KR20170125198A - 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 - Google Patents

뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커에 관한 것으로서, Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커; Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트; 검체의 Cav-1 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법; 및 Cav-1 단백질을 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물로써, 뇌-혈관 문맥 손상을 조기 발견, 치료할 수 있고, 뇌-혈관 문맥 손상으로 인한 질병을 치료할 수 있으며, 검체로 혈액 등을 이용하므로 검체의 채취가 용이하고, 환자에게 위해가 없으며, 진단 결과를 보다 시술 전 신속히 알 수 있는 장점이 있는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 및 그를 이용한 진단 키트와 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 {Biomarker to evaluate for blood-brain barrier(BBB) breakdown}
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 및 그를 이용한 진단 키트와 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중은 전 세계적으로 죽음과 장애를 초래하는 질환 중의 하나이다. 비록 허혈 손상의 세포 메커니즘을 목표로 한 연구가 해당 분야에서 주로 이루어지고 있으나, 일반적으로 세포 사멸은 뇌졸중의 급성기 시기에 환자의 죽음을 직접 초래하지는 않는다. 오히려, 뇌경색으로 사망하는 환자의 주요 원인은 허혈 후 발생하는 뇌부종과 출혈성 변환(hemorrhagic transformation(HT))이다. 뇌부종은 질량 효과 (Toni D, Fiorelli M, Bastianello S, Sacchetti ML, Argentino C, et al. Progressing neurological deficit secondary to acute ischemic stroke. A study on predictability, pathogenesis, and prognosis. Arch Neurol. 1995;52:670-675)를 통해서 허혈성 뇌졸중의 병변 확장과 임상적 악화 (clinical deterioration)를 야기한다. 출혈성 변환은 뇌경색의 대표적인 합병증 중의 하나로 뇌경색의 중요한 치료인 혈전 용해제나 항혈전제 사용에 제한을 초래하고, 때로는 증상의 급격한 악화와 사망에 이르게 한다.
혈관성 뇌부종과 출혈성 변환 모두 뇌-혈관 문맥 (Blood Brain Barrier(BBB)) 손상이 근본적인 원인이다. 따라서 뇌-혈관 문맥의 손상을 조절하는 것은 뇌경색을 효과적으로 치료하기 위한 매력적인 목표가 될 수 있다. 뇌경색을 일으키는 근본적인 원인인 BBB 파괴에 대한 분자수준의 메커니즘을 이해하는 것은 잠재적으로 뇌졸중의 치료와 예후 예측에 큰 도움을 줄 수 있다. 따라서 뇌경색 분야에서 중요한 연구 방향 중의 하나는 뇌 손상과 뇌부종을 치료할 수 있는 BBB의 보호와 조절 전략을 알아내는 것이다.
이러한 관점에 비추어 Cav (Caveolin, 카베올린) 단백질이 조명되고 있으며, 최근 카베올라 (caveolar)를 이루는 주요한 구성 요소인 Cav이 혈관 투과성의 중요한 조절자일 수 있다는 점이 밝혀졌다. [Schbert W, Frank PG, Woodman SE, Hyogo H, Cohen DE, Chow CW, et al. Microvascular hyperpermeability in caveoolin-1 (-/-)knock-out mice. Treatment with a specific nitric-oxide synthase inhibitor, 1-name, restores normal microvascular permeability in cav-1 null mice. J Biol Chem. 2002;277:40091-40098]
Cav는 막내재성 단백질로서 카베올라 (caveolae)의 구조적인 구성요소이며 카베올라 형성에 필수적이다. Cav는 카베올린 스케폴드 도메인 (caveolin scaffold domain (CSD))을 통해 물리적으로 많은 수의 다른 단백질과 상호작용하며, 질산화 산소 합성효소 (nitric oxide synthase (NOS)), MMPs, 아쿠아포린 (auaporin) 및 내피 성장 인자 (EGF) 수용기는 카베올린 결합 부분(binding site)을 가지고 있는 단백질이다. Cav는 막에서 시작된 세포 간 신호 전달 (signaling)과 카베올린이 매개된 양쪽성 신호 도입 조절을 도와준다. Cav-1은 cav의 한 종류이다.
그러나 뇌 손상과 관련하여, Cav-1의 역할과 BBB 기능장애와 관련하여 논란이 많다. 예로서, Cav-1 유전자의 제거는 중대뇌동맥 폐색증 허혈성 손상 (middle cerebral artery occlusion (MCAO))의 정도를 증가시키나, Cav-1 유전자 결핍은 뇌 내출혈 후 초기 뇌 손상을 줄여주고, 뇌실하 영역 (subventricular zone)에서 신경 섬유 세포의 증식을 증가시킨다. 또한, BBB 투과성과 관련하여, Cav-1 발현억제 (silencing)는 뇌혈관의 내피세포(cerebrovascular endothelial cells (CECs))와 Cav-1 결핍 (knockout (KO)) 쥐에서 TJ 단백질 발현의 하향 조절과 MMP (Matrix metallopeptidase) 발현 및 BBB 투과성을 증가시키는 것으로 나타났다. 반대로, 대뇌 피질 한랭손상 쥐 모델과 티아민 결핍 (thiamine deficient (TD)) 쥐에서, Cav-1 상향 조절은 뇌혈관 내피 세포(CECs)에서 TJ 단백질의 저하와 BBB 파괴를 줄여준다. 아직까지 허혈성 뇌 손상 이후 발생하는 뇌부종에서 Cav-1의 유전자가 결핍되고 재 발현되는 쥐에서 Cav-1의 직접적인 역할은 밝혀지지 않았다.
