational modification and the second post-translational modification.
  • the first measurement value and the second measurement value are each an impedance.
  • the first post-translational modification medium and the second post-translational modification medium each include a phosphor or a light emitter, wherein the first measurement and the second measurement value respectively according to the amount of the phosphor or light emitter Optical measurement.
  • the protein corresponding to the desired post-translational modification Reliable detection results can be obtained with respect to the increase or decrease and the degree of increase or decrease.
  • 1 is a flow chart schematically showing a method for monitoring post-translational modification of proteins, according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is a graph illustrating a step of determining whether a target protein is increased or decreased by using a post-translational modification monitoring method of a protein according to an embodiment of the present invention.
  • 3A to 3F are cross-sectional views illustrating a method of manufacturing a biosensor having a nano gap usable in a method for monitoring post-translational modification of proteins according to an embodiment of the present invention.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
  • 1 is a flow chart schematically showing a method for monitoring post-translational modification of proteins, according to an embodiment of the invention.
  • a microbead 10 coupled with a protein antibody 20 capable of binding to a target protein is prepared (S10).
  • the micro beads 10 may be magnetic beads made of a metal, a polymer, or the like.
  • the diameter of the microbead 10 may be 1 ⁇ m to 5 ⁇ m, but is not limited thereto, and may be 10 ⁇ m or more depending on the antibody and the detection system.
  • At least one protein antibody 20 is bound to the surface of the microbead 10.
  • the beads may be tosylate treated, amine treated, or carboxyl group treated such that the microbead 10 may bind to the antibody.
  • the protein antibody 20 may be combined with a protein to be detected.
  • the protein to be detected may be a Tau protein.
  • the antibody for binding to the tau protein known ones can be used.
  • the microbead 10 bound to the protein antibody 20 may be referred to as a first microbead.
  • the target protein 30 is coupled to the protein antibody 20 of the microbead 10 (S20).
  • the microbead 10 and the protein 30 may be mixed, followed by appropriate incubation and washing.
  • the target protein 30 may be tau, which may be obtained from a body fluid including at least one of blood, plasma, serum, saliva, urine, tears, runny nose and spinal fluid.
  • the microbead 10 coupled to the target protein 30 may be referred to as a second microbead.
  • the target protein 30 has at least two post-translational modifications (first post-translational modification and second post-translational modification), and the post-translational modification antibody is provided with at least two corresponding to each post-translational modification.
  • first post-translational modification and second post-translational modification the post-translational modification antibody is provided with at least two corresponding to each post-translational modification.
  • the target protein 30 may be phosphorylated tau or O-glycosylated tau.
  • tau proteins can be O-glycosylated or phosphorylated by the following reactions, which are known to have a trade-off with each other.
  • the post-translational modification antibody may comprise a first post-translational modification antibody 42 capable of selectively binding to phosphorylated tau and a second post-translational modification antibody capable of selectively binding to O-glycosylated tau ( 44 are provided respectively.
  • the number, or ratio, of the post-translational modification antibodies that bind to the target protein 30 may vary depending on the degree of post-translational modification of the target protein 30, which is, for example, the microbeads It can be measured by changing the impedance of.
  • microbead S30-1 after binding with the first post-translational modified antibody 42 may be referred to as a third microbead, and the microbead S30 after binding with the second post-translational modified antibody 44. -2) may be referred to as a fourth microbead.
  • the impedance of the microbeads S30-2 after binding with the post-modified antibody 44 is measured, respectively.
  • a biosensor may be used.
  • the biosensor may have an electrode structure having a nanogap. This will be described later.
  • the microbeads (S20) after binding to the target protein and the microbeads after binding with the post-translational modification antibody may have different impedances.
  • the impedance of the microbead after binding with the post-translational modified antibody is smaller than the measured impedance of the microbead (S20) after binding to the target protein.
  • the impedance difference (pre-binding) of the microbeads may increase.
  • the difference between the measured impedance of the microbead (S20) after binding with the target protein and the impedance of the microbead after binding with the post-translational modified antibody may be a marker for the degree of post-translational modification of the target protein.
  • the amount of protein changes significantly. Therefore, it is difficult to use only the absolute amount of phosphorylated tau protein as an indicator for diagnosing the condition or prognosis of the patient.
  • the present invention by measuring the impedance change caused by glycosylated tau that is inversely related to the phosphorylated tau in particular, and using the ratio of the impedance change caused by the phosphorylated tau as an index, Reliable measurement results can be obtained for the increase and decrease of phosphorylated tau and can be used as an indicator for diagnosing the condition or prognosis of the patient.
  • the impedance of the microbeads S20 after binding with the target protein may be used, but this is exemplary, and in another embodiment, the microbeads after binding with the protein antibody 20.
  • the impedance of S10 may be used as the reference impedance.
  • protein antibody and the post-translationally modified antibodies those which are currently commercially available can be used.
  • antibodies that can selectively bind to phosphorylated tau include Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Antibody (AT8) MN1020 (Thermo Fisher), Anti-Tau (phosphor S396) antibody [EPR2731] / ab109390 ( abcam), Phospho-Tau (ser202_ Antibody, # 11834) (Cell signaling), Phospho-Tau (ser396) (PHF13) Mouse mAb, # 9632 (Cell signaling), and the like.
  • O-GlcNAc an antibody capable of binding to various O-glycosylated proteins including tau
  • O-GlcNAc an antibody capable of binding to various O-glycosylated proteins including tau
  • Mouse mAB, # 9875 Cell signaling
  • the present invention is not limited thereto.
  • FIG. 2 is a graph illustrating a step of determining whether a target protein is increased or decreased by using a post-translational modification monitoring method of a protein according to an embodiment of the present invention.
  • a sample containing tau protein is taken from a subject patient, the impedance of the microbeads of step S20 is measured, and the microbeads of step S20.
