CN110988325B

CN110988325B - 封闭剂及包含该封闭剂的试剂盒

Info

Publication number: CN110988325B
Application number: CN201911342610.9A
Authority: CN
Inventors: 杨周
Original assignee: Maccura Biotechnology Co ltd
Current assignee: Maccura Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110988325A

Abstract

本发明公开了一种新的封闭剂，所述封闭剂含有生物素化酪蛋白；本发明还公开了一种检测试剂盒，所述试剂盒使用链霉亲和素标记的固相载体固定生物素标记的诱饵，使用生物素化酪蛋白作为封闭剂。本发明的封闭剂能提升试剂盒的灵敏度和精密度，具有良好的应用前景。

Description

封闭剂及包含该封闭剂的试剂盒

技术领域

本发明属于封闭剂以及检测试剂盒领域。

背景技术

众所周知，随着生物技术的快速发展，生物检测技术也大量应用于科学研究、医学检测等等方面，为人类科学技术进步作出了巨大贡献。生物检测技术包括显微镜检测技术、染色技术、免疫学检测技术、生物化学检测技术、分子生物学检测技术等等，其中，免疫学检测技术和分子生物学检测检测技术在近年来获得了长足发展。

免疫学检测技术是检测蛋白的基本方法，它是通过抗原和抗体间相互特异性结合来识别被检蛋白的技术。免疫学检测技术以抗原抗体的结合方式来分可以分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法、间接法等，以显色方式来分可以分为酶联免疫检测法(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、放射免疫分析(RIA)等。

分子生物学检测技术是定性或定量检测核酸类物质的检测技术，可以分为核酸体外扩增技术、核酸分子杂交技术和DNA测序技术等。

免疫学检测技术和核酸分子杂交技术在方法学上有较大的交集，即部分方法需要使用固相载体连接某些特定分子，特异性捕获待检物质，再直接(标记物结合前述“特定分子”)或间接(标记物特异性结合被检物质)捕获标记物，通过检测标记物来反应待检物质的多少，其中，固相载体连接前述“特定分子”可以采用亲和素-生物素连接。前述的“特定分子”，被称为“诱饵”；免疫学检测技术中的诱饵通常为与被检物质特异性结合的抗原或抗体，核酸分子杂交技术中的诱饵则通常是与被检核酸互补配对的探针。标记物则为可以与被检物质/诱饵特异性结合的带有标记分子/基团(比如荧光基团、放射性同位素、酶、化学发光物质)的物质。

但是，该种连接方式由于少部分标记物非特异性地结合于固相载体，比如连接在固相载体的亲和素上面，导致检测精密度低、灵敏度低的问题。目前采用封闭剂的方式来减弱非特异性结合。常用封闭剂包括白蛋白、多聚赖氨酸、酪蛋白、奶粉等等，但有时仍无法满足人们对检测精密度、灵敏度的需求。比如，现有的cTnI(肌钙蛋白I)检测试剂盒的灵敏度与精密度仍然难以满足目前检测的要求。因此，有必要对现有的方法进行改进，提高检测的灵敏度和精密度。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的封闭剂，以及使用该封闭剂的检测试剂盒。其技术方案包括：

一种用于封闭带有亲和素或链霉亲和素基团的固相载体的封闭剂，所述封闭剂含有生物素化酪蛋白。

如前述的封闭剂，所述生物素化酪蛋白是生物素酯和酪蛋白反应得到的产物，其中，酪蛋白与生物素酯的质量比为(1～20000)∶91；优选地，酪蛋白与生物素酯的质量比为(200～2000)∶91；特别优选地，酪蛋白与生物素酯的质量比为(400～2000)∶91；最优选地，酪蛋白与生物素酯的质量比为1000∶91。