공개특허공보 제10-2013-00499668호 (2013.05.14.)
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상을 진단할 수 있는 마커의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상을 검출하기 위한 진단용 키트의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물의 제공을 목적으로 한다.
1. Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
2. 위 1에 있어서, 상기 뇌-혈관 문맥 손상은 뇌동맥 폐색 또는 허혈에 의한 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
3. 위 1에 있어서, MMP-9 및 밀착연접 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
4. 위 3에 있어서, 상기 밀착연접 단백질은 claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
5. Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
6. 위 5에 있어서, MMP-9, claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질을 검출하기 위한 시약을 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
7. 위 5에 있어서, 상기 Cav-1 mRNA 검출 시약은 상기 Cav-1 mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
8. 위 5에 있어서, 상기 Cav-1 단백질 검출 시약은 상기 CAV-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
9. 위 6에 있어서, 상기 MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA 검출 시약은 각각 상기 MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
10. 위 6에 있어서, 상기 MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 또는 JAM-A 단백질 검출 시약은 각각 상기 MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 단백질 또는 JAM-A 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
11. 검체의 Cav-1 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법.
12. 위 11에 있어서, 검체의 MMP-9, claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법.
13. Cav-1 유전자를 포함하는 플라스미드, Cav-1 단백질 및 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물.
본 발명에 따르면, 뇌-혈관 문맥 손상을 조기 발견할 수 있다.
본 발명에 따르면, 뇌-혈관 문맥 손상을 치료할 수 있다.
본 발명에 따르면, 뇌-혈관 문맥 손상으로 인한 질병을 치료할 수 있다.
본 발명은 검체로 혈액 등을 이용하므로 검체의 채취가 용이하고, 환자에게 위해가 없으며, 진단 결과를 보다 시술 전 신속히 알 수 있는 장점이 있다.
도 1은 광혈전증 모델 쥐에서 측정된 CAV-1 발현량을 나타낸 것이다.
도 2는 광혈전증의 쥐 모델에서 Cav-1의 발현을 나타내는 것이다.
도 3은 EB 염색한 Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 ReCav-1 쥐의 뇌 조직을 나타내는 것이다.
도 4은 Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 ReCav-1 쥐의 뇌에서 cy5.5를 사용하는 적외선 광학 영상의 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 5는 광혈전증의 쥐 모델에서 TJ 단백질의 발현을 나타낸다.
도 6은 Matrix metallopeptidase 9 (MMP-9)의 젤라틴 자이모그래피 (Gelatin zymography)분석을 나타낸다.
본 발명은 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커에 관한 것으로서, Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커; Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트; 검체의 Cav-1 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법; 및 Cav-1 단백질을 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물로써, 뇌-혈관 문맥 손상을 조기 발견, 치료할 수 있고, 뇌-혈관 문맥 손상으로 인한 질병을 치료할 수 있으며, 검체로 혈액 등을 이용하므로 검체의 채취가 용이하고, 환자에게 위해가 없으며, 진단 결과를 보다 시술 전 신속히 알 수 있는 장점이 있는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커 및 그를 이용한 진단 키트와 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커이다.
Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질은 뇌-혈관 문맥 손상 시 발현이 증가하므로, Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질은 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커로서 유용하다.
뇌-혈관 문맥 (blood brain barrier)은 뇌척수액과 혈액을 분리시키는 장벽으로 높은 선택적 투과성을 갖고 있다. 뇌 모세혈관의 내피세포는 성상교세포의 발돌기로부터 분비되는 물질에 의해 밀착연접을 형성하여 세포간 용질의 이동을 방해함으로써 고분자와 친수성 물질의 통과를 막는다. 뇌-혈관 문맥의 손상은 선택적 투과성을 떨어뜨리고, 친수성 물질의 통과 등으로 뇌출혈이나 뇌염증의 위험성을 증가시킬 수 있고, 뇌부종으로 인한 뇌압증가, 두통, 구토, 시야장애, 의식 장애를 유발할 수 있으며, 최근 연구 결과들은 뇌-혈관 문맥의 손상이 인지장애의 위험성도 증가시키는 것으로 알려져 있다.
뇌 혈관 문맥 손상의 원인으로 뇌허혈, 외상성 손상, 감염, 자가면역에 의한 염증, 방사선에 의한 손상, 독소에 의한 손상, 뇌혈관 문맥을 구성하거나 파괴하는 물질들 (Claudin, Occludin, Zo-1, JAM-A, AQP4, MMP-2, MMP-9 등)의 유전적 손상 또는 변이에 의한 발현 변화, 혈압, 혈당, 두개내압력, 삼투압의 변화와 연관된 대사성 손상 등이 있다.
