KR102103284B1 - 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법 - Google Patents

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Abstract

개시된 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계 및 상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제1 차이에 대한, 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제2 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.

Description

단백질의 번역후 변형 모니터링 방법{METHOD FOR MONITORING POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION OF PROTEIN}
본 발명은 타우(tau) 단백질의 모니터링 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 관한 것이다.
비정상적인 타우(tau)의 응집은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 다른 여러 신경퇴행성 질병들 (집합적으로, 타우병(tauopathies)이라 부름)에 있어서 주된 특징이다(Brandt R, Hundelt M, Shahani N(2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models. Biochimica. et biophysica. acta. 1739: 331-354). 건강한 신경에서, 타우는 축색돌기 (axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화 (polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관 (microtubules)을 안정화한다. 병리학적으로 과다인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성한다(Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
알츠하이머병을 앓고 있는 뇌들에서 비정상적으로 과도하게 인산화된 타우 및 그 응집체들이 발병원으로서 관찰된다. 따라서, 과도한 인산화는 일반적으로 타우 응집의 원인으로 간주된다.
최근 연구 결과에 따르면, 타우 단백질의 여러 post translational modification (PTM) 중에서 과다인산화와 O-glycosylation 되는 것이 서로 반비례 관계에 있는 것이 밝혀지고 있다.
따라서 타우 단백질의 인산화 정도와 O-glycosylation 정도를 측정할 수 있다면 질병의 진행속도나 예후를 판단할 수 있는 근거가 될 수 있다. 또한 신약 개발에 의해서 그 효과를 검증할 수 있는 tool 로서 활용될 수 있다.
따라서, 타우 단백질을 정확하게 검출할 수 있는 경우, 신경퇴행성 질병들의 예후를 판단하거나, 치료 효과를 판단하는데 도움이 될 수 있다.
현재 타우 단백질의 검사 방법으로는 타우 PET이 알려져 있다. 그러나, 타우 PET을 위해서는 방사선 물질(조영제)을 경구투여해야 하므로, 검사 간격에 제한이 있으며, 비용이 높다. 또한, 혈액 검사 등을 이용하고자 하는 경우, 타우 단백질은 그 농도가 낮아, 정량분석이 매우 어려워 신뢰성 있는 정확한 검출이 어렵다.
또한, 최근의 연구결과를 참조하면, 각 환자마다 단백질 양의 차이로 인하여, 타우 단백질 또는 인산화된 타우 단백질의 절대량이 환자의 질병 상태와 정확하게 일치하지 않는다. 따라서, 타우 단백질 또는 인산화된 타우 단백질의 절대량을 검출할 수 있다고 하더라도, 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용하기 어렵다.
본 발명의 기술적 과제는 이러한 점에서 착안된 것으로, 신뢰성을 높일 수 있으며, 수행이 용이한 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 실현하기 위한 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계 및 상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제1 차이에 대한, 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제2 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 대상 단백질은 타우 단백질이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질이다.
일 실시예에 따르면, 상기 베이스 비드는 자성 비드이다.
일 실시예에 따르면, 상기 기준 임피던스는, 상기 제1 마이크로 비드의 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 기준 임피던스는, 상기 제2 마이크로 비드의 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계는, 제1 시점에서, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계, 상기 제1 시점과 다른 제2 시점에서, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계, 및 상기 제1 시점의 상기 비율과, 상기 제2 시점의 상기 비율을 비교하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 측정하는 단계는, 제1 전극 및 제2 전극 사이에 상기 제3 마이크로 비드 또는 상기 제4 마이크로 비드를 배치하여 수행된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법은, 대상 단백질의 제1 번역후 변형에, 상기 제1 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제1 번역후 변형 매체를 준비하는 단계, 상기 제1 번역후 변형과 반비례적 관계에 있는 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형에, 상기 제2 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제2 번역후 변형 매체를 준비하는 단계, 상기 제1 번역후 변형 및 상기 제2 번역후 변형의 양에 따라 변화하는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제1 번역후 변형 매체의 제1 측정값을 얻는 단계, 상기 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제2 번역후 변형 매체의 제2 측정값을 얻는 단계 및 상기 제1 측정값과 기준값의 제1 차이에 대한, 상기 제2 측정값과 상기 기준값의 제2 차이의 비율을 얻는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 임피던스이다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 번역후 변형 매체 및 상기 제2 번역후 변형 매체는 각각 형광체 또는 발광체를 포함하며, 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 상기 형광체 또는 발광체의 양에 따른 광학 측정값이다.
