KR102265379B1 - 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 바이오 센서의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 제공한다. 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템은 제1 전극(140), 간극(G)을 형성하도록 상기 제1 전극(140)과 소정 거리 이격되는 제2 전극(160), 및 상기 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 상기 제1 전극(140)의 일부와 상기 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함하는 측정 단위부(110)를 하나 이상 포함하는 센서(100) 및 상기 제1 전극(140)과 상기 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하는 전원 인가부(220), 상기 센서(100)에 투입되는 적어도 2개의 측정 대상 샘플의 임피던스(Z)를 각각 측정하는 임피던스 측정부(230), 및 상기 임피던스 측정부(230)에 의해 측정된 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(Z)을 연산하는 연산부(240)를 포함하는 제어 장치(200)를 포함할 수 있다.

Description

갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 바이오 센서의 제조 방법{SYSTEM FOR MONITORING POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION OF PROTEIN USING BIO-SENSOR WITH GAP AND MANUFACTUREING METHOD FOR BIO-SENSOR}
본 출원은 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다.
전 세계에서 알츠하이머 환자는 약 4,680만명으로 추산되고, 20년을 주기로 그 숫자가 2배씩 증가할 것으로 예상되어 2050년에는 약 1억 3,150만명이 될 것으로 예상되며, 알츠하이머 관련 소모 비용도 약 2조 달러에 이를 것으로 추산되고 있다.
현재 알츠하이머 질환 치료제는 없으며, 진행 정도를 지연시키는 약물만이 존재하는 실정이다. 따라서, 정확한 진단을 통해 알츠하이머 질환의 진행속도를 파악하고 진행속도를 지연시키는 것이 가장 중요하다.
타우(tau) 단백질의 응집은 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease, AD) 및 여러 신경퇴행성 질환들(타우병증(taupathies)이라 지칭됨)에 있어서 주된 특징으로 알려져 있다. 건강한 신경에서, 타우 단백질은 축색돌기(axon)으로부터의 성장 및 신경 세포 분극화(polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관(microtubules)을 안정화한다. 또한 병리학적으로, 타우 단백질이 과다인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우 단백질은 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성하는 것이 알려져 있다.
알츠하이머 환자들의 뇌에서 비정상적으로 과다인산화된 타우 단백질 및 타우 단백질의 응집체들이 발병원으로서 관찰되며, 타우 단백질의 과다인산화는 일반적으로 타우 단백질의 응집의 원인으로 간주되고 있다.
또한, 최근 연구 결과에 따르면 타우 단백질의 여러 번역 후 변형(Post Translational Modification, PTM) 형태 중 과다인산화와 O-글리코실화(O-glycosylation)되는 것이 서로 반비례 관계에 있다는 것이 밝혀지고 있다.
이렇듯, 타우 단백질의 과다인산화 정도 또는 O-글리코실화 정도를 측정할 수 있다면, 알츠하이머 질환의 진행속도나 예후를 판단할 수 있는 데 이용할 수 있다. 또한, 신약 개발에 의해 그 약효를 검증하는 데에도 이용할 수 있다.
하지만, 타우 단백질뿐만 아니라 질환 진단의 근거되는 물질의 정량적 분석을 통하여서는 그 결과가 질환을 진단할 수 있을 만큼의 상관성을 보여주지 못하고 있다. 이는 환자 개개인의 개체 차이로 인한 것으로 보이며, 정확한 진단을 위해 정량적 분석보다는 다른 분석 방법이 요구되고 있는 실정이다.
한국공개특허공보 10-2013-0091288호 (2013.02.07)
FLEXTau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease(W. Mair et al., Anal. Chem. 2016, 88, 3704-3714)
본 출원은 센서에 투입되는 샘플의 임피던스를 각각 측정하고, 측정된 임피던스의 변화율을 연산하여 임피던스 측정 대상이 되는 단백질과 관련된 질환에 대한 진단을 높은 신뢰도로 수행하는 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 이에 이용되는 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 출원의 일 실시예는, 제1 전극(140), 간극(G)을 형성하도록 상기 제1 전극(140)과 소정 거리 이격되는 제2 전극(160), 및 상기 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 상기 제1 전극(140)의 일부와 상기 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함하는 측정 단위부(110)를 하나 이상 포함하는 센서(100) 및 상기 제1 전극(140)과 상기 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하는 전원 인가부(220), 상기 센서(100)에 투입되는 적어도 2개의 측정 대상 샘플의 임피던스(Z)를 각각 측정하는 임피던스 측정부(230), 및 상기 임피던스 측정부(230)에 의해 측정된 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 연산부(240)를 포함하는 제어 장치(200)를 포함하는, 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 전극(140) 사이와 상기 제2 전극(160) 사이의 간극(G)은 1μm 이하일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은, 마이크로 비드(b) 및 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10)를 포함하는 제1 결합체(S1), 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10) 및 상기 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함하는 제2 결합체(S2) 및 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함하는 제3 결합체(S3)를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은, 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함하는 제4 결합체(S4)를 더 포함하며, 상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위의 양과 상기 제2 변형 부위의 양은 서로 반비례할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 물질의 임피던스(Z)는, 상기 마이크로 비드(b)에 결합된 물질의 양과 종류가 증가할수록 감소할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2이라 할 때, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율은 Z1-Z2/Z1으로 연산될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2, 상기 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3으로 연산될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제어 장치(200)는, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)을 저장하는 데이터베이스(250)를 더 포함하며, 상기 연산부(240)는 제1 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z1)과 상기 제1 시점 이후의 제2 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z2)을 비교함으로써, 비교 결과 데이터를 더 연산할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 마이크로 비드(b)는 자성 비드이고, 상기 자성 비드가 상기 개구(117)를 통해 상기 간극(G)에 놓여지도록 안내하는 자성체(300)를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위는 인산화(phosphorylation)된 부분을 포함하고, 상기 제2 변형 부위는 0-글리코실화(O-glycosylation)된 부분을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 항체(30)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 인산화된 부분에 결합하는 항체이고, 상기 제3 항체(40)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 O-글리코실화된 부분에 결합하는 항체일 수 있다.