  • a first post-translational modified antibody capable of binding to phosphorylated P Tau and a second post-translational modified antibody capable of binding to O-glycosylated Og Tau are combined with a first post-translational modified antibody capable of binding to phosphorylated P Tau and a second post-translational modified antibody capable of binding to O-glycosylated Og Tau, respectively, and then the respective impedances are measured. .
  • the impedance (Zt1) of the reference microbead (microbead not bound with the post-translational modified antibody), the impedance by the microbead coupled with the first post-translational modified antibody (Zp1), and the second post-translational modified antibody are bound.
  • the impedance (Zo1) of the microbeads is measured, respectively, and thus, the impedance decrease (Zt1-Zp1) due to phosphorylated tau and the impedance decrease (Zt1-Zo1) due to O-glycosylated tau can be obtained. .
  • a sample containing the tau protein is taken from the subject patient at a second time point, for example, September, and the impedance of the microbeads of step S20 is measured, and the microbeads of the step S20 are phosphorylated tau.
  • Each impedance is measured after binding with a first post-translational modified antibody capable of binding to (P Tau) and a second post-translational modified antibody capable of binding to O-glycosylated Og Tau.
  • the impedance (Zt2) of the reference microbead (microbead not bound with the post-translational modified antibody), the impedance by the microbead coupled with the first post-translational modified antibody (Zp2), and the second post-translational modified antibody are bound.
  • the impedance (Zo2) values of the microbeads are measured, respectively, and thus, the impedance reduction (Zt2-Zp2) due to phosphorylated tau and the impedance reduction (Zt2-Zo2) due to O-glycosylated tau can be obtained. .
  • the ratio of phosphorylated tau to O-glycosylated tau can be represented as Zt1-Zp1 / Zt1-Zo1, and at the second time point, Zt2-Zp2 / Zt2-Zo2. Can lose.
  • the phosphorylated tau increases or decreases according to the direction (increase or decrease) of the change in the ratio of phosphorylated tau to O-glycosylated tau, and consequently, the progression of the disease associated with phosphorylated tau or Can be an indicator of improvement.
  • the above method was used to detect or measure phosphorylated tau protein, but the present invention is not limited thereto, and similarly detects or detects all proteins having post-translational modifications of mutually exclusive relationship with tau protein. Can be used for measurement.
  • the measurement of the impedance is used, but the present invention is not limited to this, and similar indices may be obtained by measuring other physical or chemical properties.
  • the post-translational modification antibody may be bound to a phosphor.
  • the microbeads (hereinafter referred to as post-translational modification media) bound to the post-translational modification antibody comprise different amounts of phosphors depending on the amount of post-translational modification of the protein of interest.
  • the optical properties of the first post-translational modification medium bound to the first post-translational modification antibody and the second post-translational modification medium bound to the second post-translational modification antibody for example, the By measuring the intensity, the intensity of the reflected light, and the like, a first measured value for the first post-translational modified medium and a second measured value for the second post-translational modified medium can be obtained.
  • a value (difference) corresponding to the change in the optical property due to the first post-translational deformation may be obtained, and comparing the second measured value and the reference value to obtain a second translation.
  • a value (difference) corresponding to a change in optical properties due to post deformation can be obtained.
  • the ratio of the differences may be indicative of the ratio of the first post-translational modification and the second post-translational modification in the sample comprising the protein of interest.
  • the phosphor, before the post-translational modification antibody is combined with the target protein may be coupled with the post-translational modification antibody in advance, but in another embodiment, the post-translational modification antibody may be combined with the target protein. After binding, it may be bound to the post-translational modification antibody.
  • the phosphor may be replaced with a chemiluminescence.
  • 3A to 3F are cross-sectional views illustrating a method of manufacturing a biosensor having a nano gap usable in a method for monitoring post-translational modification of proteins according to an embodiment of the present invention.
  • an inorganic insulating layer 120 is formed on the base substrate 110.
  • the first metal layer 130 is formed on the inorganic insulating layer 120.
  • a first photoresist pattern 140 is formed on the first metal layer 130.
  • the base substrate 110 may include silicon, glass, quartz, polymer, or the like.
  • the inorganic insulating layer 120 may include an insulating material such as silicon oxide or silicon nitride.
  • the first metal layer 130 may include gold, silver, platinum, chromium, copper, titanium, alloys thereof, and the like, and may have a single layer or a stacked structure of different metal layers. In one embodiment, the first metal layer 130 may have a two-layer structure of chromium / gold.
  • the first photoresist pattern 140 partially covers the first metal layer 130 to partially expose the top surface of the first metal layer 130.
  • the first metal layer 130 is etched to form a first electrode 132.
  • the etching consists of isotropic etching by wet etching. Therefore, the first electrode 132 forms an undercut with respect to the first photoresist pattern 140.
  • a second metal layer 134 is formed on the exposed upper surface of the first photoresist pattern 140 and the inorganic insulating layer 120.
  • the second metal layer 134 may be formed by deposition such as sputtering, atomic beam deposition, or the like, and is not formed under the first photoresist pattern 140 having an undercut.
  • the second metal layer 134 may include gold, silver, platinum, chromium, copper, titanium, alloys thereof, and the like, and may have a single layer or a stacked structure of different metal layers. In one embodiment, the second metal layer 134 may have a two-layer structure of chromium / gold.
  • the first photoresist pattern 140 and the second metal layer 134 disposed thereon are removed. Therefore, a nanogap NG may be formed between the first electrode 132 and the remaining second metal layer 134. Since the nanogap is not formed by etching with a mask after exposure of the photolithography process but by lift-off after formation of the undercut, the nanogap may be smaller than the limit of the critical dimension of photolithography and a large area of the wafer level. Process is possible.