본 발명에 따르면, 서로 반비례 관계를 갖는 번역후 변형된 단백질의 양에 따라 변하는 물리적 성질 또는 화학적 성질을 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 이용하여 대상 단백질의 증감 여부를 판단하는 단계를 설명하기 위한 그래프이다.
도 3a 내지 3g는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 이용 가능한 나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.
본 출원에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
단백질의 번역후 변형 모니터링 방법
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 1을 참조하면, 먼저, 대상 단백질과 결합이 가능한 단백질 항체(20)와 결합된 마이크로 비드(10)를 준비한다(S10).
예를 들어, 상기 마이크로 비드(10, 베이스 비드)는 금속, 고분자 등으로 이루어진 자성 비드일 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로 비드(10)의 직경은 1㎛ 내지 5㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 항체 및 검출 시스템에 따라 10㎛ 이상의 것이 사용될 수도 있다.
상기 마이크로 비드(10)의 표면에는 적어도 한 개의 단백질 항체(20)가 결합된다. 상기 마이크로 비드(10)가 항체와 결합할 수 있도록, 상기 비드는 토실레이트 처리되거나, 아민처리되거나, 카르복실기가 처리될 수 있다.
상기 단백질 항체(20)는 검출 대상 단백질과 결합이 가능하다. 예를 들어, 상기 검출 대상 단백질은 타우(Tau) 단백질일 수 있다. 상기 타우 단백질과 결합하기 위한 항체는 공지의 것들이 사용될 수 있다.
상기 단백질 항체(20)와 결합된 마이크로 비드(10)는 제1 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
다음으로, 상기 마이크로 비드(10)의 단백질 항체(20)에 대상 단백질(30)을 결합시킨다(S20). 상기 단백질 항체(20)에 대상 단백질(30)을 결합하기 위하여, 상기 마이크로 비드(10)와 대상 단백질(30)을 혼합한 후, 적절한 인큐베이션 및 세척이 수행될 수 있다. 상기 대상 단백질(30)은 타우일 수 있으며, 이는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 눈물, 콧물, 척수액 중 적어도 하나를 포함하는 체액으로부터 얻어진 것일 수 있다.
상기 대상 단백질(30)과 결합된 마이크로 비드(10)는 제2 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
다음으로, 상기 대상 단백질(30)의 번역후 변형에 따라 선택적으로 결합이 가능한 번역후 변형 항체를 제공하여, 상기 대상 단백질(30)과 상기 번역후 변형 항체를 결합시킨다.(S30-1, S30-2)
예를 들어, 상기 대상 단백질(30)은 적어도 두가지 번역후 변형(제1 번역후 변형 및 제2 번역후 변형)을 가지며, 상기 번역후 변형 항체는, 각 번역후 변형에 대응되는 적어도 두가지가 제공될 수 있다.
예를 들어, 상기 대상 단백질(30)은, 인산화된 타우 또는 O-글리코실화된 타우일 수 있다. 예를 들어, 타우 단백질은 다음과 같은 반응에 의해 O-글리코실화되거나 인산화될 수 있으며, 이들은 상호 반비례적 관계(trade-off)를 갖는 것으로 알려져 있다.