뇌허혈은 일시적, 혹은 영구적 뇌동맥 폐색에 의한 뇌혈류의 감소로 유발되며, 허혈 부위에서는 복잡한 병태 생리적 과정을 통하여 신경 세포사가 초래되며, 이는 비가역적인 신경학적 손상을 발생시킨다. 뇌 허혈 손상은 혈류의 감소, 산소 부족, 뇌허혈 재관류에 따른 연이은 재산화 때문에 일어난다. 예컨대, 뇌 허혈 손상은 뇌동맥 폐색 또는 허혈에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 발현은 유전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며 또한, 발현된 단백질이 세포내에서 본래 기능을 할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.
본 발명에서 진단은 뇌-혈관 문맥 손상 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 뇌-혈관 문맥 손상 및 이에 따른 질병의 발병 여부를 확인하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에서의 진단은 뇌-혈관 문맥 손상 진단 마커의 발현 유무 및 정도를 확인하여 뇌-혈관 문맥 손상 및 이에 따른 질병의 발병 여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
본 발명의 진단용 마커(diagnosis marker)란 뇌-혈관 문맥 손상의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 뇌-혈관 문맥 손상 시 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커는 Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 MMP-9 및 밀착연접 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
금속단백질분해효소(MMP) 패밀리의 구성원은 결합조직의 염증 등을 일으킨다. MMP-9 (Matrix metallopeptidase 9)은 조직 손상 및 염증을 촉진하며, 뇌-혈관 문맥에서는 밀착연접 단백질의 손실을 일으켜 뇌부종 등의 질환을 발생시킨다.
밀착연접 단백질(tight junction)은 밀봉 기능을 담당하는 세포 연접 단백질로써, 이웃하는 세포끼리의 원형질막이 밀착, 폐쇄되어 수용성 분자들이 세포 틈 사이로 쉽게 누출될 수 없게 한다. 뇌-혈관 문맥에서 밀착연접 단백질은 성상교세포의 발돌기로부터 분비되는 물질에 의해 형성되며, 선택적 투과가 가능하게 한다. 밀착연접 단백질이 손실되면 뇌-혈관 문맥의 투과성이 증가하여 뇌부종 등의 질환을 일으킬 수 있다. 예컨대, 밀착연접 단백질은 claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
MMP-9의 발현 증가 또는 밀착연접 단백질의 발현 감소로 뇌-혈관 문맥의 손상이 일어나며, 뇌-혈관 문맥의 투과성이 증가한다. 따라서 MMP-9 및 밀착연접 단백질의 발현 수준을 판단하여 뇌-혈관 문맥 손상 여부를 판단할 수 있어 마커로 사용할 수 있다.
본 발명은 Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트이다.
본 발명에서 검출하기 위한 시약은 단백질 또는 mRNA를 정량적으로 또는 존재여부의 판단을 위해 검출할 수 있는 물질이다. 단백질의 양, 존재여부를 위한 방법으로 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테를로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip), 면역블롯 (immunoblot) 등을 들 수 있다. 단백질 또는 mRNA 검출은 항원-항체반응, 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산, 펩타이드 앱타머, 단백질 또는 mRNA와 특이적으로 상호작용하는 수용체, 리간드, 보조인자와의 반응 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 mRNA와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자 (nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에서 키트는 Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 예컨대 단백질을 검출할 수 있는 시약으로 단클론항체, 다클론항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다. 또한, 단백질은 질량분광분석기를 이용하여도 검출될 수 있다.
mRNA의 검출을 위해 전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR RNase 보호 분석법, 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 사용되는 검출하기 위한 시약은 신호검출을 위해 형광물질과 같은 발색물질과 컨쥬게이션된 것일 수 있다.
본 발명에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본 발명의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자, dNTPs, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 위 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 유전자 칩 키트일 수 있다. 유전자 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제 및 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단키트는 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식에 의한 진단키트일 수 있다.
또한, 본 발명의 진단키트는 마이크로어레이에 의한 진단키트일 수 있다.
본 발명에서 마이크로어레이는 Cav-1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머 또는 항체를 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용하며, 기질(substrate) 상에 고정시키는 것이다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 위 혼성화 어레이 요소는 위 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 위 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 위 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 mRNA일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질 발현이 뇌-혈관 문맥 손상 시 증가하므로, Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 검출 시약을 통해 이들의 발현 여부를 판단하여 뇌-혈관 문맥 손상을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Cav-1 mRNA 검출 시약은 Cav-1 mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에서 프라이머란 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트(ATP 등) 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 Cav-1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
증폭은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Cav-1 단백질 검출 시약은 Cav-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 Cav-1의 항체를 생성하는 방법은 당 분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 Cav-1 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clacksonet al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA 검출 시약은 각각 MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 또는 JAM-A 단백질 검출 시약은 각각 MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 단백질 또는 JAM-A 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다.
MMP-9 발현 증가 또는 claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 및 JAM-A 발현 감소로 뇌-혈관 문맥 손상이 발생하며, 이로 인해 뇌-혈관 문맥 투과성이 증가하여 뇌부종 등의 질환이 발생한다.
본 발명에서 뇌-혈관 문맥 손상은 뇌동맥 폐색 또는 허혈을 원인으로 할 수 있다.
본 발명은 검체의 CAV-1 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법이다.
