ES2581553T3 - Utilización de compuestos potenciadores de la señal en la detección electroquimioluminiscente - Google Patents

Utilización de compuestos potenciadores de la señal en la detección electroquimioluminiscente Download PDF

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ES2581553T3
ES2581553T3 ES11774051.4T ES11774051T ES2581553T3 ES 2581553 T3 ES2581553 T3 ES 2581553T3 ES 11774051 T ES11774051 T ES 11774051T ES 2581553 T3 ES2581553 T3 ES 2581553T3
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Michaela Windfuhr
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Abstract

Método para medir un analito en una muestra mediante detección electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de: a) incubar la muestra con un reactivo de detección marcado con un grupo electroquimioluminiscente, b) separar el reactivo de detección marcado unido a analito y no unido analito, c) incubar el reactivo de de detección marcado y separado, con una composición de reactivos que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, y ii) por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de ácido carbónico de fórmulas I y II, con R1>=CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 o CH2CH2CH2CH3, con R2>=H, y con R3>=H, d) inducir electroquímicamente la liberación de luminiscencia y e) determinar la señal de electroquimioluminiscencia (EQL), midiendo de esta manera el analito.

Description

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DESCRIPCION
Utilizacion de compuestos potenciadores de la senal en la deteccion electroquimioluminiscente Campo de la invencion
La invencion se refiere a metodos para la deteccion de un analito en una muestra mediante electroquimioluminiscencia utilizando nuevas composiciones de reactivos. Se dan a conocer nuevas composiciones de reactivos, kits de reactivos para medir la electroquimioluminiscencia (ELC) y metodos de deteccion de electroquimioluminiscencia utilizando las nuevas composiciones de reactivos. En particular, la invencion se refiere a la utilizacion de nuevas combinaciones de compuestos que pueden utilizarse en dichas mediciones para proporcionar un rendimiento de ensayo mejorado.
Antecedentes y tecnica anterior
Se conocen metodos para medir los fenomenos electroquimioluminiscentes desde hace anos. Dichos metodos utilizan la capacidad de algunos complejos metalicos especiales de alcanzar, mediante oxidacion, un estado excitado del que se degradan al estado fundamental emitiendo electroquimioluminiscencia. Para una revision ver Richter M.M., Chem. Rev. 104:3003-3036, 2004.
Actualmente existen varios instrumentos disponibles comercialmente que utilizan la electroquimioluminiscencia (ELC) para mediciones analtticas. Las especies que pueden ser inducidas a emitir ELC (especies activas para ELC) han sido utilizadas como marcajes ELC. Entre los ejemplos de marcajes ELC se incluyen compuestos organometalicos tales como la fraccion tris-bipiridil-rutenio (RuBpy), en la que el metal es de, por ejemplo, los metales de los grupos VII y VIII, incluyendo Re, Ru, Ir y Os. Las especies que reaccionan con el marcaje ELC en el proceso de ELC se denominan en la presente memoria co-reactivos de ELC. Entre los co-reactivos utilizados comunmente para la ELC se incluyen las aminas terciarias (por ejemplo la tripropilamina (TPA)), el oxalato y el persulfato. La luz es generada por los marcajes o ligandos de ELC; puede realizarse un seguimiento de la participacion del reactivo de union en una interaccion de union mediante la medicion de la ELC emitida por el marcaje ELC. Alternativamente, la senal ELC procedente de un compuesto activo para ELC puede ser indicativa del medio qrnmico (ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.641.623 y n° 5.643.713, que describen ensayos de ELC que monitorizan la presencia o la destruccion de co-reactivos de ELC especiales). Para mas antecedentes sobre la eLc, los marcajes ELC, los ensayos y la instrumentacion de ELC para la realizacion de ensayos de ELC, ver las patentes US n° 5.093.268, n° 5.147.806, n° 5.240.863, n° 5.308.754, n° 5.324.457, n° 5.591.581, n° 5.597.910, n° 5.679.519, n° 5.705.402, n° 5.731.147, n° 5.786.141, n° 5.846.485, n° 5.866.434, n° 6.066.448, n° 6.136.268 y n° 6.207.369 y la patente EP n° 0 441 875, y las solicitudes publicadas de patente PCT n° WO97/36931, n° WO98/12539, n° WO99/14599, n° WO99/32662, n° WO99/58962, n° WO99/63347, n° WO00/03233 y n° WO98/57154.