또한 본 출원은 기판 상에 제1 금속층을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층 위에 제1 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층을 식각하여, 제1 전극을 형성하고, 상기 제1 포토레지스트 패턴 하부에 언더컷을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층이 제거된 영역 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 제2 금속층을 형성하는 단계, 상기 제1 포토레지스트 패턴 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 배치된 제2 금속층을 제거하는 단계, 상기 제1 전극 및 잔류하는 제2 금속층 위에 제2 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계, 상기 잔류하는 제2 금속층을 식각하여, 상기 제1 전극과 소정 거리 이격된 제2 전극을 형성하는 단계 및 상기 제1 전극의 일부와 상기 제2 전극의 일부를 커버하며, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 간극 위에 개구를 형성하는 유기 절연층을 형성하는 단계를 포함하는, 나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 금속층은, 상기 기판 위에 배치된 무기 절연층 위에 형성될 수 있다.
일 실시예예 있어서, 상기 제1 전극 사이와 상기 제2 전극 사이의 간극은 1μm 이하일 수 있다.
본 출원에 따르면, 서로 반비례 관계를 갖는 타겟 단백질의 번역후 변형 부위에 결합하는 서로 상이한 항체를 이용하여 이들이 결합된 결합체에 대한 임피던스를 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 타겟 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.
특히, 임피던스 변화율 지표를 이용하여 타겟 단백질과 관련된 질환의 위험도, 진행 속도, 정상 질환과의 구별이 명확히 가능함에 따라, 종래 ELISA를 이용하여 타겟 단백질의 정량적 분석을 통해서는 진단이 명확히 이루어지지 않았던 단점을 해결하였다.
또한, 어느 하나의 타겟 단백질에 국한되는 것이 아닌, 서로 반비례 관계에 있는 제1 변형 부위 및 제2 변형 부위를 포함하는 타겟 단백질이면 어느 것이든 적용될 수 있어, 단백질 이상과 관련된 질환의 진단에 포괄적으로 이용할 수 있다는 장점을 갖는다.
또한 서로 반비례 관계를 갖는 번역후 변형 타겟 단백질뿐만 아니라, 하나의 번역후 변형 형태에 대해서도 그 변형 정도를 측정할 수 있어, 단백질 종류와 관계없이 폭넓게 이용이 가능하다는 장점을 갖는다.
도 1은 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 구성을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 도 1의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 도 2의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 단면도이다.
도 4는 임피던스 측정 대상이 되는 물질을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 검증 실험 1에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 검증 실험 2에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 검증 실험 3에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 검증 실험 4에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 검증 실험 5에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 검증 실험 6에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 검증 실험 7에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 임피던스 변화율에 따른 인지 장애 정도의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 13은 검증 실험 8-1에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 검증 실험 8-2에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 검증 실험 8-3에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 검증 실험 8-4에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 검증 실험 8-5에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 18 및 19는 검증 실험 9에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 검증 실험 10에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 출원의 실시예에 따른 나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원을 상세히 설명한다.
1. 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템
도 1 내지 도 4를 참조하여, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 보다 상세히 설명한다.
도 1은 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 구성을 설명하기 위한 개략도이고, 도 2는 도 1의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 도면이며, 도 3은 도 2의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 단면도이고, 도 4는 임피던스 측정 대상이 되는 물질을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템은 센서(100), 제어 장치(200), 자성체(300) 및 디스플레이(400)를 포함한다.
센서(100)는 임피던스 측정 대상 물질이 놓여지는 하나 이상의 단위 측정부(110)를 포함한다.
도 2 및 3을 참조하여, 단위 측정부(110)에 대해 보다 상세히 설명한다. 도 2는 도 1의 센서(100)에서 단위 측정부(110)의 평면도이고, 도 3은 단위 측정부(110)의 단면도이다.
단위 측정부(110)는 기판(120), 기판 위에 배치되는 무기 절연층(130), 무기 절연층(130) 위에 각각 배치되며 간극(G)을 형성하도록 서로 소정 거리 이격되어 배치되는 제1 전극(140) 및 제2 전극(160), 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 제1 전극(140)의 일부와 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함한다.
여기서, 기판(120)은 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등과 같은 절연 물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 기판(120)은 투명한 물질로 형성될 수 있으며 이 경우 마이크로 비드(b)가 배치되는 지 여부를 광학적으로 확인할 수 있다는 장점을 갖는다.
제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에는 측정 대상 물질이 놓여진다.
도 4를 참조하여, 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 눈물, 콧물, 척수액 등과 같은 샘플 내에 존재하는 타겟 단백질(20)의 임피던스를 측정하여 번역후 변형 정도를 측정하기 위해, 제1 결합체(S1), 제2 결합체(S2), 제3 결합체(S3) 및 제4 결합체(S4)가 간극(G)에 놓여질 수 있다.
제1 결합체(S1)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10)를 포함한다.
여기서, 마이크로 비드(b)는 금속, 고분자 등으로 이루어진 자성 비드일 수 있다. 예를 들어, 마이크로 비드(b)의 직경은 1μm 내지 5μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 검출하고자 하는 대상에 따라 10μm 이상의 것이 사용될 수도 있다.