  • a second photoresist pattern 150 is formed on the first electrode 132 and the remaining second metal layer 134.
  • the second photoresist pattern 150 may cover the nanogap NG and partially expose the second metal layer 134.
  • the remaining second metal layer 134 is etched using the second photoresist pattern 159 as a mask to form a second electrode 136 and a contact portion 138.
  • an organic insulating layer 160 is formed on the first electrode 132, the second electrode 136, and the contact portion 138.
  • the organic insulating layer may include a first opening OP1 exposing the nanogap NG and a second opening OP2 exposing the contact portion 138.
  • a magnetic bead may be inserted into the first opening OP1 of the biosensor for sensing.
  • a magnetic microbead is provided on the biosensor, and a magnetic body is disposed under the biosensor, the magnetic attraction force is applied to the microbead by the magnetic body in a vertical direction.
  • the magnetic body is moved in the horizontal direction, the microbeads outside the first opening OP1 may be inserted into the first opening OP1 by moving along the magnetic body.
  • the microbead When the microbead is inserted into the first opening OP1, a voltage is applied to the first electrode 132 and the second electrode 136 to measure the impedance of the microbead.
  • the microbeads have different impedances according to the number of bound antibodies and proteins, and the sensed impedances may be transmitted to an external device, for example, a signal analysis device, through the contact unit 138.
  • the size of the electric field can be increased by using a sensor having a nanogap, for example, a nanogap of 1 ⁇ m or less.
  • a sensor having a nanogap for example, a nanogap of 1 ⁇ m or less.
  • very low concentrations of protein can be detected easily and reliably.
  • the biosensor may include an array in which a plurality of electrode pairs having the nanogap is arranged.
  • the biosensor may include an array in which electrode pairs having the nanogap are arranged in 10 ⁇ 10, 20 ⁇ 20, 30 ⁇ 30, and the like.
  • the magnetic beads bound to the tau protein binding antibody are washed with 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA) and blocked with 0.2M Tris buffer. 30 mg / mL of the microbead solution was stored in PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20) containing 0.4% Block Ace.
  • PBST Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20
  • Thiamet G a drug that dilutes tau protein at a concentration of 5250 ng / mL with 0.1% PBST at various concentrations (0.5 fg / mL to 50 pg / mL) by 1/10 and O-glycosylates tau protein as needed. Treated with.
  • the tau protein (diluent) and the microbeads (diluent) were mixed at a concentration of 1: 2, The reaction was carried out for 22 hours in the refrigerator.
  • microbeads bound to the tau protein were washed twice with 0.1% PBST, washed twice with PBS (Phosphate Buffered Saline), and then the bead concentration was 60 ⁇ L / PBS. Dilute to ml.
  • the microbeads were mixed with 10.4 ng of antibodies capable of binding O-glycosylated proteins (Cell signaling, O-GlcNAc (CTD110.6) Mouse mAB, # 9875), and reacted for 22 hours in a refrigerator.
  • Cell signaling O-GlcNAc (CTD110.6) Mouse mAB, # 9875
  • microbeads bound to the O-glycosylated tau binding antibody were washed twice with 0.1% PBST, washed twice with PBS, and then 60 ⁇ l / ml of bead concentration with PBS. Dilute as much as possible.
  • microbeads were mixed with 10 ng of antibodies (Thermo Fisher, Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Antibody (AT8), MN1020) capable of binding to phosphorylated tau protein, and reacted for 22 hours in a refrigerator.
  • antibodies Thermo Fisher, Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Antibody (AT8), MN1020
  • microbeads bound to the phosphorylated tau binding antibody were washed twice with 0.1% PBST, washed twice with PBS, and then diluted to 60 ⁇ l / ml with PBS.
  • PBS PBS solution that does not contain microbeads
  • Neg means a sample containing microbeads that do not bind to tau protein, only protein binding antibody
  • BAT (bead-antibody-tau)
  • BAT2 (bead-antibody-tau-2nd_antibody) refers to a sample obtained by treating microbeads bound to tau protein with O-GlcNAc or AT8.
  • the impedance change rate is a value obtained by dividing the difference between Neg's impedance (Zneg) and measured impedance (BAT or BAT2) by Neg's impedance (Zneg) and multiplying by 100, and the difference in impedance change rate is the change in impedance change rate of BAT2. It is defined as minus the rate of change in impedance of BAT.
  • Table 1-1 below shows the impedance of samples not treated with Thiamet G tau protein
  • Table 1-2 shows the impedance of samples treated with Thiamet G 100 uM tau protein, and the impedance change according to the concentration of tau protein. was measured.
  • the impedance change rate difference in the microbeads bound to the O-glycosylated antibody by increasing the concentration of Thiamet G, ie increasing the O-glycosylation of the tau protein It was confirmed that increased significantly. Thus, through this, it can be confirmed that the increase and decrease of O-glycosylation of tau protein can be detected. In addition, even at very low tau protein concentrations, for example, 0.5 fg / ml, differences in impedance change rates can be seen.
  • Table 2-1 shows the impedance of samples reacted with O-GlcNAc microbeads bound to Thiamet G treated tau protein (0.5 pg / ml), and Table 2-2 shows tau protein treated with Thiamet G.
  • the impedance of the samples reacted with AT8 reacted with (0.5 pg / ml) microbeads is shown, and the impedance change is measured according to the concentration of Thiamet G (0 uM, 10 uM, 30 uM, 100 uM).
  • Table 3 shows the difference between BAT and BAT2 impedances (BAT-BAT2 or BAT2-BAT) and thus phosphorylated tau (P) and O-glycosylated versus Neg's impedances in Tables 2-1 and 2-2. The ratio of impedance change by tau O is shown.