본 발명에서, 검체는 CAV-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질의 수준 차이가 발생하는 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 검체는 혈액일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명에서의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, RNase 보호 분석법, DNA칩 분석, 면역침전분석법 및 면역조직화학적 분석으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
뇌-혈관 문맥이 손상되면 CAV-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질 발현이 증가하므로, 검체의 CAV-1 mRNA 또는 CAV-1 단백질 발현 수준의 측정을 통해 뇌-혈관 문맥 손상에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이는 뇌-혈관 문맥 손상 진단을 비침습적으로 할 수 있으며, 검체로 혈액 등을 사용하여 쉽고 빠르게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 검체의 MMP-9, claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공을 위해 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커 이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예컨대 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 검안경 검사(Opthalmoscopy), 안저촬영(Funds photography), 또는 형광안저혈관조영술 (Fluorescin angiography) 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 CAV-1 유전자를 포함하는 플라스미드, CAV-1 단백질 및 Cav-1 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물이다.
본 발명에서 치료란, 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.
Cav-1 단백질은 MMP-9의 발현을 억제하여 밀착연접 단백질의 손실을 감소시켜 뇌-혈관 문맥의 손상을 치료할 수 있다. Cav-1 단백질의 발현을 유도하는 Cav-1 유전자를 포함하는 플라스미드 및 Cav-1 mRNA 또한 Cav-1 단백질의 발현을 유도하여 뇌-혈관 문맥의 손상을 치료할 수 있다.
플라스미드란 세포내에서 염색체와는 별개로 존재하여 자율적으로 증식하는 유전자를 총칭하는 것으로, 본 발명에서 플라스미드는 세포 내에서 Cav-1를 발현시키도록 유도하기 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 예컨대, 플라스미드는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물에 추가로 Cav-1 단백질과 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 치료제는 뇌-혈관 문맥 손상 치료를 위하여 단독, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것이 아님은 당연하다.
< 실시예 >
동물
전남대학교 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하였다.
모든 실험은 실험 절차에서 동물의 사용과 돌봄에 관한 National Institutes of Health (NIH, USA)에 의해 강조되는 지침에 부합되게 수행되었다. 동물들은 12 시간 낮/밤 사이클로 관리되었고, 음식과 물을 충분히 공급하였다. Cav-1-/- 쥐(a kind gift from Dr.K.A.Cho, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Chonnma National College of medicine, Gwangju, korea)와 대조군인 야생형 (Cav-1+/+) 한배 새끼 (littermates)는 반접합성 짝짓기를 통해 태어났고, 지방 시설에서 키워졌다. 동물 수술은 국가 동물 보호 규제에 따른 지자체 권한에 의해 승인받았다.
렌티바이러스 벡터와 감염
재조합 렌티바이러스 (lentivirus)는 한국 서울에 있는 Macrogen company에 의해 만들어졌다. Red fluorescence protein (RFP)가 태그된 Cav-1을 만들기 위해 전체 길이의 Cav-1 cDNA는 사람 cDNA library로부터 증폭되었고, 서열을 부호화한 단량체인 RFP를 Cav-1 cDNA의 C-말단과 결합하였다. 증폭된 Cav-1 절편은 BamHI로 분해되었고 IRES 시스템을 사용하는 쥐 CMV 프로모터를 포함하는 벡터인 렌티바이러스 벡터 Lenti-hCMV-IRES-puro 에 삽입되었다. 이 결과로 생긴 Cav-1-RFP 유전자 결합은 뉴클레오타이드 (nucleotide) 염기서열분석으로 입증되었다. 바이러스 입자를 포함하는 배지 상층액은 감염 후 48 시간 동안 배양되고, 0.45 mm 막 (membrane) 필터(Nalgene, New York, NY)로 여과하였으며, 사용되기 전까지 70 ℃로 저장되었다. 형광 영상 (fluorescence imaging)과 면역블롯팅 (immunoblotting)으로 평가된 감염 효율은 감염에 사용된 플라스미드의 양의 80 %이었다.
생체 내 Cav-1의 재 발현의 효과를 평가하기 위해, 정상적인 BALB/c 쥐의 뇌동맥에서 얻어진 내피세포 (ECs)에 렌티바이러스 Cav-1 발현 벡터 (Lenti-hCMV-REP-Cav_IRES-puro)가 도입되었고 그다음 Cav-1 KO 쥐의 태퇴정맥으로 5x105 세포가 정맥주사를 통해 이식되었다. 이 세포 양은 5x105 세포의 침투성 주입이 혈중 산소 감소로 인한 경색된 뇌를 목표로 하는데 효과적이라고 광학 생체 발광 영상에서 나타났기 때문에 선택되었고, 이 실험에 사용된 모든 쥐는 C57BL/6의 유전적 배경을 가지고 있었다.