제1 항체(10)는 타겟 단백질(20)과 결합이 가능한 항체로서, 마이크로 비드(b)는 제1 항체(10)가 결합될 수 있도록 토실레이트 처리되거나, 아민처리되거나, 카르복실기가 처리될 수 있다. 여기서, 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질일 수 있으며, 제1 항체(10)는 타우 단백질과 결합할 수 있는 항체일 수 있으며, 보다 구체적으로는 타겟 단백질(20)의 번역후 변형 부위가 아닌 부위(공통 부위)에 결합하는 것일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않고 타겟 단백질(20)에서 번역후 변형부위가 2개 이상 존재하고, 어느 하나의 번역후 변형 부위의 양과 다른 하나의 번역후 변형 부위의 양이 서로 반비례(즉, 어느 하나의 번역후 변형 부위의 양이 증가하는 경우 다른 하나의 번역후 변형 부위의 양이 감소하는 관계)하는 관계에 있는 타겟 단백질이면 어느 것이든 적용될 수 있다.
또한, 번역후 변형 정도가 얼마나 이루어졌는지 측정하기 위해, 타겟 단백질(20)은 번역후 변형 부위가 하나 이상 존재하는 형태의 단백질이고, 하나 이상의 번역후 변형 중 어느 하나의 변형만을 측정하는 것도 얼마든지 가능하다.
제2 결합체(S2)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함한다.
제3 결합체(S3)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20) 및 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함한다.
여기서, 제1 변형 부위는 타겟 단백질(20)의 인산화(phosphorylation)된 부분일 수 있으며, 제2 항체(20)는 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합되는 Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8) MN1020(Thermo Fisher), Anti-Tau(phosphor S396) antibody [EPR2731]/ab109390(abcam), Phospho-Tau(ser202_ Antibody, #11834)(Cell signaling), Phospho-Tau(ser396) (PHF13) Mouse mAb, #9632(Cell signaling) 중 어느 하나일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않으며 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합될 수 있는 항체이면 어느 것이든 이에 해당한다고 할 것이다.
제4 결합체(S4)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20) 및 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함한다.
여기서, 제2 변형 부위는 타겟 단백질(20)의 O-글리코실화(O-glycosylation)된 부분일 수 있으며, 제3 항체(30)는 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합되는 항체로서, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875(Cell signaling)일 수 있다.
상술한 측정 대상 물질이 놓여지는 간극(G)은 마이크로 비드(b)가 놓여지기 위해 마이크로 비드(b)의 직경보다는 작은 것이 바람직하며, 그 수치는 1μm 이하일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않고 임피던스 측정을 위해 적용되는 마이크로 비드(b)에 따라 그 이상의 수치를 가질 수도 있다.
마이크로 비드(b)는 개구(117)를 통하여 간극(G)에 놓여질 수 있는데, 개구(117)의 직경은 마이크로 비드(b)의 직경보다는 크고 마이크로 비드(b) 직경의 2배보다는 작은 것이 바람직하다. 이를 통하여 하나의 개구(117)마다 하나의 마이크로 비드(b)가 투입되는 것이 보다 효율적으로 이루어질 수 있다(검증 실험 1 참조).
제1 전극(140)과 제2 전극(160)은 전원 인가부(220)에 전기적으로 연결된다.
전원 인가부(220)는 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하게 된다. 구체적으로, 전원 인가부(200)는 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이에 50mVsin(w)의 교류 전압을 인가할 수 있다. 즉, 간극(G)에 측정 대상 물질이 놓여짐에 따라, 제1 전극(140), 제2 전극(160), 전원 인가부(220) 및 측정 대상 물질이 서로 전기적으로 연결되어 하나의 전기 회로를 형성할 수 있는 것이며, 이 전기 회로에 흐르는 전류 또는 전압을 측정하여 측정 대상 물질의 임피던스(Z)를 측정할 수 있는 것이다. 다시 말하면, 마이크로 비드(b)를 포함하는 측정 대상 물질이 개구(117)를 통해 투입되어 간극(G)에 놓여져, 센서(100)에 전압을 인가함으로써 기 설정된 방법에 의하여 연산되는 전기화학적 임피던스(electrochemical impedance)를 측정하게 되는 것이다.
도 1을 참조하여, 센서(100)에 대해 다시 설명한다.
센서(100)는 전술한 단위 측정부(110)를 복수 개 포함하며, 각각의 단위 측정부(110)는 전원 인가부(200)에 의해 기 설정된 전압이 인가되는 제1 종방향 메인 전선(111) 및 제2 종방향 메인 전선(114)에 연결된다.
제1 종방향 메인 전선(111)과 제2 종방향 메인 전선(114)은 센서(100)의 y축과 평행할 수 있다.
제1 종방향 메인 전선(111)은, 제1 종방향 메인 전선(111)으로부터 분지되며 센서(100)의 x축 방향과 평행한 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112)과 연결되고, 이 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112)은, 이로부터 다시 분지되어 센서(100)의 y축 방향과 평행한 복수의 제1 종방향 서브 전선(113)과 연결된다. 제1 종방향 서브 전선(113)은 측정 단위부(110)의 제1 전극(140)에 전기적으로 연결된다.
제2 종방향 메인 전선(114)은, 제2 종방향 메인 전선(114)으로부터 분지되며 센서(100)의 x축 방향과 평행한 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115)과 연결되고, 이 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115)은, 이로부터 다시 분지되어 센서(100)의 y축 방향과 평행한 복수의 제2 종방향 서브 전선(116)과 연결된다. 제2 종방향 서브 전선(116)은 측정 단위부(110)의 제2 전극(160)에 전기적으로 연결된다.
즉, 전술한 전선들(111, 112, 113, 114, 115, 116)에 의해 센서(100)에 포함된 모든 측정 단위부(110)의 전극(140, 160)에 전원 인가부(220)에 의한 전압이 인가될 수 있는 것이다.