  • an increase in the concentration of Thiamet G can be seen to mean an increase in O-glycosylated tau, that is, a decrease in phosphorylated tau, which can be detected from a decrease in the value of P / O. It can be confirmed that.
  • the present invention can be used to monitor the prognosis, course, therapeutic response and the like of disease through protein detection. It can also be applied to platforms for developing therapeutics for diseases such as tau disease.

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Abstract

개시된 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제2 차이에 대한, 상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제1 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.

Description

단백질의 번역후 변형 모니터링 방법
본 발명은 타우(tau) 단백질의 모니터링 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 관한 것이다.
비정상적인 타우(tau)의 응집은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 다른 여러 신경퇴행성 질병들 (집합적으로, 타우병(tauopathies)이라 부름)에 있어서 주된 특징이다(Brandt R, Hundelt M, Shahani N(2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models. Biochimica. et biophysica. acta. 1739: 331-354). 건강한 신경에서, 타우는 축색돌기 (axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화 (polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관 (microtubules)을 안정화한다. 병리학적으로 과다인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성한다(Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
알츠하이머병을 앓고 있는 뇌들에서 비정상적으로 과도하게 인산화된 타우 및 그 응집체들이 발병원으로서 관찰된다. 따라서, 과도한 인산화는 일반적으로 타우 응집의 원인으로 간주된다.
최근 연구 결과에 따르면, 타우 단백질의 여러 post translational modification (PTM) 중에서 과다인산화와 O-glycosylation 되는 것이 서로 반비례 관계에 있는 것이 밝혀지고 있다.
따라서 타우 단백질의 인산화 정도와 O-glycosylation 정도를 측정할 수 있다면 질병의 진행속도나 예후를 판단할 수 있는 근거가 될 수 있다. 또한 신약 개발에 의해서 그 효과를 검증할 수 있는 tool 로서 활용될 수 있다.
따라서, 타우 단백질을 정확하게 검출할 수 있는 경우, 신경퇴행성 질병들의 예후를 판단하거나, 치료 효과를 판단하는데 도움이 될 수 있다.
현재 타우 단백질의 검사 방법으로는 타우 PET이 알려져 있다. 그러나, 타우 PET을 위해서는 방사선 물질(조영제)을 경구투여해야 하므로, 검사 간격에 제한이 있으며, 비용이 높다. 또한, 혈액 검사 등을 이용하고자 하는 경우, 타우 단백질은 그 농도가 낮아, 정량분석이 매우 어려워 신뢰성 있는 정확한 검출이 어렵다.
또한, 최근의 연구결과를 참조하면, 각 환자마다 단백질 양의 차이로 인하여, 타우 단백질 또는 인산화된 타우 단백질의 절대량이 환자의 질병 상태와 정확하게 일치하지 않는다. 따라서, 타우 단백질 또는 인산화된 타우 단백질의 절대량을 검출할 수 있다고 하더라도, 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용하기 어렵다.
본 발명의 기술적 과제는 이러한 점에서 착안된 것으로, 신뢰성을 높일 수 있으며, 수행이 용이한 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 실현하기 위한 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제2 차이에 대한, 상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제1 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 대상 단백질은 타우 단백질이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질이다.
일 실시예에 따르면, 상기 베이스 비드는 자성 비드이다.
일 실시예에 따르면, 상기 기준 임피던스는, 상기 제1 마이크로 비드의 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 기준 임피던스는, 상기 제2 마이크로 비드의 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계는, 제1 시점에서, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계, 상기 제1 시점과 다른 제2 시점에서, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계, 및 상기 제1 시점의 상기 비율과, 상기 제2 시점의 상기 비율을 비교하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 측정하는 단계는, 제1 전극 및 제2 전극 사이에 상기 제3 마이크로 비드 또는 상기 제4 마이크로 비드를 배치하여 수행된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 대상 단백질의 제1 번역후 변형에, 상기 제1 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제1 번역후 변형 매체를 준비하는 단계, 상기 제1 번역후 변형과 반비례적 관계에 있는 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형에, 상기 제2 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제2 번역후 변형 매체를 준비하는 단계, 상기 제1 번역후 변형 및 상기 제2 번역후 변형의 양에 따라 변화하는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제1 번역후 변형 매체의 제1 측정값을 얻는 단계, 상기 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제2 번역후 변형 매체의 제2 측정값을 얻는 단계 및 상기 제2 측정값과 기준값의 제2 차이에 대한, 상기 제1 측정값과 상기 기준값의 제1 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 번역후 변형 매체 및 상기 제2 번역후 변형 매체는 각각 형광체 또는 발광체를 포함하며, 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 상기 형광체 또는 발광체의 양에 따른 광학 측정값이다.
본 발명에 따르면, 서로 반비례 관계를 갖는 번역후 변형된 단백질의 양에 따라 변하는 물리적 성질 또는 화학적 성질을 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 이용하여 대상 단백질의 증감 여부를 판단하는 단계를 설명하기 위한 그래프이다.
도 3a 내지 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 이용 가능한 나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.
본 출원에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
단백질의 번역후 변형 모니터링 방법
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 1을 참조하면, 먼저, 대상 단백질과 결합이 가능한 단백질 항체(20)와 결합된 마이크로 비드(10)를 준비한다(S10).
예를 들어, 상기 마이크로 비드(10, 베이스 비드)는 금속, 고분자 등으로 이루어진 자성 비드일 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로 비드(10)의 직경은 1㎛ 내지 5㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 항체 및 검출 시스템에 따라 10㎛ 이상의 것이 사용될 수도 있다.
상기 마이크로 비드(10)의 표면에는 적어도 한 개의 단백질 항체(20)가 결합된다. 상기 마이크로 비드(10)가 항체와 결합할 수 있도록, 상기 비드는 토실레이트 처리되거나, 아민처리되거나, 카르복실기가 처리될 수 있다.