수술절차
국소 외피 허혈 (Focal cortical ischemia)은 냉광 (Zeiss KL1500 LCD, Germany)을 가진 Rose Bengal (RB, Sigma Chemical Co.,St.Lousi,MO, USA)을 사용하여 대뇌 피질의 미세 혈관에서 광혈전증을 유발시켰다. 각각의 동물은 5 % 아이소플루레인 (isoflurane)으로 마취되고, 뇌정위 (stereotaxic) 프레임 (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)에서 기체 마취 마스크를 통해 2 % 아이소플루레인이 포함된 산소/공기 혼합 기체로 마취가 유지되었다. 체온은 직장 탐침 (rectal probe)에 의해 조절되는 혈 패드를 사용하여 수술하는 동안 37±0.5 ℃로 유지 되었다. 냉광원으로부터 나오는 빛을 비추기 위해 4.5 mm 섬유 광학 다발은 브레그마 (bregma)에서 노출된 두개골 0.5 mm 앞쪽과 왼쪽 감각운동구역 대뇌 피질 위의 정 중선에서 3.7 mm 옆에 위치한다. 뇌에 RB 50 mg/kg가 들어있는 생리식염수을 오른쪽 대퇴부 정맥에 미세주입 펌프를 통해 1분 내로 주입한 후 10분 동안 냉광을 비췄다. 두피를 봉합한 다음 쥐는 케이지 (cage)로 돌아가기 전에 일어날 수 있었다. 모의 대조군 수술에서, 12 마리 동물들에게 RB 대신에 생리식염수를 주입한 후 빛을 비추었다.
BBB 온전함의 측정
혈관 투과성은 정량 형광에 의한 Evan’s blue (EB)의 혈관외 유출 (extravasation)을 측정함으로써 평가되었다. BBB 온전함은 이전에 밝혀져 있었던 EB 염색을 사용하여 허혈 6, 12, 24 및 72 시간 경과 후 (n=3 for each group) 평가되었다. 형광 강도는 fluorescent microplate reader를 사용하여 결정하였다. 상층에 있는 EB는 분광광도법 (spectrophotometry)을 통해 그 양을 측정하였고, 혈관외 유출된 EB의 염색은 뇌 조직의 μg/g을 나타냈다.
면역블롯 분석법 ( Immunoblot analysis)
대조군과 광혈전증 Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 Cav-1 재 발현 (ReCav-1) 쥐(Cav-1이 감염된 내피세포를 가진 Cav-1가 결핍된 쥐)의 뇌를 왼쪽(허혈)과 오른쪽(반대측면 비허혈) 반구를 분리하기 위해 반으로 잘랐다. 단백질가수분해 효소와 인산가수분해 효소 억제제를 포함하는 RIPA lysis buffer에서 뇌 조직을 균질하게 하고, 단백질을 SDS-PAGE (6 % to 12 % 아크릴아마이드 (acrylamide))로 분리시킨 후 니트로셀룰로오스 막에 촬영하였다. 막을 30분 동안 blocking solution에 담그고, 10 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl 및 0.05 % Tween 20 (1X-TBS-Tween)이 포함된 용액으로 washing하였다. 막은 Cav-1에 대한 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology; 1:500), claudin-5, occludin, JAM-A (Santa Cruz Biotechnology; 1:1000), 또는 Zo-1 (Invitrogen; 1:1000)와 함께 밤새도록 4 ℃에서 배양되었다. 그 후에, 막을 washing한 후 2차 항체가 결합한 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase(HRP))로 배양하였다. 대조군 표본을 로딩하기위해 막을 벗기고 β-액틴 항체로 재 탐지하였다. 면역 발현 단백질은 Super-Signal chemiluminescence substrate를 사용하여 탐지하였다. 발현 수치는 각각의 밴드에서 평균 명암도 값 (mean gray value)을 사용한 Image J software (NIH, Bethesda,USA)를 사용하여 정량화하였다.
생체 내 광학 영상
BBB 파괴를 측정함으로써 생체 내 적외선 광학 영상을 평가하기 위해, 우리는 ART Optix MX2 광학 영상 시스템을 (Advanced Research Technologies, Montreal, Qc, Canada) 사용했다. 사전에 광혈전증을 가진 쥐는 배경 이미지를 얻기 위해 ART Optix로 이미지를 나타냈다. 광혈전증을 가진 동물들의 꼬리 정맥을 통해 적외선 형광 탐침인 Cy5.5 (GE Healthcare, MIlwaukee, WI, USA) 100 nM를 주입하였다. 80 MHz의 반복빈도와 12 ps 광 펄스 (light pulse)의 시간 분해능을 가진 670 nm 펄스식 레이져 다이오드는 Cy5.5 탐침을 발현시키기 위해 사용되었다. 형광 신호는 매우 민감한 시간 연관성을 가진 단일광자 계수법 (single photon counting) 시스템에 의해 700 nm에서 모이고 빠른 포토멀티플라이어관 (photomultiplier tube)를 통해 탐지되었다. 생체 내 영상에서, 쥐는 1.5 % 아이소플루레인을 주입하여 마취되고, 흡입 마스크를 통해 주입되는 산화질소/산소/아이소플루레인 (69/30/1%) 혼합기체 내 1.0 % 아이소플루레인으로 마취가 유지되었다. 그리고 적외선 형광 이미지 (near-infrared fluorescence (NIRF))는 두개골 뼈를 제외하고 OptiView analysis system (ART Inc, Montreal, QC, Canada)로 관찰되었다. 머리에서 평균 형광 강도 (fluorescence intensity (FI))와 선택된 관심지역(region of interest (ROI)) lifetime 값을 비 침습으로 얻었다.
젤라틴 자이모그래피 (Gelatin zymography )
MMP-9의 발현에 대한 cav-1 발현의 조절 효과를 알아보기 위해, 젤라틴 자이모그래피는 공지된 방법으로 수행되었다. 젤라틴 자이모그래피에 의해 탐지된 MMP-9의 상대적인 발현 수치의 양을 나타내기 위해, 젤을 수치화하고 탐지된 각 밴드의 용해구역은 mm2내 용해구역에서 Image J software를 사용하여 수량화하였다.