Figure 112017083243428-pat00001
따라서, 상기 번역후 변형 항체는, 인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 제1 번역후 변형 항체(42)와, O-글리코실화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 제2 번역후 변형 항체(44)가 각각 제공된다.
따라서, 상기 대상 단백질(30)과 결합하는 상기 번역후 변형 항체의 수, 또는, 그 비율은 상기 대상 단백질(30)의 번역후 변형 정도에 따라 달라질 수 있으며, 이는, 예를 들어, 상기 마이크로 비드의 임피던스 변화에 의해 측정될 수 있다.
상기 제1 번역후 변형 항체(42)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-1)는 제3 마이크로 비드로 지칭될 수 있으며, 상기 제2 번역후 변형 항체(44)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-2)는 제4 마이크로 비드로 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20), 상기 제1 번역후 변형 항체(42)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-1)의 임피던스 및 상기 제2 번역후 변형 항체(44)와 결합된 후의 마이크로 비드(S30-2)의 임피던스를 각각 측정한다. 상기 마이크로 비드의 임피던스를 측정하기 위하여, 바이오 센서가 이용될 수 있다. 바람직하게, 상기 바이오 센서는 나노갭을 갖는 전극 구조를 가질 수 있다. 이에 대하여는 후술하기로 한다.
상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)와 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드는 서로 다른 임피던스를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 측정된 임피던스보다 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드의 임피던스가 작아진다. 또한, 상기 대상 단백질에 결합되는 번역후 변형 항체의 수가 증가할 경우, 마이크로 비드의 임피던스 차이(결합전-결합후)는 증가할 수 있다.
따라서, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 측정된 임피던스와 상기 번역후 변형 항체와 결합된 후의 마이크로 비드의 임피던스의 차이가, 상기 대상 단백질의 번역후 변형 정도에 대한 마커가 될 수 있다. 그러나, 각 환자에 따라 또는 측정 시기에 따라, 단백질 양의 변화가 크다. 따라서, 인산화된 타우 단백질의 절대량만 가지고 을 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용하기 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 인산화된 타우와 특정한 관계가 있는, 구체적으로 반비례 관계가 있는 글리코실화된 타우에 의한 임피던스 값을 측정하고, 이에 대한 비율을 지표로 이용함으로써, 인산화된 타우의 증감 여부 및 그 정도에 대하여 신뢰성 있는 측정 결과를 얻을 수 있으며, 이를 환자의 상태 또는 예후를 진단하는 지표로 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 기준 임피던스로서, 상기 대상 단백질과 결합된 후의 마이크로 비드(S20)의 임피던스가 사용될 수 있으나, 이는 예시적인 것이며, 다른 실시예에서, 상기 단백질 항체(20)와 결합된 후의 마이크로 비드(S10)의 임피던스가 기준 임피던스로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서는, 서로 반비례적 관계를 갖는 번역후 변형된 단백질에 대한 임피던스를 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.
상기 단백질 항체 및 상기 번역후 변형 항체들로는 현재 시판 중인 것들이 사용될 수 있다. 또한, 번역후 번형 항체가 타우 단백질에 대한 선택성을 갖는 것이 아니더라도, 번역후 변형에 대한 선택성이 있는 경우 사용될 수 있다.
예를 들어, 인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체로는, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8) MN1020(Thermo Fisher), Anti-Tau(phosphor S396) antibody [EPR2731]/ab109390(abcam), Phospho-Tau(ser202_ Antibody, #11834)(Cell signaling), Phospho-Tau(ser396) (PHF13) Mouse mAb, #9632(Cell signaling) 등이 사용될 수 있다. 또한, O-글리코실화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체(타우 포함하여 O-글리코실화된 다양한 단백질에 결합할 수 있는 항체)로는, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875(Cell signaling) 등이 사용될 수 있으나, 이들은 예시적인 것으로서 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법을 이용하여 대상 단백질의 증감 여부를 판단하는 단계를 설명하기 위한 그래프이다.