각각의 측정 단위부(110)에 형성된 개구(117)에 마이크로 비드(b)를 안내하기 위해, 센서(100)의 하부에는 자성체(300)가 구비된다. 자성체(300)는 자성을 지닌 물체로서, 영구자석 또는 전자석 등이 여기에 해당할 수 있다. 이 때, 마이크로 비드(b)는 자성체(300)의 움직임을 통해 인력에 의하여 이동할 수 있는 자성 비드 형태로 구비되는 것이 바람직하다.
제어 장치(200)는 센서(100)에 인가되는 전압의 제어, 간극(G)에 놓여진 측정 대상 물질의 임피던스 측정, 자성체(300)의 구동을 제어하는 부분이다.
도 1을 참조하면, 제어 장치(200)는 구동부(210), 전원 인가부(220), 임피던스 측정부(230), 연산부(240), 데이터베이스(250) 및 진단부(260)를 포함한다.
구동부(210)는 자성체(300)와 전기적으로 연결되어, 자성체(300)의 움직임을 제어하는 부분이다. 구체적으로는, 자성 비드인 마이크로 비드(b)가 개구(117)에 투입될 수 있도록 자성체(300)의 움직임을 제어할 수 있다.
전원 인가부(220)는 이에 전기적으로 연결된 전선들에 기 설정된 전압을 인가하는 부분이다. 구체적으로, 전선들에 기 설정된 전압, 구체적으로 50mVsin(w)의 전압을 인가할 수 있다.
제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 측정 대상 물질이 놓여진 상태에서, 전원 인가부(220)가 전압을 인가하게 되면, 간극(G)에는 전원 인가부(220)에 의해 인가된 만큼의 전압이 인가된다.
임피던스 측정부(230)는 간극(G)에 놓여진 측정 대상 물질의 임피던스(Z)를 측정하는 부분이다. 임피던스 측정 방법으로서, 전원 인가부(220) 및 센서(100)가 서로 전기적으로 연결되어 하나의 전기 회로를 이룬다고 가정하였을 때, 전극(140, 160)에 인가되는 전압의 값을 전기 회로에 흐르는 전류의 값으로 나눈 방법이 적용될 수 있다.
연산부(240)는 임피던스 측정부(230)가 측정한 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 부분이다.
임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 방법으로서, 다양한 방법이 가능하나 일 예로서, 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2, 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때, 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3(taumeter)으로 연산될 수 있다. 이는, 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위의 양과, 제2 변형 부위의 양이 서로 반비례 관계 있다는 점에 착안한 것으로서, 상기 수식은 제1 변형 부위 및 제2 변형 부위의 변화량을 모두 반영함에 따라, 타겟 단백질(20)과 연관된 질환의 진단을 보다 정확히 이룰 수 있다는 장점을 갖게 된다.
데이터베이스(250)는 연산부(240)에 의해 연산된 임피던스 변화율(△Z)이 저장되는 부분이다. 즉, 연산부(240)가 연산한 제1 시점에서의 임피던스 변화율(△Z)이 데이터베이스(250)에 저장되고, 제1 시점 이후의 제2 시점에서 동일 개체로부터 획득한 샘플로부터 다시 임피던스 변화율(△Z)을 연산하여 두 시점의 데이터를 비교하는 것이 가능해진다. 즉, 샘플 획득 시점마다의 데이터가 저장되고 이를 비교함으로써 질환의 진행 속도 등의 지속적인 모니터링이 가능하다.
진단부(260)는 임피던스 변화율(△Z)을 이용하여 임피던스 측정의 대상이 되는 타겟 단백질(20)에 관련된 질환에 대한 위험도, 진행 속도 등의 질환 관련 정보를 연산하는 부분이다. 예를 들어, 임피던스 변화율(△Z)이 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높다고 연산할 수 있으며, 제1 시점과 제2 시점의 임피던스 변화율(△Z)을 비교하여 알츠하이머 질환의 진행 속도를 연산할 수 있다.
디스플레이(400)는 모니터 등으로 구현될 수 있으며, 제어 장치(200)에 의해 연산된 정보들이 출력되는 부분이다.
2. 검증 실험
2-1. 제1 결합체(S1)(마이크로 비드 + 제1 항체)의 준비
토실레이트 처리된 자성 비드(Thermo Fisher, Dynabead M-280, 직경 2.8㎛, 14203)와 타우 단백질 결합 항체(abcam, Anti-Tau(Phosphor S262) antibody, ab64193, 50㎕/250㎕)를 0.1M의 PBS 버퍼에 넣고, 37℃의 인큐베이터 안에 배치한 후, 롤 믹서 위에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 자성 비드를 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA)로 세척하고, 0.2M의 트리스 버퍼로 블록 처리하였다. 상기 자성 비드 용액 30mg/mL를 0.4% Block Ace가 포함된 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20)에 넣어서 보관하였다.
2-2. 제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질)의 준비
5250ng/mL 농도의 타우 단백질을 0.1% PBST를 이용하여, 다양한 농도 (0.5fg/mL ~ 50pg/mL)로 1/10씩 희석하고, 필요에 따라 O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G 처리 또는 O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2로 처리하였다.
상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 300㎕/ml로 희석한 후, 상기 타우 단백질(희석액)과 상기 자성 비드(희석액)를 1:2의 농도로 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
다음으로, 상기 타우 단백질과 결합된 지성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 자성 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
2-3. 제3 결합체(S3)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제2 항체)
2-2와 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 자성 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 자성 비드를, 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합이 가능한 제2 항체(Thermo Fisher, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8), MN1020) 10ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 제2 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
2-4. 제4 결합체(S4)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제3 항체)
2-2와 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 자성 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.