如前述的封闭剂，所述封闭剂是包含生物素化酪蛋白的溶液。

如前述的封闭剂，所述封闭剂还包含防冻剂，优选地，所述防冻剂是丙三醇。

生物素化酪蛋白在封闭带有亲和素或链霉亲和素基团的固相载体中的用途。

生物素化酪蛋白在制备封闭带有亲和素或链霉亲和素基团的固相载体的封闭液中的用途。

一种试剂盒，所述试剂盒包括：

带有亲和素或链霉亲和素基团的固相载体，生物素化诱饵，前述封闭剂；

所述封闭剂固定于固相载体上，或者为试剂盒的单独组分。

如前述的试剂盒，所述生物素化诱饵是生物素化的抗体、抗原、RNA探针或DNA探针；优选地，为生物素化的抗体；进一步优选地，为生物素化的抗肌钙蛋白I抗体或生物素化的抗PSA抗体。

如前述的试剂盒，所述固相载体为玻璃纤维膜、塑料珠、凝胶珠、塑料微孔反应板、尼龙膜或磁微粒；优选地，为磁微粒。

如前述的试剂盒，磁微粒与生物素化酪蛋白的质量比是1∶(0.0001～1)；优选地，为1∶(0.005～0.1)；更优选的，为1∶(0.005～0.05)；特别优选地，为1∶(0.005～0.01)；最优选地，为1∶0.005。

本发明中，所述生物素化酪蛋白，又称“生物素标记的酪蛋白”，是指生物素和酪蛋白直接相连或间接相连的产物。

本发明中，“诱饵”指的是与待分析、检测或分离的靶标相互作用的物质，包括但不限于蛋白质(包括抗体、抗原)、多肽、DNA、RNA等。例如，当要检测的靶标是抗体时，诱饵便为相应的抗原；当要检测的靶标是抗原时，诱饵便为相应的抗体；当要检测的靶标是特定DNA分子时，诱饵便为与该DNA分子特异性结合的探针。

本发明以生物素化酪蛋白作为封闭剂，用于封闭链霉亲和素标记的磁微粒，具有十分优异的封闭效果，其对检测灵敏度以及批内精密度提升远高于其它封闭剂(生物素、生物素化BSA、生物素化多聚赖氨酸)。

本发明的封闭剂的封闭效果不受检测对象的影响，并不仅限于用于检测肌钙蛋白I、f-PSA(游离前列腺特异性抗原)，还可以是其它蛋白质(包括抗体、抗原)、多肽、DNA、RNA等。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明磁微粒的模型图；MP：Magnetic Particle，磁微粒；SA：Streptavidin，链霉亲和素；Bt：Biotin，生物素；Ab：Antibody，抗体；Casein：酪蛋白。

具体实施方式

实施例1本发明的封闭剂及其制备方法

封闭剂为含有生物素化酪蛋白的溶液。其制备方法为：

(a)用纯化水配置2mg/mL的酪蛋白溶液，按1∶20(w∶v)将酪蛋白溶液与10mM的生物素酯在室温混匀30分钟后，添加1M Tris至终浓度为10mM终止其反应；通过换算，酪蛋白与生物素酯的质量比为1000∶91；理论上，酪蛋白中的伯胺基团可以和生物素酯发生反应，两者在任意比例下均能生成生物素化酪蛋白。若将其应用于产业，其酪蛋白与生物素酯的质量比可以低至1∶91，可以高达20000∶91。

(b)将(a)中产物于磷酸盐缓冲液中2～8℃透析，弃去透析滤过液，即得生物素化酪蛋白溶液。

(c)若需要保存，则收集产物后加入等体积丙三醇混匀后保存于-20℃。

实施例2本发明的封闭剂及其制备方法

封闭剂为含有生物素化酪蛋白的溶液。其制备方法为：

(a)用纯化水配置2mg/mL的酪蛋白溶液，与10mM的生物素酯在室温混匀30分钟后，添加1M Tris至终浓度为10mM终止其反应；满足：酪蛋白与生物素酯的质量比为2∶91。

(b)将(a)中产物于磷酸盐缓冲液中2～8℃透析，弃去透析滤过液，即得。

实施例3本发明的封闭剂及其制备方法

封闭剂为含有生物素化酪蛋白的溶液。其制备方法为：

(a)用纯化水配置2mg/mL的酪蛋白溶液，与10mM的生物素酯在室温混匀30分钟后，添加1M Tris至终浓度为10mM终止其反应；满足：酪蛋白与生物素酯的质量比为4∶91。