도 1 및 2를 참조하면, 제1 시점, 예를 들어 8월(August)에 대상 환자로부터 타우 단백질을 포함하는 샘플을 채취하여, S20 단계의 마이크로 비드의 임피던스를 측정하고, S20 단계의 마이크로 비드를, 인산화된 타우(P Tau)와 결합 가능한 제1 번역후 변형 항체 및 O-글리코실화된 타우(O-g Tau)와 결합 가능한 제2 번역후 변형 항체와 각각 결합시킨 후, 각각의 임피던스를 측정한다. 이에 따라, 기준 마이크로 비드(번역후 변형 항체와 결합되지 않은 마이크로 비드)의 임피던스(Zt1), 제1 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드에 의한 임피던스(Zp1) 및 제2 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드의 임피던스(Zo1) 값이 각각 측정되며, 이에 따라, 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zp1) 및 O-글리코실화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zo1)이 얻어질 수 있다.
다음으로, 제2 시점, 예를 들어 9월(September)에 대상 환자로부터 타우 단백질을 포함하는 샘플을 채취하여, S20 단계의 마이크로 비드의 임피던스를 측정하고, S20 단계의 마이크로 비드를, 인산화된 타우(P Tau)와 결합 가능한 제1 번역후 변형 항체 및 O-글리코실화된 타우(O-g Tau)와 결합 가능한 제2 번역후 변형 항체와 각각 결합시킨 후, 각각의 임피던스를 측정한다. 이에 따라, 기준 마이크로 비드(번역후 변형 항체와 결합되지 않은 마이크로 비드)의 임피던스(Zt2), 제1 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드에 의한 임피던스(Zp2) 및 제2 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드의 임피던스(Zo2) 값이 각각 측정되며, 이에 따라, 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zp2) 및 O-글리코실화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zo2)이 얻어질 수 있다.
앞에서 설명한 것과 같이, 인산화된 타우를 직접적으로 정량적으로 측정하는 것이 어렵다는 점을 고려했을 때, 제1 시점에서의 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt1-Zp1)과 제2 시점에서의 인산화된 타우에 의한 임피던스 감소분(Zt2-Zp2)을 비교하는 것은, 인산화된 타우의 증감을 판단하기에는 신뢰성이 낮다.
그러나, 인산화된 타우는 O-글리코실화된 타우와 상호 배타적인(반비례적인)관계를 가지므로, 이 둘의 비율을 비교하는 것은 신뢰성 있는 검출 방법이 될 수 있다.
예를 들어, 제1 시점에서, O-글리코실화된 타우에 대한 인산화된 타우의 비율은 Zt1-Zp1/Zt1-Zo1로 나타내질 수 있으며, 제2 시점에서, Zt2-Zp2/Zt2-Zo2로 나타내질 수 있다.
따라서, O-글리코실화된 타우에 대한 인산화된 타우의 비율의 변화의 방향(증가 또는 감소)에 따라 인산화된 타우의 증감 여부를 판단할 수 있으며, 결과적으로, 인산화된 타우와 연관된 질병의 진행 또는 호전에 대한 지표가 될 수 있다. 또한, 변화의 크기에 따라 질병의 진행 또는 호전의 속도 또는 정도를 판단이 가능할 수 있다.
본 실시예에서는, 인산화된 타우 단백질의 검출 또는 측정을 이용하여 상기 방법을 이용하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 타우 단백질과 유사하게 서로 배타적인 관계의 번역후 변형을 갖는 모든 단백질의 검출 또는 측정을 위하여 이용될 수 있다.
상기 실시예에서는, 임피던스의 측정을 이용하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 다른 물리적 성질 또는 화학적 성질을 측정하여 유사한 지표를 얻을 수 있다.