상기 자성 비드를, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합이 가능한 제3 항체(Cell signaling, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875) 10.4ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.
상기 제3 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 자성 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.
2-5. 검증 실험 1
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서, 하나의 개구(117)에 하나의 마이크로 비드(b)가 높은 효율로 투입되도록 하는 직경을 찾기 위해 검증 실험을 실시하였다(도 5).
20 x 20 배열을 갖는 센서(100)에서, 각각의 개구(117)의 직경을 9μm로 형성하여, (a) 2.8μm 직경을 갖는 마이크로 비드(b) (b) 4.5μm 직경을 갖는 마이크로 비드(b)를 투입하여, 각 개구(117)마다 몇 개의 마이크로 비드(b)가 투입되는지를 카운팅하였다.
실험 결과, (a)의 경우 개구(117)에 투입되는 마이크로 비드(b)의 분포가 일정하지 않았으나, (b)의 경우 하나의 개구(117)에 3개 이상의 마이크로 비드(b)가 투입되는 것이 관찰되지 않았으며, 높은 확률로 각각의 개구(117)마다 하나의 마이크로 비드(b)가 투입될 수 있음을 확인하였다.
검증 실험 1을 통하여, 개구(117)의 직경은 마이크로 비드(b)의 직경보다는 크되, 마이크로 비드(b)의 직경의 2배 이하인 것임 바람직함을 확인하였다.
2-6. 검증 실험 2
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서 마이크로 비드(b)에 물질들이 더 결합됨에 따라 측정되는 임피던스(Z)의 경향을 알아보고자 검증 실험을 실시하였다(도 6).
제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 배치되는 측정 대상 물질이 (a) 마이크로 비드(b) (b) 제1 결합체(S1)(마이크로 비드 + 제1 항체) (c) 제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질) 및 (d) 제3 결합체(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제2 항체) 또는 제4 결합체(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제3 항체)인 경우를 비교하여 임피던스를 측정하였다.
임피던스 측정 결과, (a)에서 (d)로 갈수록, 즉, 마이크로 비드(b)에 제1 항체(10), 타겟 단백질(20), 제2 항체(30) 및 제3 항체(40) 등이 더 결합될수록 측정되는 임피던스의 값이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
2-7. 검증 실험 3
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서 타겟 단백질(20)의 검출 한계를 검증하기 위해 검증 실험을 실시하였다(도 7).
센서(100)에 투입되는 샘플에 포함되는 타우 단백질의 농도를 0.5fg/ml, 5fg/ml, 50fg/ml. 500fg/ml, 5pg/ml, 50pg/ml로 조절하면서 50mVsin(w) 전압을 인가하고, 1Hz, 10Hz, 100Hz의 주파수에서 임피던스(Z)를 측정하였다.
임피던스(Z) 측정 결과, 도 7과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
PBS의 경우 마이크로 비드(b)를 포함하지 않은 PBS 용액만이 센서(100)에 투입된 경우를 의미하며, Neg의 경우 제1 결합체(S1)를 포함하는 PBS 용액이 센서(100)에 투입되었으나 타우 단백질이 투입되지 않은 경우를 의미한다.
실험 결과, 타우 단백질의 농도가 높을수록, 즉 제1 결합체(S1)에 결합하는 타우 단백질이 많아질수록 임피던스(Z)가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Neg의 경우 측정되는 임피던스를 ZNeg라고 하고, 실제 측정된 임피던스를 Z라고 할 때 △Z=ZNeg-Z/ZNeg x 100(%)로 정의되는 임피던스 변화율(△Z)을 연산하였을 때, 샘플에 포함된 타우 단백질의 농도가 0.5fg/ml 이더라도 유의미한 임피던스 변화율(△Z)이 나타남을 확인하였다.
즉, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 검출 한계는 0.5fg/ml임을 확인하였으며, 이는 종래 단백질 검출에 이용되는 ELISA(Enzyme Linked Immunospecific Assay) 방법과 Digital ELISA(quantarix)에서의 검출 한계가 각각 10pg/ml, 19fg/ml인 점과 비교하였을 때, 적은 농도의 샘플이 투입되더라도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
2-8. 검증 실험 4
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질의 유무에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.
제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타우 단백질)을 포함하는 샘플과, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합이 가능한 항체(제3 항체, O-g Antibody)를 센서(100)에 투입하였으며, 타우 단백질의 농도를 각각 0.5fg/ml, 5.24fg/ml, 52.4fg/ml, 524fg/ml로 조절하면서 각각의 경우마다 (a) O-GlcNAcase를 저해하는 물질인 Thiamet G 100μM 처리 및 (b) Thiamet G 미처리한 경우 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.
임피던스(Z) 측정은, 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때, 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때 각각의 임피던스를 측정하는 방식으로 이루어졌다.
실험 결과, 도 8과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
Thiamet G를 처리하여 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 감소를 억제하는 경우, 처리하지 않을 때보다 임피던스의 차이(Z1-Z3)가 커짐을 확인하였으며, 타우 단백질의 농도가 높아질수록 임피던스의 차이(Z1-Z3)가 증가함을 확인할 수 있었고, 특히 0.5fg/ml의 낮은 농도에서도 임피던스 차이가 유의미한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2-9. 검증 실험 5
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질과 촉진하는 물질의 처리에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.
제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타우 단백질)을 포함하는 샘플과, 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합이 가능한 항체(제2 항체, AT-8 Antibody)를 센서(100)에 투입하였으며, 타우 단백질의 농도를 각각 0.5fg/ml, 5fg/ml, 50fg/ml, 500fg/ml로 조절하면서 각각의 경우마다 (a) O-GlcNAcase를 저해하는 물질인 Thiamet G 100μM 처리 및 (b) O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2 100μM 처리한 경우 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.