통계적 분석
모든 데이터는 평균의 평균±분산 오차(mean±standard error of the mean (SEM))을 나타냈다. 그룹 간 차이는 일원 변량 분석 (one-analysis of variance (ANOVA))에 뒤이어 터키 사후 검정 테스트 (Tukey post hoc test) 또는 student’s T test를 사용하여 측정하였다. 0.05 이내의 양쪽 확률 값은 통계적으로 의미 있는 것으로 여겨졌다. 모든 측정은 각각의 처리에 대해 알지 못하는 관찰자 때문에 수행되었고, 모든 통계적인 분석은 윈도우용 PASW 18.0 (SPSS, Inc., Somers, NY, USA)을 사용하여 수행되었다.
<결과>
허혈 손상에 따른 BBB 파괴
광혈전증을 가진 쥐의 손상된 대뇌 피질에서 반복된 BBB 온전함의 변화는 허혈중심 손상에 따른 EB의 혈관외 출혈에 의해 측정되었다. EB는 비 허혈성 쥐 뇌에서는 감지할 수 없었다. 허혈에 따른 뇌 반구 손상에 따른 EB의 혈관외 유출은 6 시간 동안 증가했고, 12 시간 후 최고조에 도달했으며, 이후 점진적으로 줄어들었다.
광혈전증에 따른 Cav -1 단백질 발현의 증가
도 1에서 (A)와 (B)는 광혈전증 모델 쥐에서 EB의 혈관외출혈의 양을 나타낸 것이다. EB 혈관외출혈에 의해 측정됐을 때, BBB 파괴는 허혈성 손상 후 12시간 경과 시 정상으로 올라간다. (C)는 허혈 후 6, 12, 24 및 72 시간 경과한 병변 구역에서 대조군으로 설계된 쥐의 대뇌 피질에서 Cav-1과 β-액틴 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯 (immunoblot)이다. (D)는 (C)에서 측정된 Cav-1 발현량을 나타낸다. Cav-1 발현은 허혈 후 6, 12, 24 및 72 시간 경과에 따라 현저하게 증가하였다. 면역블롯팅으로 측정했을 때, Cav-1 발현의 최고점은 허혈 후 12 시간 경과한 때였다. P<0.05; P<0.01 vs sham; Student’s unpaired t-test. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 3 mice/group).
도 1에서 나타난 바와 같이, 면역블롯 분석법은 허혈 후 6, 12, 24 및 72 시간 동안 광혈전증 쥐의 허혈성 반구 속 Cav-1 단백질 수치가 현저한 증가한 것을 보였다. 농도계에 의해 측정된 Cav-1 발현 수치는 허혈성 손상 후 빠르게 증가했다. 손상 후 12 시간 경과했을 때 최고치였고, 12 시간 경과 후 Cav-1의 수치는 점진적으로 감소했다. 결과적으로, 쥐에서 Cav-1의 발현은 허혈성 손상에 따른 BBB의 파괴와 비례했다. 이처럼, BBB파괴와 Cav-1 발현사이에 중요한 연관이 있었다.
Cav -1이 감염된 내피세포의 정맥주사를 통한 이식 후 허혈성 뇌에서 Cav -1의 발현
우리는 Cav-1-/- 쥐가 이소성 Cav-1를 발현할 것인지 알아보기 위해, 렌티바이러스 Cav-1 발현 벡터로 감염된 EC를 Cav-1-/- 쥐에 이식하였다.
도 2에서 (A)는 허혈 후 12시간 경과한 때의 병변 장소에서 대조군, Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 Cav-1 재 발현(ReCav-1) 쥐의 대뇌 피질에서 Cav-1 과 β-액틴 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯이다. (B)는 (A)에서 측정된 Cav-1 발현량을 나타낸다. Cav-1-/- 쥐에 이식에 따른 Cav-1 발현 플라스미드를 가진 EC의 감염은 Cav-1 단백질 수치의 회복을 이끌었다. P<0.01 vs Cav-1+/+ 쥐 (C, D)는 Cav-1 감염이 없는 ECs의 이식 후 Cav-1의 발현을 나타낸다. (C)는 Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 EC가 이식된 쥐의 대뇌 피질에서 Cav-1과 β-액틴 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯이다. (D)는 Cav-1가 감염되지 않은 EC의 이식은 Cav-1 발현에 있어 현저한 변화가 없다는 것을 나타낸다. P < 0.01. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 3 mice/group).
도 2에서 나타난 바와 같이, 이식 후 Cav-1-/- 쥐에서 Cav 발현이 회복되었다. Cav-1을 발현시키는 렌티바이러스로 감염된 EC의 이식으로 허혈성 뇌에서 Cav-1의 수치는 Cav-1-/- 쥐와 비교했을 때 증가하였다. 농도 측정은 허혈성 뇌에서 감염 효율이 이소성 (ectopic) Cav-1의 발현에 충분한 것으로 나타났다. Cav-1+/+와 ReCav-1 쥐의 뇌에서 Cav-1 발현 수치의 차이는 현저하지 않았다.