예를 들어, 상기 번역후 변형 항체는 형광체와 결합된 것일 수 있다. 이 경우, 상기 번역후 변형 항체와 결합된 마이크로 비드(이하에서, 번역후 변형 매체로 지칭될 수 있다.)는 대상 단백질의 번역후 변형의 양에 따라 다른 양의 형광체를 포함한다.
따라서, 제1 번역후 변형 항체와 결합된 제1 번역후 변형 매체와 제2 번역후 변형 항체와 결합된 제2 번역후 변형 매체의 광학적 성질, 예를 들어, 특정 파장의 광에 대하여 발광하는 광의 세기, 반사광의 세기 등을 측정하여, 제1 번역후 변형 매체에 대한 제1 측정값 및 제2 번역후 변형 매체에 대한 제2 측정값을 얻을 수 있다. 또한, 상기 제1 측정값과 기준값을 비교하여, 제1 번역후 변형에 의한 광학적 성질의 변화에 대응하는 값(차이)을 얻을 수 있으며, 상기 제2 측정값과 기준값을 비교하여, 제2 번역후 변형에 의한 광학적 성질의 변화에 대응하는 값(차이)을 얻을 수 있다. 상기 차이들의 비율은, 대상 단백질을 포함하는 샘플에서, 제1 번역후 변형과 제2 번역후 변형의 비율을 나타내는 지표가 될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 형광체는, 상기 번역후 변형 항체가 상기 대상 단백질과 결합되기 전에, 미리 상기 번역후 변형 항체와 결합될 수 있으나, 다른 실시예에서는, 상기 번역후 변형 항체가 상기 대상 단백질과 결합된 후, 상기 번역후 변형 항체에 결합될 수도 있다.
다른 실시예에서, 상기 형광체는 발광체(chemiluminescence)로 대체될 수 있다.
나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조방법
도 3a 내지 3g는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법에 이용 가능한 나노 갭을 갖는 바이오 센서의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.
도 3a를 참조하면, 베이스 기판(110) 위에 무기 절연층(120)을 형성한다. 상기 무기 절연층(120) 위에 제1 금속층(130)을 형성한다. 상기 제1 금속층(130) 위에 제1 포토레지스트 패턴(140)을 형성한다.
예를 들어, 상기 베이스 기판(110)은, 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 무기 절연층(120)은, 실리콘 산화물, 실리콘 질화물 등의 절연 물질을 포함할 수 있다.
상기 제1 금속층(130)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 금속층(130)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
상기 제1 포토레지스트 패턴(140)은 상기 제1 금속층(130)을 부분적으로 커버하여, 상기 제1 금속층(130)의 상면을 부분적으로 노출시킨다.
도 3b를 참조하면, 상기 제1 금속층(130)을 식각하여, 제1 전극(132)을 형성한다. 상기 식각은, 습식 식각에 의한 등방성 식각으로 이루어진다. 따라서, 상기 제1 전극(132)은, 제1 포토레지스트 패턴(140)에 대하여 언더컷을 형성한다.
도 3c를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(140) 및 상기 무기 절연층(120)의 노출된 상면 위에 제2 금속층(134)을 형성한다. 상기 제2 금속층(134)은 스퍼터링, 원자빔증착 등과 같은 증착에 의해 형성될 수 있으며, 언더컷이 형성된 상기 제1 포토레지스트 패턴(140)의 아래에는 형성되지 않는다.
상기 제2 금속층(134)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제2 금속층(134)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
도 3d를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(140) 및 그 위에 배치된 상기 제2 금속층(134)을 제거한다. 따라서, 상기 제1 전극(132)과 잔류하는 제2 금속층(134) 사이에는 나노갭(NG)이 형성될 수 있다. 상기 나노갭은, 포토리소그라피 공정의 노광 후, 마스크를 이용한 식각에 의해 형성되지 않고, 언더컷 형성 후 리프트 오프에 의해 형성되므로, 포토리소그라피의 critical dimension의 한계 보다 작아질 수 있으며, 웨이퍼 레벨의 대면적 공정이 가능하다.