임피던스(Z) 측정은, 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때, 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때 각각의 임피던스를 측정하는 방식으로 이루어졌다.
실험 결과, 도 9와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 양이 감소할수록, 타우 단백질의 인산화된 부분의 양이 증가하는 반비례 관계 때문에, (b)에서 BZX2를 처리하였을 때 제3 결합체(S3)의 양이 증가하여, 타우 단백질의 농도가 높아질수록 임피던스의 차이(Z1- Z2)가 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 0.5fg/ml의 낮은 농도에서도 임피던스 차이가 유의미한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2-10. 검증 실험 6
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질의 유무에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.
센서(100)에 (a) 타우 단백질 5pg/ml 투입 (b) 타우 단백질 5pg/ml + 제2 항체(AT-8 Antibody) 투입 및 (c) 타우 단백질 5pg/ml + 제3 항체(O-g Antibody) 를 각각 투입하였고, 각 경우를 PBS, Neg, Thiamet G 미처리, Thiamet G 100μM 처리한 샘플에 투입하여, 임피던스(Z)를 측정하였다.
실험 결과, 도 10과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G를 처리함에 따라, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분이 증가하여, (c) 제3 항체(O-g Antibody)를 투입함에 따라 측정되는 임피던스(Z3)가 38.27MΩ에서 35.0MΩ로 감소함을 확인하였고, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 증가에 따라 타우 단백질의 인산화된 부분이 감소하여 (b) 제2 항체(AT-8 Antibody)를 투입함에 따라 측정되는 임피던스(Z2)가 33.65MΩ에서 37.65MΩ로 증가함을 확인하였다.
즉, 검증 실험 6을 통해 서로 반비례 관계에 있는 제1 변형 부위와 제2 변형 부위에 대한 임피던스(Z) 측정 결과가 어느 한쪽이 증가하는 경우 다른 한쪽이 감소하는 일정한 경향성을 나타내는 것을 검증하였다.
2-11. 검증 실험 7
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 개체(Control)와 알츠하이머 질환을 갖는 개체(Patient)에서 샘플을 채취하여 임피던스(Z)를 측정하였다.
센서(100)에 (a) 샘플 투입 (b) 샘플 + 제2 항체(AT-8 Antibody) 투입 및 (c) 샘플 + 제3 항체(O-g Antibody)를 투입하여 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.
실험 결과 도 11과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
알츠하이머 환자(Patient)의 경우, 정상인(Control)보다 샘플에 포함된 인산화 타우 단백질의 비율이 높기 때문에, (b)에서 측정된 임피던스(Z2)가 정상인(Control)보다 더 낮게 측정됨을 확인하였다.
반대로 말하면, 알츠하이머 환자(Patient)의 경우 정상인(Control)보다 샘플에 포함된 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 비율이 낮기 때문에, (c)에서 측정된 임피던스(Z3)가 정상인(Control)보다 더 높게 측정됨을 확인하였다.
또한, 샘플만을 센서(100)에 투입하였을 때 측정되는 임피던스(Z1)를 이용하여, △Z=Z1-Z2/Z1-Z3로 연산되는 임피던스 변화율을 연산한 결과, 알츠하이머 환자(Patient)에서 더 높은 임피던스 변화율을 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 12에 나타난 바와 같이 연산된 임피던스 변화율(△Z)을 이용하여 알츠하이머 질환의 진단, 진행 경과 관찰, 진행 속도의 관찰이 가능함을 입증하였다.
2-12. 검증 실험 8
본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 사용하여 실제로 알츠하이머 질환 진단에 이용할 수 있는지 검증하기 위해 실험을 실시하였다.
2-12-1. 세포 용해(Cell Lysis )(검증 실험 8-1)
세포를 용해한 후, 용출되는 타우 단백질을 5pg/ml 농도로 센서(100)에 투입하고, 센서(100)에 추가로 투입되는 물질이 (a) 없는 경우 (b) O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G 100μM 처리 (c) O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2를 100μM 처리한 경우에서 각각의 임피던스(Z)를 측정하고, 각각의 임피던스 변화율을 연산하였다.
실험 결과, (a)에서 측정되는 임피던스(Z1)는 거의 변화가 없었으나, 타우 단백질의 인산화된 부분의 증감에 따라 임피던스 변화율의 변화가 뚜렷이 나타났으며, 임피던스 변화율의 연산을 통하여 타우 단백질의 인산화된 부분과 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 증감을 모니터링할 수 있다는 점을 검증하였다(도 13).
2-12-2. 마우스 뇌 용해(Mouse Brain lysis )(검증 실험 8-2)
야생형(Wild Type, WT) 마우스 1마리(전체 타우 단백질 농도 0.4μg/ml)와 알츠하이머 질환 유전자변형(Transgenic, TG) 마우스 2마리(전체 타우 단백질 농도 9.8μg/ml, 20.1μg/ml)를 이용하여, 마우스의 뇌를 용해하고, 그 추출물을 추출하였으며, 전체 타우 단백질 농도가 4pg/ml가 되도록 PBS 용액으로 희석하였다.
각각의 샘플을 센서(100)에 투입하고, 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.
실험 결과, 임피던스 변화율을 통해 야생형(WT)과 유전자변형(TG) 마우스의 구별이 가능하다는 것을 검증하였으며, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 개체와 질환 개체의 구분이 가능함을 입증하였다(도 14).