상기 단백질 항체(20)는 검출 대상 단백질과 결합이 가능하다. 예를 들어, 상기 검출 대상 단백질은 타우(Tau) 단백질일 수 있다. 상기 타우 단백질과 결합하기 위한 항체는 공지의 것들이 사용될 수 있다.
상기 단백질 항체(20)와 결합된 마이크로 비드(10)는 제1 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
다음으로, 상기 마이크로 비드(10)의 단백질 항체(20)에 대상 단백질(30)을 결합시킨다(S20). 상기 단백질 항체(20)에 대상 단백질(30)을 결합하기 위하여, 상기 마이크로 비드(10)와 대상 단백질(30)을 혼합한 후, 적절한 인큐베이션 및 세척이 수행될 수 있다. 상기 대상 단백질(30)은 타우일 수 있으며, 이는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 눈물, 콧물, 척수액 중 적어도 하나를 포함하는 체액으로부터 얻어진 것일 수 있다.
상기 대상 단백질(30)과 결합된 마이크로 비드(10)는 제2 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
다음으로, 상기 대상 단백질(30)의 번역후 변형에 따라 선택적으로 결합이 가능한 번역후 변형 항체를 제공하여, 상기 대상 단백질(30)과 상기 번역후 변형 항체를 결합시킨다.(S30-1, S30-2)
예를 들어, 상기 대상 단백질(30)은 적어도 두가지 번역후 변형(제1 번역후 변형 및 제2 번역후 변형)을 가지며, 상기 번역후 변형 항체는, 각 번역후 변형에 대응되는 적어도 두가지가 제공될 수 있다.
예를 들어, 상기 대상 단백질(30)은, 인산화된 타우 또는 O-글리코실화된 타우일 수 있다. 예를 들어, 타우 단백질은 다음과 같은 반응에 의해 O-글리코실화되거나 인산화될 수 있으며, 이들은 상호 반비례적 관계(trade-off)를 갖는 것으로 알려져 있다.
Figure PCTKR2017009793-appb-I000001
따라서, 상기 번역후 변형 항체는, 인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 제1 번역후 변형 항체(42)와, O-글리코실화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 제2 번역후 변형 항체(44)가 각각 제공된다.
따라서, 상기 대상 단백질(30)과 결합하는 상기 번역후 변형 항체의 수, 또는, 그 비율은 상기 대상 단백질(30)의 번역후 변형 정도에 따라 달라질 수 있으며, 이는, 예를 들어, 상기 마이크로 비드의 임피던스 변화에 의해 측정될 수 있다.
상기 제1 번역후 변형 항체(42)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-1)는 제3 마이크로 비드로 지칭될 수 있으며, 상기 제2 번역후 변형 항체(44)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-2)는 제4 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20), 상기 제1 번역후 변형 항체(42)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-1)의 임피던스 및 상기 제2 번역후 변형 항체(44)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-2)의 임피던스를 각각 측정한다. 상기 마이크로 비드의 임피던스를 측정하기 위하여, 바이오 센서가 이용될 수 있다. 바람직하게, 상기 바이오 센서는 나노갭을 갖는 전극 구조를 가질 수 있다. 이에 대하여는 후술하기로 한다.
상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)와 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드는 서로 다른 임피던스를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 측정된 임피던스보다 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드의 임피던스가 작아진다. 또한, 상기 대상 단백질에 결합되는 번역후 변형 항체의 수가 증가할 경우, 마이크로 비드의 임피던스 차이(결합전-결합후)는 증가할 수 있다.
따라서, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 측정된 임피던스와 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드의 임피던스의 차이가, 상기 대상 단백질의 번역후 변형 정도에 대한 마커가 될 수 있다. 그러나, 각 환자에 따라 또는 측정 시기에 따라, 단백질 양의 변화가 크다. 따라서, 인산화된 타우 단백질의 절대량만 가지고 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용하기 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 인산화된 타우와 특정한 관계가 있는, 구체적으로 반비례 관계가 있는 글리코실화된 타우에 의한 임피던스 변화를 측정하고, 이에 대한 상기 인산화된 타우에 의한 임피던스 변화의 비율을 지표로 이용함으로써, 인산화된 타우의 증감 여부 및 그 정도에 대하여 신뢰성 있는 측정 결과를 얻을 수 있으며, 이를 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 기준 임피던스로서, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 임피던스가 사용될 수 있으나, 이는 예시적인 것이며, 다른 실시예에서, 상기 단백질 항체(20)와 결합된 후의 마이크로 비드(S10)의 임피던스가 기준 임피던스로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서는, 서로 반비례적 관계를 갖는 번역후 변형된 단백질에 대한 임피던스를 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.
상기 단백질 항체 및 상기 번역후 변형 항체들로는 현재 시판 중인 것들이 사용될 수 있다.
예를 들어, 인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체로는, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8) MN1020(Thermo Fisher), Anti-Tau(phosphor S396) antibody [EPR2731]/ab109390(abcam), Phospho-Tau(ser202_ Antibody, #11834)(Cell signaling), Phospho-Tau(ser396) (PHF13) Mouse mAb, #9632(Cell signaling) 등이 사용될 수 있다. 또한, O-글리코실화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체(타우 포함하여 O-글리코실화된 다양한 단백질에 결합할 수 있는 항체)로는, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875(Cell signaling) 등이 사용될 수 있으나, 이들은 예시적인 것으로서 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 이용하여 대상 단백질의 증감 여부를 판단하는 단계를 설명하기 위한 그래프이다.