도 3e를 참조하면, 상기 제1 전극(132) 및 잔류 제2 금속층(134) 위에 제2 포토레지스트 패턴(150)을 형성한다. 상기 제2 포토레지스트 패턴(150)은 상기 나노갭(NG)을 커버하고, 상기 제2 금속층(134)을 부분적으로 노출할 수 있다.
도 3f를 참조하면, 상기 제2 포토레지스트 패턴(159)을 마스크로 이용하여, 상기 잔류 제2 금속층(134)을 식각하여, 제2 전극(136) 및 콘택부(138)를 형성한다.
도 3g를 참조하면, 상기 제1 전극(132), 상기 제2 전극(136) 및 상기 콘택부(138) 위에 유기 절연층(160)을 형성한다. 상기 유기 절연층은 상기 나노갭(NG)을 노출하는 제1 개구부(OP1) 및 상기 콘택부(138)를 노출하는 제2 개구부(OP2)를 포함할 수 있다.
상기 바이오 센서의 제1 개구부(OP1)에는, 센싱을 위하여 자성을 갖는 마이크로 비드가 삽입될 수 있다. 예를 들어, 자성을 갖는 마이크로 비드를 상기 바이오 센서 상에 제공하고, 상기 바이오 센서의 아래에 자성체를 배치하면, 상기 마이크로 비드에 상기 자성체에 의하여 수직 방향의 인력이 가해진다. 상기 자성체를 수평 방향으로 이동시키면, 상기 자성체를 따라 이동함으로써, 상기 제1 개구부(OP1) 밖의 마이크로 비드가, 상기 제1 개구부(OP1) 안에 삽입될 수 있다.
상기 마이크로 비드가, 상기 제1 개구부(OP1)에 삽입되면, 상기 마이크로 비드의 임피던스를 측정하기 위하여, 상기 제1 전극(132) 및 상기 제2 전극(136)에 전압이 인가된다. 상기 마이크로 비드는, 결합된 항체 및 단백질의 수 등에 따라 다른 임피던스를 갖게되며, 감지된 임피던스는 상기 콘택부(138)를 통해 외부 장치, 예를 들면, 신호 분석 장치 등으로 전달될 수 있다.
본 발명에 따르면, 나노갭, 예를 들어, 1㎛ 이하의 나노갭을 갖는 센서를 이용함으로써, 전기장의 크기를 증가시킬 수 있다. 따라서, 매우 낮은 농도의 단백질을 용이하고 신뢰성있게 검출할 수 있다.
상기 바이오 센서는 상기 나노갭을 갖는 전극 쌍이 복수가 배열된 어레이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오 센서는 상기 나노갭을 갖는 전극 쌍이 10X10, 20X20, 30X30 등으로 배열된 어레이를 포함할 수 있다.
이하에서는 구체적인 실험예를 참조하여, 본 발명의 실시예들의 효과를 살펴보기로 한다.
단백질 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
토실레이트 처리된 마그네틱 비드(Thermo Fisher, Dynabead M-280, 직경 2.8㎛, 14203)와 타우 단백질 결합 항체(abcam, Anti-Tau(Phosphor S262) antibody, ab64193, 50㎕/250㎕)를 0.1M의 PBS 버퍼에 넣고, 37℃도의 인큐베이터 안에 배치한 후, 롤 믹서 위에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 마그네틱 비드를 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA)로 세척하고, 0.2M의 트리스 버퍼로 블록 처리한다. 상기 마이크로 비드 용액 30mg/mL를 0.4% Block Ace가 포함된 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20)에 넣어서 보관하였다.
합성예 1 - 타우 단백질이 결합된 마이크로 비드의 준비
5250ng/mL 농도의 타우 단백질을 0.1% PBST를 이용하여, 다양한 농도 (0.5fg/mL ~ 50pg/mL)로 1/10씩 희석하고, 필요에 따라 타우 단백질을 O 글라이코실화 시키는 약물인 Thiamet G로 처리하였다.