2-12-3. 마우스 혈액(검증 실험 8-3)
3개월 야생형(WT) 마우스(전체 타우 단백질 농도 140.8pg/ml), 12개월 야생형(WT) 마우스(전체 타우 단백질 농도 193.8pg/ml), 3개월 유전자변형(TG) 마우스(전체 타우 단백질 농도 196.8pg/ml), 12개월 유전자변형(TG) 마우스(전체 타우 단백질 농도 188.0pg/ml)를 이용하여, 각각의 마우스로부터 혈액을 채취하고 PBS 용액을 사용하여 전체 타우 단백질 농도가 각각 14.08pg/ml, 19.38pg/ml, 19.68pg/ml, 18.80pg/ml가 되도록 희석하였다.
각각의 샘플을 센서(100)에 투입하고, 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.
실험 결과, 야생형(WT)의 경우 3개월과 12개월 마우스의 임피던스 변화율이 거의 차이가 없었으나, 유전자변형(TG)의 경우 유의미한 임피던스 변화율 차이가 있음을 확인하였다.
실험 결과, 임피던스 변화율을 통해 야생형(WT)과 유전자변형(TG) 마우스의 구별이 가능하다는 것을 검증하였으며, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 마우스와 알츠하이머 질환을 갖는 마우스의 구분이 가능함을 입증하였다(도 15).
2-12-4. 인간 혈액(정상 인간 개체 vs 경도인지장애 인간 개체)(검증 실험 8-4)
정상 인간 개체와 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)를 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하고, 이를 센서(100)에 투입하여 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.
실험 결과, 도 16과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
정상 인간 개체(Taumeter: 0.4468, Taumeter=타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율/타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율)에 비해, 경도인지장애를 갖는 인간 개체(Taumeter: 1.5926)에서 더 높은 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험 결과, Taumeter의 연산을 통해 정상 인간 개체와 경도인지장애를 갖는 인간 개체의 구별이 가능하다는 것을 검증하였다.
2-12-5. 인간 혈액(정상 인간 개체 vs 알츠하이머 질환 인간 개체)(검증 실험 8-5)
정상 인간 개체와 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하고, 이를 센서(100)에 투입하여 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.
실험 결과, 도 17과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
정상 인간 개체(Taumeter: 0.4364, Taumeter=타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율/타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율)에 비해, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체(Taumeter: 6.8571)에서 더 높은 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험 결과, Taumeter의 연산을 통해 정상 인간 개체와 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 가능하다는 것을 검증하였다.
2-13. 검증 실험 9
정상 인간 개체, 경도인지장애 인간 개체, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하여 (a) ELISA, 본 출원의 실시예에 따른 센서(100)를 이용하여 (b) 임피던스 변화(Z1-Z2, Z1-Z3), (c) Taumeter 연산하는 방법으로 실험을 진행하였다.
실험 결과, 정상, 경도인지장애, 알츠하이머 질환 유무에 관계 없이 전체 타우 단백질의 임피던스(Z1)는 거의 변화가 없었고, (a) ELISA를 이용한 타우 단백질의 농도를 측정하는 방법 또한 정상 인간 개체와 다른 개체의 구별이 어려움을 확인할 수 있었다. 하지만 (b) 임피던스 변화 및 (c) Taumeter를 이용한 경우 정상 인간 개체와 경도인지장애 인간 개체, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 명확함을 확인할 수 있었다.
실험 결과, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하는 경우 정상 인간 개체와 경도인지장애 인간 개체, 그리고 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 명확하게 이루어질 수 있음을 확인할 수 있었다(도 18 및 19).
2-14. 검증 실험 10
타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1)과, 타우 단백질의 인산화된 부분 및 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1-Z3) 값의 민감성(Sensitivity) 및 특이성(Specificity)을 확인하였다.
실험 결과, 타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율을 이용(민감성 84.6%, 특이성 81.8%)하였을 때보다 타우 단백질의 인산화된 부분 및 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1-Z3)을 이용(민감성 92.3%, 특이성 90.9%)하였을 때 보다 높은 정확도로 알츠하이머 질환을 진단할 수 있다는 점을 검증하였다(도 20).
3. 갭을 갖는 바이오 센서의 제조 방법
도 21(a) 내지 21(g)는 본 출원의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링을 위한 시스템의 센서(100)의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.
도 21(a)를 참조하면, 기판(120) 위에 무기 절연층(130)을 형성한다. 상기 무기 절연층(130) 위에 제1 금속층(140)을 형성한다. 상기 제1 금속층(140) 위에 제1 포토레지스트 패턴(150)을 형성한다.
예를 들어, 상기 기판(120)은, 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 무기 절연층(130)은, 실리콘 산화물, 실리콘 질화물 등의 절연 물질을 포함할 수 있다.
상기 제1 금속층(140)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 금속층(140)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
상기 제1 포토레지스트 패턴(150)은 상기 제1 금속층(140)을 부분적으로 커버하여, 상기 제1 금속층(140)의 상면을 부분적으로 노출시킨다.
도 21(b)를 참조하면, 상기 제1 금속층(140)을 식각하여, 제1 전극(140)을 형성한다. 상기 식각은, 습식 식각에 의한 등방성 식각으로 이루어진다. 따라서, 상기 제1 전극(140)은, 제1 포토레지스트 패턴(150)에 대하여 언더컷을 형성한다.
도 21(c)를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(150) 및 상기 무기 절연층(130)의 노출된 상면 위에 제2 금속층(160)을 형성한다. 상기 제2 금속층(160)은 스퍼터링, 원자빔증착 등과 같은 증착에 의해 형성될 수 있으며, 언더컷이 형성된 상기 제1 포토레지스트 패턴(150)의 아래에는 형성되지 않는다.
상기 제2 금속층(160)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제2 금속층(160)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.