회복된 Cav 발현이 감염된 EC 그 자체로의 효과로부터 나온 결과인지 결정하기 위해, Cav-1 감염이 없는 EC가 Cav-1-/- 쥐에 이식되었다. 도 2C에서 보는 바와 같이, Cav 발현은 감염 후 Cav-1-/- 쥐에서 회복되지 않았다. Cav-1-/-와 EC가 이식된 쥐의 뇌의 Cav-1 발현 수치에 있어 현저한 차이가 없었다.
Cav -1 발현 조절은 쥐에서 혈관성 부종 ( vasogenic edema)을 결정
BBB 파괴의 정도를 결정하기 위한 BBB 투과성이 EB의 혈관외 유출에 의해 양적으로 나타났다.
도 3에서 (A)은 EB 염색은 허혈 후 12 시간 경과한 Cav-1-/- 쥐에서 Cav-1+/+ 및 이식된 ReCav-1 쥐의 것과 비교했을 시 BBB 파괴의 정도에 있어 증가를 나타낸다. P < 0.01 vs Cav-1+/+ mice; Student’s unpaired t-test. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 3 mice/group).
도 3A에 나타난 바와 같이, Cav-1-/- 쥐에서 뇌부종은 Cav-1+/+ 쥐에서 보다 더 크게 나타나고 더 넓은 지역에서 발생했다. 또한, EB의 혈관외 유출은 허혈 후 Cav-1+/+ 그룹과 비교했을 때 Cav-1-/- 쥐에서 현저하게 증가했다. ReCav-1 쥐에서 EB의 혈관외 유출은 허혈 후 12 시간 경과했을 때 Cav-1-/- 보다 현저하게 낮았다. Cav-1의 수치와 BBB 파괴 정도의 관계는 역관계였다. 뇌부종의 정도에서 Cav-1+/+와 ReCav-1 쥐 사이에 현저한 차이는 없었다. 대조군에서, EB의 혈관외 유출 분석법에 기초했을 때 Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 ReCav-1 쥐들 간의 대측 반구의 BBB 파괴 차이는 없었다.
BBB 파괴를 측정하기 위한 생체 내 이미징을 위해 우리는 생체 내 적외선 광학 영상 기법을 수행했다. 적외선 염색약 (dye) Cy5.5는 온전한 BBB를 통과하지 못한다. Cy5.5는 추적 세포의 혈관외 유출에 기초해서 BBB 파괴의 위치를 알아내기 위한 광학 추적자로서 사용되었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 평균 FI신호는 Cav-1+/+ 쥐와 비교했을 때 Cav-1-/- 쥐에서 현저하게 높았다. ReCav-1 와 Cav-1+/+ 쥐의 평균 FI신호를 비교했을 때, 급성기의 허혈성 뇌졸중에서 위 두 쥐의 평균 FI신호는 비슷했다 (P < 0.01 vs Cav-1+/+ mice; Student’s unpaired t-test. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 1 mice/group repeated three times).
Cav -1 발현 조절은 TJ 단백질 분해와 MMP -9의 발현을 결정한다.
우리는 다음으로 Cav-1 발현 조절에 따른 BBB 파괴의 변화에 기초한 메커니즘을 실험했다. 또한, Cav-1 조절이 TJ 단백질 발현과 MMP 발현에 변화를 유발할 수 있는지에 대해 측정을 진행했다.
도 5는 광혈전성 허혈 후 12 시간 경화한 병변 구역에서, Cav-1+/+, Cav-1-/- 및 ReCav-1 쥐의 대뇌 피질에서 claudin-5 (A), occludin (B), ZO-1 (C) 및 JAM-A (D) 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯을 나타낸다. Cav-1을 발현시키는 감염된 EC의 이식은 Cav-1-/- 쥐와 비교했을 때 허혈성 뇌에서 TJ 단백질 발현의 회복한 수치를 나타낸다. P<0.05; P<0.01 vs Cav-1+/+ mice. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 3 mice/group).
도 5에 나타난 바와 같이, Cav-1-/- 쥐에서 Cav-1을 발현시키는 감염된 EC의 이식은 claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A를 포함하는 TJ 단백질의 손실을 감소시켜 Cav-1의 결핍으로 인한 TJ 단백질의 손실을 막았다. 비록 Cav-1의 증가로 인한 JAM-A에 대한 손실 감소는 가장 작지만, 통계적으로 중요하다. Cav-1-/-와 ReCav-1 중 어느 것도 항존유전자 (housekeeping gene)인 β-엑틴의 수치에 영향주지 않는다는 것은 Cav-1 조절이 단백질 발현에 대한 일반적인 효과가 없다는 것을 말한다.
그 다음, TJ 단백질 발현의 변화를 유발하는 Cav-1은 MMP-9의 단백질가수분해 활동과 관련 있었다. 허혈성 뇌졸중 후 MMP-9이 TJ 단백질을 단백질가수분해로 파괴하는 것으로 보였다. 따라서 우리는 젤라틴 자이모그램을 사용하여 허혈성 뇌 손상 후 12시간 경과 뒤 모의대조군 (sham), Cav-1+/+, Cav-1-/-, ReCav-1 및 EC가 이식된 쥐 사이의 MMP-9 발현을 비교했다.