상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 300㎕/ml로 희석한 후, 상기 타우 단백질(희석액)과 상기 마이크로 비드(희석액)를 1:2의 농도로 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
합성예 2­O- 글리코실화 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
합성예 1과 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 마이크로 비드를, O-글리코실화된 단백질과 결합이 가능한 항체(Cell signaling, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875) 10.4ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 O-글리코실화된 타우 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
합성예 3­인산화 타우 항체가 결합된 마이크로 비드의 준비
합성예 1과 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 마이크로 비드를, 인산화된 타우 단백질과 결합이 가능한 항체(Thermo Fisher, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8), MN1020) 10ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 인산화 타우 결합 항체와 결합된 마이크로 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
상기에 따라 얻어진 샘플들을, 전극 간격이 0.7㎛인 바이오 센서 어레이(10x10 또는 20x20)를 이용하여, 임피던스를 측정하였다. 이하의 표에서, PBS는 마이크로 비드를 포함하지 않은 PBS 용액을 의미하며, Neg는 타우 단백질과 결합하지 않고, 단백질 결합 항체만을 갖는 마이크로 비드를 포함하는 샘플을 의미하고, BAT(bead-antibody-tau)는 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 포함하는 샘플을 의미하고, BAT2(bead-antibody-tau-2nd_antibody)는, 타우 단백질과 결합된 마이크로 비드를 O-GlcNAc 또는 AT8로 처리한 샘플을 의미한다. 또한, 임피던스 변화율은, Neg의 임피던스(Zneg)와 측정 임피던스(BAT 또는 BAT2)의 차이를 Neg의 임피던스(Zneg)로 나누고 100을 곱한 값(%)이며, 임피던스 변화율 차이는, BAT2의 임피던스 변화율에서 BAT의 임피던스 변화율을 뺀 값으로 정의된다.
아래의 표 1-1은 타우 단백질을 Thiamet G로 처리하지 않은 샘플들의 임피던스를 나타내며, 표 1-2는 타우 단백질을 Thiamet G 100uM로 처리한 샘플들의 임피던스를 나타내며, 타우 단백질의 농도에 따라 임피던스 변화를 측정하여 나타내었다.
표 1-1
Figure 112017083243428-pat00002
표 1-2
Figure 112017083243428-pat00003
상기의 표 1-1 및 표 1-2를 참조하면, Thiamet G의 농도를 높임으로써, 즉 타우 단백질의 O-글리코실화를 증가시킬 경우, O-글리코실화 항체와 결합된 마이크로 비드에서 임피던스 변화율 차이가 크게 증가한 것을 확인하였다. 따라서, 이를 통하여, 타우 단백질의 O-글리코실화의 증감이 검출될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 매우 낮은 타우 단백질 농도, 예를 들어, 0.5fg/ml에서도 임피던스 변화율의 차이를 확인할 수 있다.
아래의 표 2-1는 Thiamet G를 처리한 타우 단백질(0.5pg/ml)과 결합된 마이크로 비드를 O-GlcNAc과 반응시킨 샘플들의 임피던스를 나타내며, 표 2-2는 Thiamet G를 처리한 타우 단백질(0.5pg/ml)과 결합된 마이크로 비드를 AT8과 반응시킨 샘플들의 임피던스를 나타내며, Thiamet G의 농도(0uM, 10uM, 30uM, 100uM)에 따라 임피던스 변화를 측정하여 나타내었다.
표 2-1
Figure 112017083243428-pat00004
표 2-2
Figure 112017083243428-pat00005
하기의 표 3은 표 2-1 및 표 2-2에서 Neg의 임피던스에 대한 BAT와 BAT2 임피던스의 차이(BAT-BAT2 또는 BAT2-BAT) 및 이에 따라 인산화된 타우(P)와 O-글리코실화된 타우(O)에 의한 임피던스 변화의 비율을 나타낸다.