도 21(d)를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(150) 및 그 위에 배치된 상기 제2 금속층(160)을 제거한다. 따라서, 상기 제1 전극(140)과 잔류하는 제2 금속층(160) 사이에는 간극(G)이 형성될 수 있다. 상기 나노 갭은, 포토리소그라피 공정의 노광 후, 마스크를 이용한 식각에 의해 형성되지 않고, 언더컷 형성 후 리프트 오프에 의해 형성되므로, 포토리소그라피의 critical dimension의 한계 보다 작아질 수 있으며, 웨이퍼 레벨의 대면적 공정이 가능하다.
도 21(e)를 참조하면, 상기 제1 전극(140) 및 잔류 제2 금속층(160) 위에 제2 포토레지스트 패턴(170)을 형성한다. 상기 제2 포토레지스트 패턴(170)은 상기 간극(G)을 커버하고, 상기 제2 금속층(160)을 부분적으로 노출할 수 있다.
도 21(f)를 참조하면, 상기 제2 포토레지스트 패턴(170)을 마스크로 이용하여, 상기 잔류 제2 금속층(160)을 식각하여, 제2 전극(160)을 형성한다.
도 21(g)를 참조하면, 상기 제1 전극(140) 및 상기 제2 전극(160) 위에 유기 절연층(180)을 형성한다. 상기 유기 절연층(180)은 상기 간극(G)을 노출하는 개구(117)를 형성할 수 있다.
이상, 본 명세서에는 본 출원을 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 도면에 도시한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당업자라면 본 출원의 실시예로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 출원의 보호범위는 청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
10: 제1 항체
20: 타겟 단백질
30: 제2 항체
40: 제3 항체
100: 센서
110: 측정 단위부
111: 제1 종방향 메인 전선
112: 제1 횡방향 메인 전선
113: 제1 종방향 서브 전선
114: 제2 종방향 메인 전선
115: 제2 횡방향 메인 전선
116: 제2 종방향 서브 전선
117: 개구
120: 기판
130: 무기 절연층
140: 제1 전극
150: 제1 포토레지스트 패턴
160: 제2 전극
170: 제2 포토레지스트 패턴
180: 유기 절연층
200: 제어 장치
210: 구동부
220: 전원 인가부
230: 임피던스 측정부
240: 연산부
250: 데이터베이스
260: 진단부
300: 자성체
400: 디스플레이
b: 마이크로 비드
S1: 제1 결합체
S2: 제2 결합체
S3: 제3 결합체
S4: 제4 결합체

Claims (15)

  1. 제1 전극(140), 1μm 이하의 간극(G)을 형성하도록 상기 제1 전극(140)과 소정 거리 이격되는 제2 전극(160), 및 상기 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 상기 제1 전극(140)의 일부와 상기 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함하는 측정 단위부(110)를 복수개 포함하는 센서(100); 및
    상기 제1 전극(140)과 상기 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하는 전원 인가부(220), 상기 전원 인가부(220)에서 인가되는 상기 기 설정된 전압의 값과, 상기 기 설정된 전압 인가에 따라 측정되는 전류의 값을 이용하여 상기 센서(100)에 투입되는 적어도 2개의 측정 대상 샘플의 임피던스(Z)를 각각 측정하는 임피던스 측정부(230), 및 상기 임피던스 측정부(230)에 의해 측정된 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 연산부(240)를 포함하는 제어 장치(200); 및
    상기 간극(G)에 마이크로 비드(b)를 포함하는 측정 대상 물질이 놓여지도록 상기 마이크로 비드(b)를 이동시키는 자성체(300);를 포함하며,
    상기 센서(100)는,
    상기 전원 인가부(220)의 일측에 연결되는 제1 종방향 메인 전선(111), 상기 제1 종방향 메인 전선(111)으로부터 분기되는 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112), 일측이 상기 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112)으로부터 분기되고 타측이 상기 제1 전극(140)에 전기적으로 연결되는 복수의 제1 종방향 서브 전선(113); 및
    상기 전원 인가부(220)의 타측에 연결되는 제2 종방향 메인 전선(114), 상기 제2 종방향 메인 전선(114)으로부터 분기되는 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115), 일측이 상기 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115)으로부터 분기되고 타측이 상기 제2 전극(160)에 전기적으로 연결되는 복수의 제2 종방향 서브 전선(116)을 더 포함하며,
    상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은,
    마이크로 비드(b) 및 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10)를 포함하는 제1 결합체(S1);
    상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10) 및 상기 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함하는 제2 결합체(S2);
    상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함하는 제3 결합체(S3); 및
    상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함하는 제4 결합체(S4);를 포함하되, 상기 개구(117)의 직경은 상기 간극(G)보다 크고 상기 마이크로 비드(b)의 직경의 2배이며,
    상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1,
    상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2,
    상기 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때,
    상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3으로 연산되고,
    상기 마이크로 비드(b)는 자성 비드이고, 상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위의 양과 상기 제2 변형 부위의 양은 서로 반비례하는,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간극(G)에 놓여지는 물질의 임피던스(Z)는,
    상기 마이크로 비드(b)에 결합된 물질의 양과 종류가 증가할수록 감소하는,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제어 장치(200)는, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)을 저장하는 데이터베이스(250)를 더 포함하며,
    상기 연산부(240)는 제1 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z1)과 상기 제1 시점 이후의 제2 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z2)을 비교함으로써, 비교 결과 데이터를 더 연산하는,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질인,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위는 인산화(phosphorylation)된 부분을 포함하고, 상기 제2 변형 부위는 0-글리코실화(O-glycosylation)된 부분을 포함하는,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제2 항체(30)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 인산화된 부분에 결합하는 항체이고,
    상기 제3 항체(40)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 O-글리코실화된 부분에 결합하는 항체인,
    단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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