La patente US n° 5.677.192 (Klemt V. et al.) da a conocer un metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion de electroquimioluminiscencia utilizando anticuerpos biotinilados con cloracetamida (CAA) como conservante en el tampon de almacenamiento de los anticuerpos. Sin embargo, la CAA es eliminada mediante lavado en el ensayo antes de que se produzca la deteccion de la ELC.
La patente US n° 4.022.456 (Maas W. et al.) da a conocer composiciones que comprenden acetamida, acido borico y un co-reactivo utilizado como agentes potenciadores del crecimiento vegetal.
Los instrumentos de ELC disponibles comercialmente han demostrado un rendimiento excepcional. Se utilizan ampliamente por motivos entre los que se incluyen sus excelentes sensibilidad, rango dinamico, precision y tolerancia de matrices complejas de muestras. La instrumentacion disponible comercialmente utiliza disenos basados en celdas con celdas de flujo reutilizables permanentes.
Los volumenes de muestra disponibles para la determinacion de los analitos con frecuencia se encuentran limitados y resulta necesario determinar un numero creciente de analitos a partir de una sola muestra. Ademas, se requiere desarrollar equipos de laboratorio mas rapidos para la automatizacion de los ensayos y metodos mas sensibles para la deteccion de los analitos. Lo anterior conduce a la necesidad de ensayos electroquimioluminiscentes de alta sensibilidad y espedficos, y metodos para llevarlos a cabo. Ademas, debenan considerarse mejoras asociadas a riesgos de seguridad o cuestiones medioambientales.
Sin embargo, resultana muy ventajosa una deteccion todavfa mas sensibles de los analitos. De esta manera, el objetivo de la presente invencion es mejorar dichos metodos y composiciones de reactivos conocidos, especialmente con respecto al incremento de la senal de ELC y una deteccion mejorada de los analitos en combinacion con los procedimientos electroquimioluminiscentes. Resultana deseable encontrar nuevos reactivos y/o compuestos potenciadores de la senal con un rendimiento mejorado en los ensayos electroquimioluminiscentes.
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Description resumida de la invention
La presente invencion en una realization se refiere a un metodo para medir un analito en una muestra mediante la detection electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de: a) incubar la muestra con un reactivo de detection marcado con un grupo electroquimioluminiscente, b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y separado del analito, c) incubar el reactivo de deteccion marcado que se ha separado, con una composition de reactivos que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas del acido carbonico de formulas I y II,
imagen1
con Ri=CH3, CH2F, CH2C CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2C C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 o
CH2CH2CH2CH3, con R2=H, y con R3=H,
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d) inducir electroqmmicamente la liberation de luminiscencia, y e) determinar la senal de electroquimioluminiscencia (ELC), midiendo de esta manera el analito.
La presente invencion se refiere ademas a una composicion de reactivos para determinar la ELC, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo.
La presente invencion se refiere ademas a una mezcla de reactivos, que comprende una composicion de reactivos para determinar la ELC, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, una muestra que debe investigarse y por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
La presente invencion se refiere ademas a un kit para medir la ELC, que contiene una composicion de reactivos para determinar la ELC, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo.
La invencion, asi como objetivos, caracteristicas y ventajas adicionales de la misma, se entenderan mas completamente a partir de la descripcion detallada siguiente de determinadas realizaciones preferentes.
Descripcion detallada
La practica de la presente invencion utiliza, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologia, biologfa celular, bioqmmica e inmunologia, que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas tecnicas se explican exhaustivamente en la literatura, tal como en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edition (Sambrook et al., 1989; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984)); Animal Cell Culture (R.L. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); Ausubel, F.M., et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology (1987) y actualizaciones periodicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., editores, 1994).
A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comunmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invencion. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994; March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4a ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1992; Lewin, B., Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994, ISBN 0-198542879; Kendrew, J., et al. (editores), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994, ISBN 0-632-02182-9); y Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569 8) que proporcionan al experto en la materia una gma general de muchos de los terminos y expresiones utilizados en la presente solicitud.
Todas las referencias citadas en la presente memoria, incluyendo solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan como referencia en su totalidad.
Definiciones:
5
Tal como se utiliza en la presente memoria, cada uno de los terminos siguientes presenta el significado asociado al mismo en la presente seccion.