표 3
Figure 112017083243428-pat00006
표 3을 참조하면, Thiamet G의 농도가 증가한 것은, O-글리코실화된 타우의 증가, 즉 인산화된 타우의 감소를 의미하는 것으로 볼 수 있으며, 이를 P/O의 값이 감소하는 것으로부터 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상에서는 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은, 단백질 검출을 통한 질병의 예후, 경과, 치료 반응 등을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 또한 타우병증과 같은 질병의 치료제를 개발하는 플랫폼에 적용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 베이스 비드의 표면에 단백질 항체를 결합하여 제1 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제1 마이크로 비드의 단백질 항체에, 서로 반비례적 관계인 제1 번역후 변형 또는 제2 번역후 변형을 갖는 대상 단백질을 결합하여 제2 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제1 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체와 결합하여 제3 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제2 마이크로 비드를, 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형과 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체와 결합하여 제4 마이크로 비드를 준비하는 단계;
    상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 각각 측정하는 단계;
    상기 제3 마이크로 비드의 임피던스와 기준 임피던스의 제1 차이에 대한, 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스와 상기 기준 임피던스의 제2 차이의 비율을 얻는 단계; 및
    상기 비율을 지표로 이용하여 상기 제1 번역후 변형 또는 상기 제2 번역후 변형의 증감 여부를 판단하는 단계를 포함하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상 단백질은 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베이스 비드는 자성 비드인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 기준 임피던스는, 상기 제1 마이크로 비드의 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 기준 임피던스는, 상기 제2 마이크로 비드의 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계는,
    제1 시점에서, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계;
    상기 제1 시점과 다른 제2 시점에서, 상기 제1 차이에 대한 상기 제2 차이의 비율을 얻는 단계; 및
    상기 제1 시점의 상기 비율과, 상기 제2 시점의 상기 비율을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제3 마이크로 비드 및 상기 제4 마이크로 비드의 임피던스를 측정하는 단계는,
    제1 전극 및 제2 전극 사이에 상기 제3 마이크로 비드 또는 상기 제4 마이크로 비드를 배치하여 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  9. 대상 단백질의 제1 번역후 변형에, 상기 제1 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제1 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제1 번역후 변형 매체를 준비하는 단계;
    상기 제1 번역후 변형과 반비례적 관계에 있는 상기 대상 단백질의 제2 번역후 변형에, 상기 제2 번역후 변형에 선택적으로 결합하는 제2 번역후 변형 항체를 결합시켜, 제2 번역후 변형 매체를 준비하는 단계;
    상기 제1 번역후 변형 및 상기 제2 번역후 변형의 양에 따라 변화하는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제1 번역후 변형 매체의 제1 측정값을 얻는 단계;
    상기 물리적 성질 또는 화학적 성질에 대한, 상기 제2 번역후 변형 매체의 제2 측정값을 얻는 단계;
    상기 제1 측정값과 기준값의 제1 차이에 대한, 상기 제2 측정값과 상기 기준값의 제2 차이의 비율을 얻는 단계; 및
    상기 비율을 지표로 이용하여 상기 제1 번역후 변형 또는 상기 제2 번역후 변형의 증감 여부를 판단하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 번역후 변형은 O-글리코실화된 타우 단백질이고, 상기 제2 번역후 변형은 인산화된 타우 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서, 상기 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 임피던스인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제1 번역후 변형 매체 및 상기 제2 번역후 변형 매체는 각각 형광체 또는 발광체(chemiluminescence)를 포함하며, 제1 측정값 및 상기 제2 측정값은 각각 상기 형광체 또는 발광체의 양에 따른 광학 측정값인 것을 특징으로 하는 단백질의 번역후 변형 모니터링 방법.
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