实施例4本发明的封闭剂及其制备方法

封闭剂为含有生物素化酪蛋白的溶液。其制备方法为：

(a)用纯化水配置2mg/mL的酪蛋白溶液，与10mM的生物素酯在室温混匀30分钟后，添加1M Tris至终浓度为10mM终止其反应；满足：酪蛋白与生物素酯的质量比为200∶91。

实施例5本发明的封闭剂及其制备方法

封闭剂为含有生物素化酪蛋白的溶液。其制备方法为：

(a)用纯化水配置2mg/mL的酪蛋白溶液，与10mM的生物素酯在室温混匀30分钟后，添加1M Tris至终浓度为10mM终止其反应；满足：酪蛋白与生物素酯的质量比为400∶91。

实施例6本发明试剂盒的组成和使用方法

1.组成

1)磁微粒：表面带有链霉亲和素的磁微粒。

2)生物素化诱饵：生物素化鼠抗肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体；

3)标记物：吖啶酯标记的鼠抗肌钙蛋白I多克隆抗体；

4)底物液：碱性过氧化氢溶液；

5)封闭剂：生物素化酪蛋白，0℃以下保存于丙三醇中，制备方法同实施例1。

2.使用方法

按每mg磁微粒加入20μg生物素化诱饵的比例，将生物素化诱饵与带链霉亲和素的磁微粒室温混匀30分钟后，使用磷酸盐缓冲液涤一次再重悬。按每mg磁微粒加5μg酪蛋白的比例，使用封闭剂与磁微粒室温孵育30min，洗涤，将样本和磁微粒及标记物混合(同时混合、不同时混合均可，本实施例为同时混匀)，37℃环境下孵育，样本中的肌钙蛋白I与鼠抗肌钙蛋白I单克隆抗体及吖啶酯标记的鼠抗肌钙蛋白I多克隆抗体结合，形成抗体-抗原-抗体免疫复合物；洗涤后加入底物液，发生化学发光反应，测量相对发光值(RLU)，而相对发光值与样本中肌钙蛋白I的浓度呈线性相关性，即可通过RLU与肌钙蛋白I浓度的标准曲线得到样品中肌钙蛋白I的浓度值。

另外，本发明试剂盒还可以是：将实施例6试剂盒的组分生物素化诱饵、封闭剂预先固定于磁微粒上形成的试剂盒。

本发明的封闭剂还可以用于其它类型的试剂盒，比如，不使用吖啶酯和/或磁微粒的试剂盒。

为了进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供如下实验例。

实验例1封闭剂对试剂盒(cTnI检测试剂盒)检测效果的影响

1.方法

设置5个组别，检测cTnI的空白限(1imit of blank，LoB)和批内精密度为检查对象，考察cTnI的空白限LOB)和批内精密度的变化(RLU为相对发光单位，化学发光检测方法的信号值)。

5个组别分别是：

1)不封闭组：在实施例6的基础上，舍弃封闭剂。

2)Biotin(生物素)封闭组：在实施例6的基础上，采用的封闭剂替换为生物素。

3)Biotin-BSA(生物素化牛血清白蛋白)封闭组：在实施例6的基础上，采用的封闭剂替换为Biotin-BSA；所述Biotin-BSA的制备方法是将实施例1的酪蛋白替换成牛血清白蛋白BSA。

4)Biotin-多聚赖氨酸(生物素化多聚赖氨酸)组：在实施例6的基础上，采用的封闭剂替换为Biotin-多聚赖氨酸；所述Biotin-多聚赖氨酸的制备方法是将实施例1的酪蛋白替换成多聚赖氨酸；所述多聚赖氨酸的分子量为7kDa-1500kDa。