도 6에 따르면, MMP-9의 발현은 허혈 후 12 시간 경과 후 증가했다. Cav-1-/- 쥐는 MMP-9 발현이 Cav-1+/+ 쥐보다 매우 높았으나, Cav-1 발현 플라스미드를 가지고 있는 EC의 감염으로 MMP-9 발현이 줄어들었다. Cav-1의 감염이 없는 EC의 이식은 Cav-1-/- 쥐와 비교 했을 때, MMP-9 발현에 있어 현저한 차이를 나타내지 않았다. (B)는 MMP-9의 밴드 강도의 측정 막대기 그래프를 나타낸다. P<0.05; P<0.01 vs Cav-1+/+ 쥐. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다(n = 3 mice/group).
도 6에 나타난 바와 같이, MMP-9의 발현은 광혈전성 허혈 후 상당히 증가하였다. Cav-1-/- 쥐는 Cav-1+/+ 쥐보다 상당히 높은 MMP-9의 발현을 나타냈고, Cav-1 발현 플라스미드를 가진 EC의 감염에 의해 MMP-9의 발현이 줄어들었다. 그러나 Cav-1-/- 쥐에 Cav-1 감염 없는 EC를 이식시킨 경우, MMP-9의 발현 정도에서 현저한 변화가 나타나지 않았다. 본 연구 결과는 Cav-1가 뇌 허혈동안 TJ 단백질 분해와 MMP-9 발현을 결정한다는 것을 나타낸다.
<결론>
Cav-1 유전자의 제거는 광혈전증 쥐 모델에서 뇌경색 후 BBB 파괴를 증가시키고, TJ 단백질 발현을 저하시키며, MMP-9의 단백질가수분해 활동성의 증가를 초래하였다. 더욱이, Cav-1-/- 쥐에서 렌티바이러스를 매개로한 Cav-1의 재 발현은 뇌 허혈 후 TJ 단백질 발현을 증가시키고 MMP-9의 단백질가수분해 활동성을 감소시켜 결과적으로 혈관성 뇌부종을 개선시켰다. 이러한 결과들은 Cav-1이 TJ 단백질 및 MMP-9의 발현을 조절함으로써 BBB 투과성을 조절하는 중요한 결정자라는 것을 시사한다.
본 연구는 Cav-1 발현 정도와 BBB 파괴 사이에 강한 연관성이 있고, Cav-1이 BBB 투과성의 중요한 결정자임을 보여준다. 이 결과는 허혈성 뇌 손상 쥐에서 Cav-1이 뇌부종에 대한 치료 효과가 있음을 시사한다. Cav-1-/- 쥐에서 다른 변화를 유도하지 않고 단지 Cav-1의 재 발현만을 유도했을 때 BBB 파괴 감소와 Cav-1 및 TJ 단백질의 발현을 회복시키는 결과를 보였으며, 이는 Cav-1 단백질과 뇌부종 사이의 직접적인 관계가 있음을 뒷받침한다. 이러한 결과는 뇌 허혈성 손상 동안 BBB 투과성을 조절함에 있어 Cav-1이 중심적인 역할을 함을 시사한다. 본 연구는 Cav-1이 허혈성 뇌 손상에 의해 초래되는 TJ 구성 단백질의 손상을 보호하고 MMP의 단백질가수분해 활동성을 감소시켜 BBB의 손상을 줄여주는 역할을 함을 보여준다.

Claims (13)

  1. Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌-혈관 문맥 손상은 뇌동맥 폐색 또는 허혈에 의한 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
  3. 청구항 1에 있어서, MMP-9 및 밀착연접 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 밀착연접 단백질은 claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 마커.
  5. Cav-1 유전자로부터 발현되는 mRNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 검출하기 위한 시약을 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, MMP-9, claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질을 검출하기 위한 시약을 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 Cav-1 mRNA 검출 시약은 상기 Cav-1 mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 Cav-1 단백질 검출 시약은 상기 CAV-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA 검출 시약은 각각 상기 MMP-9 mRNA, claudin-5 mRNA, occludin mRNA, ZO-1 mRNA 또는 JAM-A mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 또는 JAM-A 단백질 검출 시약은 각각 상기 MMP-9 단백질, claudin-5 단백질, occludin 단백질, ZO-1 단백질 또는 JAM-A 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것인, 뇌-혈관 문맥 손상 진단용 키트.
  11. 검체의 Cav-1 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 검체의 MMP-9, claudin-5, occludin, ZO-1 및 JAM-A으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 뇌-혈관 문맥 손상 여부 판단을 위한 정보 제공 방법.
  13. Cav-1 유전자를 포함하는 플라스미드, Cav-1 단백질 및 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 뇌-혈관 문맥 손상 치료용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110780078A (zh) * 2019-11-12 2020-02-11 安徽恩禾生物技术有限公司 一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒
WO2022181333A1 (ja) * 2021-02-26 2022-09-01 国立大学法人大阪大学 軽度認知障害検査
KR102445381B1 (ko) * 2021-11-12 2022-09-20 순천향대학교 산학협력단 혈관성 치매의 신규한 바이오 마커 및 이의 용도
KR20240108272A (ko) 2022-12-30 2024-07-09 재단법인대구경북과학기술원 알파­시누클레인에 의한 혈액-뇌장벽 손상 진단용 마커 및 이의 용도

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