도 1 및 2를 참조하면, 제1 시점, 예를 들어 8월(August)에 대상 환자로부터 타우 단백질을 포함하는 샘플을 채취하여, S20 단계의 마이크로 비드의 임피던스를 측정하고, S20 단계의 마이크로 비드를, 인산화된 타우(P Tau)와 결합 가능한 제1 번역후 변형 항체 및 O-글리코실화된 타우(O-g Tau)와 결합 가능한 제2 번역후 변형 항체와 각각 결합시킨 후, 각각의 임피던스를 측정한다. 이에 따라, 기준 마이크로 비드(번역후 변형 항체와 결합되지 않은 마이크로 비드)의 임피던스(Zt1), 제1 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드에 의한 임피던스(Zp1) 및 제2 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드의 임피던스(Zo1) 값이 각각 측정되며, 이에 따라, 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zp1) 및 O-글리코실화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zo1)이 얻어질 수 있다.
다음으로, 제2 시점, 예를 들어 9월(September)에 대상 환자로부터 타우 단백질을 포함하는 샘플을 채취하여, S20 단계의 마이크로 비드의 임피던스를 측정하고, S20 단계의 마이크로 비드를, 인산화된 타우(P Tau)와 결합 가능한 제1 번역후 변형 항체 및 O-글리코실화된 타우(O-g Tau)와 결합 가능한 제2 번역후 변형 항체와 각각 결합시킨 후, 각각의 임피던스를 측정한다. 이에 따라, 기준 마이크로 비드(번역후 변형 항체와 결합되지 않은 마이크로 비드)의 임피던스(Zt2), 제1 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드에 의한 임피던스(Zp2) 및 제2 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드의 임피던스(Zo2) 값이 각각 측정되며, 이에 따라, 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zp2) 및 O-글리코실화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zo2)이 얻어질 수 있다.
앞에서 설명한 것과 같이, 인산화된 타우를 직접적으로 정량적으로 측정하는 것이 어렵다는 점을 고려했을 때, 제1 시점에서의 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zp1)과 제2 시점에서의 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zp2)을 비교하는 것은, 인산화된 타우의 증감을 판단하기에는 신뢰성이 낮다.
그러나, 인산화된 타우는 O-글리코실화된 타우와 상호 배타적인(반비례적인)관계를 가지므로, 이 둘의 비율을 비교하는 것은 신뢰성 있는 검출 방법이 될 수 있다.
예를 들어, 제1 시점에서, O-글리코실화된 타우에 대한 인산화된 타우의 비율은 Zt1-Zp1/Zt1-Zo1로 나타내질 수 있으며, 제2 시점에서, Zt2-Zp2/Zt2-Zo2로 나타내질 수 있다.
따라서, O-글리코실화된 타우에 대한 인산화된 타우의 비율의 변화의 방향(증가 또는 감소)에 따라 인산화된 타우의 증감 여부를 판단할 수 있으며, 결과적으로, 인산화된 타우와 연관된 질병의 진행 또는 호전에 대한 지표가 될 수 있다. 또한, 변화의 크기에 따라 질병의 진행 또는 호전의 속도 또는 정도를 판단이 가능할 수 있다.
본 실시예에서는, 인산화된 타우 단백질의 검출 또는 측정을 이용하여 상기 방법을 이용하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 타우 단백질과 유사하게 서로 배타적인 관계의 번역후 변형을 갖는 모든 단백질의 검출 또는 측정을 위하여 이용될 수 있다.
상기 실시예에서는, 임피던스의 측정을 이용하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 다른 물리적 성질 또는 화학적 성질을 측정하여 유사한 지표를 얻을 수 있다.
예를 들어, 상기 번역후 변형 항체는 형광체와 결합된 것일 수 있다. 이 경우, 상기 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드(이하에서, 번역후 변형 매체로 지칭될 수 있다.)는 대상 단백질의 번역후 변형의 양에 따라 다른 양의 형광체를 포함한다.
따라서, 제1 번역후 변형 항체와 결합된 제1 번역후 변형 매체와 제2 번역후 변형 항체와 결합된 제2 번역후 변형 매체의 광학적 성질, 예를 들어, 특정 파장의 광에 대하여 발광하는 광의 세기, 반사광의 세기 등을 측정하여, 제1 번역후 변형 매체에 대한 제1 측정값 및 제2 번역후 변형 매체에 대한 제2 측정값을 얻을 수 있다. 또한, 상기 제1 측정값과 기준값을 비교하여, 제1 번역후 변형에 의한 광학적 성질의 변화에 대응하는 값(차이)을 얻을 수 있으며, 상기 제2 측정값과 기준값을 비교하여, 제2 번역후 변형에 의한 광학적 성질의 변화에 대응하는 값(차이)을 얻을 수 있다. 상기 차이들의 비율은, 대상 단백질을 포함하는 샘플에서, 제1 번역후 변형과 제2 번역후 변형의 비율을 나타내는 지표가 될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 형광체는, 상기 번역후 변형 항체가 상기 대상 단백질과 결합되기 전에, 미리 상기 번역후 변형 항체와 결합될 수 있으나, 다른 실시예에서는, 상기 번역후 변형 항체가 상기 대상 단백질과 결합된 후, 상기 번역후 변형 항체에 결합될 수도 있다.
다른 실시예에서, 상기 형광체는 발광체(chemiluminescence)로 대체될 수 있다.
나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조방법
도 3a 내지 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 이용 가능한 나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.
도 3a를 참조하면, 베이스 기판(110) 위에 무기 절연층(120)을 형성한다. 상기 무기 절연층(120) 위에 제1 금속층(130)을 형성한다. 상기 제1 금속층(130) 위에 제1 포토레지스트 패턴(140)을 형성한다.
예를 들어, 상기 베이스 기판(110)은, 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 무기 절연층(120)은, 실리콘 산화물, 실리콘 질화물 등의 절연 물질을 포함할 수 있다.