Los artfculos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a por lo 10 menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A tttulo de ejemplo, "un analito" se refiere a un analito o a mas de un analito. El termino "por lo menos" se utiliza para indicar que opcionalmente puede encontrarse presente uno o mas objetos adicionales. A tftulo de ejemplo, una matriz que comprende por lo menos dos areas discretas puede comprender opcionalmente dos o mas areas de ensayo discretas.
15 La expresion "uno o mas" se refiere a 1 a 50, preferentemente 1 a 20, resultando preferentes tambien 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 15.
En la Tabla 1 se listan ejemplos de "amidas de acido carbonico" y sus estructuras qrnmicas.
20 Tabla 1: las amidas del acido carbonico presentan la estructura comun siguiente, a menos que se indique lo
contrario:
N°
Nombre de mdice CA n° CAS estructura Residuos
1
formamida 75-122-7 O R2 R1 ' N r3 R1 = H R2 = H R3 = H
2
acetamida 60-35-5 Ver anteriormente R1 = CH3 R2 = H R3 = H
3
2-fluoroacetamida 640-19-7 Ver anteriormente R3 = CH2F R2 = H R3 = H
4
2,2,2-trifluoroacetamida 354-38-1 Ver anteriormente R1 = CF3 R2 = H R3 = H
5
2-cloroacetamida 79-07-2 ver anteriormente R1 = CH2Cl R2 = H R3 = H
6
2,2-dicloroacetamida 68372-7 ver anteriormente R1 = CHCl2 R2 = H R3 = H
7
2-bromoacetamida 683-57-8 ver anteriormente R1 = CH2Br R2 = H R3 = H
8
2-yiodoacetamida 144-48-9 ver anteriormente R1 = CH2J R2 = H R3 = H
9
2-hidroxiacetamida 598-42-5 ver anteriormente R1 = CH2OH R2 = H R3 = H
10
acetoacetamida 5977-14-0 ver anteriormente R1 = CH2COCH3 R2 = H R3 = H
11
2-cloro-N,N-dimetilacetamida 2675-89-0 ver anteriormente R1 = CH2Cl R2 = CH3 R3 = CH3
12
2-cloro-N-hidroxi- metilacetamida 2832-19-1 ver anteriormente R1 = CH2Cl R2 = CH2OH R3 = H
13
2-cloro-N-metoxi-N- metilacetamida 67442-07-3 ver anteriormente R1 = CH2Cl R2 = CH3 R3 = OCH3
14
propanamida(propionamida) 79-05-0 ver anteriormente R1 = CH2CH3 R2 = H R3 = H
15
2-cloropropanamida 27816-36-0 ver anteriormente R1 = CHClCH3 R2 = H R3 = H
16
3-cloropropanamida 5875-24-1 ver anteriormente R1 = CH2CH2Cl R2 = H R3 = H
17
N-metilpropanamida 1187-58-2 ver anteriormente R1 = CH2CH3 R2 = CH3 R3 = H
18
2,2-dimetil-propanamida 754-10-9 ver anteriormente R1 = C(CH3)2CH3 R2 = H R3 = H
19
propanodiamida 108-13-4 ver anteriormente R1 = CH2CONH2 R2 = H R3 = H
20
Butanamida 541-35-5 ver anteriormente R1 = CH2CH2CH3 R2 = H R3 = H
21
2-clorobutanamida 2455-04-1 ver anteriormente R1 = CCHCH2CH3 R2 = H R3 = H
22
Pentanamida 626-97-1 ver anteriormente R1 = CH2CH2CH2CH3 R2 = H R3 = H
23
Hexanamida 628-02-4 ver anteriormente R1 = CH2CH2CH2CH2CH3 R2 = H R3 = H
24
2-pirrolidinona 616-45-5 O , j"\ ^ H ^ ' N " W
25
2,5-butanimida 123-56-8 O ^H \ ""N ^ 0
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La formula I tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a:
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en la que Ri = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 o CH2CH2CH2CH3, y en la que R2 = H, y en la que R3 = H.