5)Biotin-casein(生物素化酪蛋白)组：采用实施例6的试剂盒，其中，Biotin-casein的制备方法同实施例1，为本发明的技术方案。

LOB定义和计算：

空白限也被称作净状态变量临界值(critical value of net state variable)，是指测量空白样本时可能观察到的最高测量结果。

用零浓度校准品，重复测定测定20次，得出20次测定结果的RLU值，计算其平均值M和标准差SD，得出(M+2SD)所对应的RLU值。用相邻浓度主校准品重复测定3次，得出3次测定结果的RLU均值。根据零浓度校准品与相邻主校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将(M+2SD)所对应的RLU值带入方程中，计算得出对应的浓度，即为空白限。

批内精密度，检测浓度为0.04ng/mL和0.4ng/mL的样本，重复检测10次，其变异系数(CV)应不大于10.0％。

2.结果

LOB结果如表1所示，采用Biotin-casein组检测，其LOB远低于其他组别，且变异系数最小，表明本发明的试剂盒检测的灵敏度更高，检测结果更可靠。

批内精密度结果如表2、表3所示。在检测0.04ng/mL和0.4ng/mL的样本时，Biotin-casein组检测结果的变异系数CV以及标准差STD远低于其他组别，表明本发明的试剂盒精密度更高。

实验例2封闭剂对试剂盒(f-PSA检测试剂盒)检测效果的影响

1.方法

基于实验例1，将检测对象换成f-PSA(游离PSA，一种前列腺特异性抗原)，对应的生物素化诱饵替换成生物素化的抗PSA单克隆抗体，标记物替换成吖啶酯标记的抗PSA单克隆抗体。其余方法(包括分组方式)不变。

2.结果

LOB结果如表4所示，Biotin-casein组的LOB远低于其他组别，且变异系数最小，表明本发明的试剂盒灵敏度更高，检测结果更可靠。

批内精密度结果如表5、表6所示。在检测2.00μg/L和15.00μg/L的样本时，Biotin-casein组检测结果的变异系数CV以及标准差STD远低于其他组别，表明本发明的试剂盒精密度更高。

综上，本发明以生物素化酪蛋白作为封闭剂，封闭链霉亲和素标记的磁微粒，进而检测cTnI和f-PSA，均具有十分优异的效果，检测灵敏度以及批内精密度远高于其它封闭剂(生物素、生物素化BSA、生物素化多聚赖氨酸)。实验结果说明，本发明以生物素化酪蛋白作为封闭剂，用于封闭链霉亲和素标记的磁微粒的效果优良，且效果不受检测对象的影响，本发明以生物素化酪蛋白作为封闭剂的试剂盒，用于检测具有良好的灵敏度和批内精密度，应用前景十分良好。

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

带有亲和素或链霉亲和素基团的固相载体，生物素化诱饵，封闭剂；所述固相载体为磁微粒；所述封闭剂含有生物素化酪蛋白，所述生物素化酪蛋白是生物素酯和酪蛋白反应得到的产物，其中，酪蛋白与生物素酯的质量比为（1~20000）：91；所述封闭剂固定于固相载体上，或者为试剂盒的单独组分。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素化诱饵是生物素化的抗体、抗原、RNA探针或DNA探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素化诱饵为生物素化的抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素化诱饵为生物素化的抗肌钙蛋白I抗体或生物素化的抗PSA抗体。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，酪蛋白与生物素酯的质量比为（200~2000）：91。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，酪蛋白与生物素酯的质量比为（400~2000）：91。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，酪蛋白与生物素酯的质量比为1000:91。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭剂是包含生物素化酪蛋白的溶液。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭剂还包含防冻剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述防冻剂是丙三醇。

11.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：磁微粒与生物素化酪蛋

白的质量比是1:（0.0001~1）。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于：磁微粒与生物素化酪蛋白的质量比为1:（0.005~0.1）。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：磁微粒与生物素化酪蛋白的质量比为1：（0.005~0.05）。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：磁微粒与生物素化酪蛋白的质量比为1：（0.005~0.01）。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于：磁微粒与生物素化酪蛋白的质量比为1：0.005。