상기 제1 금속층(130)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 금속층(130)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
상기 제1 포토레지스트 패턴(140)은 상기 제1 금속층(130)을 부분적으로 커버하여, 상기 제1 금속층(130)의 상면을 부분적으로 노출시킨다.
도 3b를 참조하면, 상기 제1 금속층(130)을 식각하여, 제1 전극(132)을 형성한다. 상기 식각은, 습식 식각에 의한 등방성 식각으로 이루어진다. 따라서, 상기 제1 전극(132)은, 제1 포토레지스트 패턴(140)에 대하여 언더컷을 형성한다.
도 3c를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(140) 및 상기 무기 절연층(120)의 노출된 상면 위에 제2 금속층(134)을 형성한다. 상기 제2 금속층(134)은 스퍼터링, 원자빔증착 등과 같은 증착에 의해 형성될 수 있으며, 언더컷이 형성된 상기 제1 포토레지스트 패턴(140)의 아래에는 형성되지 않는다.
상기 제2 금속층(134)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제2 금속층(134)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
도 3d를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(140) 및 그 위에 배치된 상기 제2 금속층(134)을 제거한다. 따라서, 상기 제1 전극(132)과 잔류하는 제2 금속층(134) 사이에는 나노갭(NG)이 형성될 수 있다. 상기 나노갭은, 포토리소그라피 공정의 노광 후, 마스크를 이용한 식각에 의해 형성되지 않고, 언더컷 형성 후 리프트 오프에 의해 형성되므로, 포토리소그라피의 critical dimension의 한계 보다 작아질 수 있으며, 웨이퍼 레벨의 대면적 공정이 가능하다.
도 3e를 참조하면, 상기 제1 전극(132) 및 잔류 제2 금속층(134) 위에 제2 포토레지스트 패턴(150)을 형성한다. 상기 제2 포토레지스트 패턴(150)은 상기 나노갭(NG)을 커버하고, 상기 제2 금속층(134)을 부분적으로 노출할 수 있다.
도 3f를 참조하면, 상기 제2 포토레지스트 패턴(159)을 마스크로 이용하여, 상기 잔류 제2 금속층(134)을 식각하여, 제2 전극(136) 및 콘택부(138)를 형성한다.
도 3g를 참조하면, 상기 제1 전극(132), 상기 제2 전극(136) 및 상기 콘택부(138) 위에 유기 절연층(160)을 형성한다. 상기 유기 절연층은 상기 나노갭(NG)을 노출하는 제1 개구부(OP1) 및 상기 콘택부(138)를 노출하는 제2 개구부(OP2)를 포함할 수 있다.
상기 바이오 센서의 제1 개구부(OP1)에는, 센싱을 위하여 자성을 갖는 마이크로 비드가 삽입될 수 있다. 예를 들어, 자성을 갖는 마이크로 비드를 상기 바이오 센서 상에 제공하고, 상기 바이오 센서의 아래에 자성체를 배치하면, 상기 마이크로 비드에 상기 자성체에 의하여 수직 방향의 인력이 가해진다. 상기 자성체를 수평 방향으로 이동시키면, 상기 자성체를 따라 이동함으로써, 상기 제1 개구부(OP1) 밖의 마이크로 비드가, 상기 제1 개구부(OP1) 안에 삽입될 수 있다.
상기 마이크로 비드가, 상기 제1 개구부(OP1)에 삽입되면, 상기 마이크로 비드의 임피던스를 측정하기 위하여, 상기 제1 전극(132) 및 상기 제2 전극(136)에 전압이 인가된다. 상기 마이크로 비드는, 결합된 항체 및 단백질의 수 등에 따라 다른 임피던스를 갖게되며, 감지된 임피던스는 상기 콘택부(138)를 통해 외부 장치, 예를 들면, 신호 분석 장치 등으로 전달될 수 있다.
본 발명에 따르면, 나노갭, 예를 들어, 1㎛ 이하의 나노갭을 갖는 센서를 이용함으로써, 전기장의 크기를 증가시킬 수 있다. 따라서, 매우 낮은 농도의 단백질을 용이하고 신뢰성있게 검출할 수 있다.
상기 바이오 센서는 상기 나노갭을 갖는 전극 쌍이 복수가 배열된 어레이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오 센서는 상기 나노갭을 갖는 전극 쌍이 10X10, 20X20, 30X30 등으로 배열된 어레이를 포함할 수 있다.
이하에서는 구체적인 실험예를 참조하여, 본 발명의 실시예들의 효과를 살펴보기로 한다.
단백질 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
토실레이트 처리된 마그네틱 비드(Thermo Fisher, Dynabead M-280, 직경 2.8㎛, 14203)와 타우 단백질 결합 항체(abcam, Anti-Tau(Phosphor S262) antibody, ab64193, 50㎕/250㎕)를 0.1M의 PBS 버퍼에 넣고, 37℃도의 인큐베이터 안에 배치한 후, 롤 믹서 위에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 마그네틱 비드를 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA)로 세척하고, 0.2M의 트리스 버퍼로 블록 처리한다. 상기 마이크로 비드 용액 30mg/mL를 0.4% Block Ace가 포함된 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20)에 넣어서 보관하였다.
합성예 1 - 타우 단백질이 결합된 마이크로 비드의 준비
5250ng/mL 농도의 타우 단백질을 0.1% PBST를 이용하여, 다양한 농도 (0.5fg/mL ~ 50pg/mL)로 1/10씩 희석하고, 필요에 따라 타우 단백질을 O 글라이코실화 시키는 약물인 Thiamet G로 처리하였다.
상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 300㎕/ml로 희석한 후, 상기 타우 단백질(희석액)과 상기 마이크로 비드(희석액)를 1:2의 농도로 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
합성예 2 - O- 글리코실화 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
합성예 1과 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 마이크로 비드를, O-글리코실화된 단백질과 결합이 가능한 항체(Cell signaling, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875) 10.4ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 O-글리코실화된 타우 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
합성예 3 - 인산화 타우 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
합성예 1과 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 마이크로 비드를, 인산화된 타우 단백질과 결합이 가능한 항체(Thermo Fisher, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8), MN1020) 10ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 인산화 타우 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
상기에 따라 얻어진 샘플들을, 전극 간격이 0.7㎛인 바이오 센서 어레이(10x10 또는 20x20)를 이용하여, 임피던스를 측정하였다. 이하의 표에서, PBS는 마이크로 비드를 포함하지 않은 PBS 용액을 의미하며, Neg는 타우 단백질과 결합하지 않고, 단백질 결합 항체만을 갖는 마이크로 비드를 포함하는 샘플을 의미하고, BAT(bead-antibody-tau)는 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 포함하는 샘플을 의미하고, BAT2(bead-antibody-tau-2nd_antibody)는, 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 O-GlcNAc 또는 AT8로 처리한 샘플을 의미한다. 또한, 임피던스 변화율은, Neg의 임피던스(Zneg)와 측정 임피던스(BAT 또는 BAT2)의 차이를 Neg의 임피던스(Zneg)로 나누고 100을 곱한 값(%)이며, 임피던스 변화율 차이는, BAT2의 임피던스 변화율에서 BAT의 임피던스 변화율을 뺀 값으로 정의된다.
아래의 표 1-1은 타우 단백질을 Thiamet G로 처리하지 않은 샘플들의 임피던스를 나타내며, 표 1-2는 타우 단백질을 Thiamet G 100uM로 처리한 샘플들의 임피던스를 나타내며, 타우 단백질의 농도에 따라 임피던스 변화를 측정하여 나타내었다.
표 1-1
Figure PCTKR2017009793-appb-I000002
표 1-2
Figure PCTKR2017009793-appb-I000003
상기의 표 1-1 및 표 1-2를 참조하면, Thiamet G의 농도를 높임으로써, 즉 타우 단백질의 O-글리코실화를 증가시킬 경우, O-글리코실화 항체와 결합된 마이크로 비드에서 임피던스 변화율 차이가 크게 증가한 것을 확인하였다. 따라서, 이를 통하여, 타우 단백질의 O-글리코실화의 증감이 검출될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 매우 낮은 타우 단백질 농도, 예를 들어, 0.5fg/ml에서도 임피던스 변화율의 차이를 확인할 수 있다.
아래의 표 2-1는 Thiamet G를 처리한 타우 단백질(0.5pg/ml)과 결합된 마이크로 비드를 O-GlcNAc과 반응시킨 샘플들의 임피던스를 나타내며, 표 2-2는 Thiamet G를 처리한 타우 단백질(0.5pg/ml)과 결합된 마이크로 비드를 AT8과 반응시킨 샘플들의 임피던스를 나타내며, Thiamet G의 농도(0uM, 10uM, 30uM, 100uM)에 따라 임피던스 변화를 측정하여 나타내었다.
표 2-1
Figure PCTKR2017009793-appb-I000004
표 2-2
Figure PCTKR2017009793-appb-I000005
하기의 표 3은 표 2-1 및 표 2-2에서 Neg의 임피던스에 대한 BAT와 BAT2 임피던스의 차이(BAT-BAT2 또는 BAT2-BAT) 및 이에 따라 인산화된 타우(P)와 O-글리코실화된 타우(O)에 의한 임피던스 변화의 비율을 나타낸다.
표 3
Figure PCTKR2017009793-appb-I000006
표 3을 참조하면, Thiamet G의 농도가 증가한 것은, O-글리코실화된 타우의 증가, 즉 인산화된 타우의 감소를 의미하는 것으로 볼 수 있으며, 이를 P/O의 값이 감소하는 것으로부터 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상에서는 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은, 단백질 검출을 통한 질병의 예후, 경과, 치료 반응 등을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 또한 타우병증과 같은 질병의 치료제를 개발하는 플랫폼에 적용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계; 및
    상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제2 차이에 대한, 상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제1 차이의 비율을 얻는 단계를 포함하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상 단백질은 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베이스 비드는 자성 비드인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 기준 임피던스는, 상기 제1 마이크로 비드의 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 기준 임피던스는, 상기 제2 마이크로 비드의 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계는,
    제1 시점에서, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계;
    상기 제1 시점과 다른 제2 시점에서, 상기 제2 차이에 대한 상기 제1 차이의 비율을 얻는 단계; 및
    상기 제1 시점의 상기 비율과, 상기 제2 시점의 상기 비율을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 측정하는 단계는,
    제1 전극 및 제2 전극 사이에 상기 제3 마이크로 비드 또는 상기 제4 마이크로 비드를 배치하여 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  9. 대상 단백질의 제1 번역후 변형에, 상기 제1 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제1 번역후 변형 매체를 준비하는 단계;
    상기 제1 번역후 변형과 반비례적 관계에 있는 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형에, 상기 제2 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제2 번역후 변형 매체를 준비하는 단계;
    상기 제1 번역후 변형 및 상기 제2 번역후 변형의 양에 따라 변화하는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제1 번역후 변형 매체의 제1 측정값을 얻는 단계;
    상기 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제2 번역후 변형 매체의 제2 측정값을 얻는 단계; 및
    상기 제1 측정값과 기준값의 제1 차이에 대한, 상기 제2 측정값과 상기 기준값의 제2 차이의 비율을 얻는 단계를 포함하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 대상 단백질은 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제1 번역후 변형 매체 및 상기 제2 번역후 변형 매체는 각각 형광체 또는 발광체(chemiluminescence)를 포함하며, 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 상기 형광체 또는 발광체의 양에 따른 광학 측정값인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
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