La formula II tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la estructura siguiente denominada 2- pirrolidinona, representada en la Tabla 1 como n° 24.
imagen4
Las realizaciones de la invention pueden utilizarse para someter a ensayo una diversidad de muestras que pueden contener un analito o actividad de interes. Dichas muestras pueden encontrarse en forma solida, de emulsion, de suspension, Kquida o gaseosa. Pueden ser, aunque sin limitarse a ellas, muestras que contiene o se derivan de seres humanos o animales, por ejemplo celulas (vivas o muertas) y productos derivados de celulas, celulas inmortalizadas, fragmentos celulares, fracciones celulares, lisados celulares, organulos, membranas celulares, hibridomas, sobrenadantes de cultivo celular (incluyendo sobrenadantes de organismos productores de anticuerpos, tales como hibridomas), agua residual o potable, alimentos, bebidas, composiciones farmaceuticas, sangre, suero, plasma, pelo, sudor, orina, heces, excrementos, saliva, tejido, biopsias, efluente, muestras separadas y/o fraccionadas, Kquidos separados y/o fraccionados, organos, plantas, partes de plantas, productos secundarios vegetales, suelo, agua, suministro de agua, fuentes de agua, residuo filtrado de fluidos (gases y liquidos), toallitas, materiales absorbentes, geles, citoesqueleto, muestras no fraccionadas, lisados celulares no fraccionados, nucleo/nucleos celulares, fracciones nucleares, compuestos quimicos, soluciones qmmicas, componentes biologicos estructurales, componentes esqueleticos (ligamentos, tendones), componentes esqueleticos separados y/o fraccionados, fracciones y/o separaciones de pelo, piel, muestras de piel, fracciones de piel, dermis, endodermis, celulas eucarioticas, celulas procarioticas, hongos, levaduras, celulas inmunologicas, farmacos, farmacos terapeuticos, aceites, extractos, mucosas, aguas residuales, muestras ambientales, solventes organicos o aire. En una realization, la muestra puede comprender ademas, por ejemplo, agua, alcoholes, acetonitrilo, dimetilsulfoxido, dimetilformamida, n-metil-pirrolidona, metanol u otros solventes organicos.
Una "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria se obtiene con el fin de una evaluation in vitro. Tal como apreciara el experto en la materia, cualquiera de dichas evaluaciones se realiza in vitro. En el caso de que la muestra sea una muestra de un paciente, se desecha posteriormente. La muestra del paciente se utiliza unicamente para el metodo diagnostico in vitro de la invencion y el material de la muestra del paciente no se transfiere nuevamente al cuerpo del paciente.
Entre los analitos que pueden medirse se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, celulas completas, antigenos de superficie celular, complejos de protemas, factores y/o componentes de senalizacion celular, segundos mensajeros, factores y/o componentes de senalizacion de segundo mensajero, partmulas subcelulares (por ejemplo organulos o fragmentos de membranas), virus, priones, acaros o fragmentos de los mismos, viroides, factores inmunologicos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, antigenos, haptenos, acidos grasos, acidos nucleicos (y analogos sinteticos), ribosomas, protemas (y analogos sinteticos), lipoprotemas, polisacaridos, inhibidores, cofactores, haptenos, receptores celulares, ligandos de receptor, lipopolisacaridos, glucoprotemas, peptidos, polipeptidos, enzimas, sustratos enzimaticos, productos enzimaticos, enzimas de procesamiento de acidos nucleicos (por ejemplo polimerasas, nucleasas, integrasas, ligasas, helicasas, telomerasas, etc.), enzimas de procesamiento de protemas (por ejemplo proteasas, quinasas, protema fosfatasas, ligasas de protema ubiquitina, etc.), metabolitos celulares, factores endocrinos, factores paracrinos, factores autocrinos, citoquinas, hormonas, agentes farmacologicos, farmacos, farmacos terapeuticos, moleculas organicas sinteticas, moleculas organometalicas, tranquilizantes, barbituricos, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoacidos, azucares, lectinas, protemas recombinantes o derivadas, biotina, avidina, estreptavidina o moleculas inorganicas presentes en la muestra.
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Las celulas completas pueden ser animales, vegetales o bacterias, y pueden ser viables o muertas. Entre los ejemplos se incluyen patogenos vegetales tales como hongos y nematodos. La expresion "partmulas subcelulares" pretende comprender, por ejemplo, organulos subcelulares, partmulas membranales, tal como procedentes de celulas rotas, fragmentos de paredes celulares, ribosomas, complejos multienzimaticos y otras partmulas que pueden obtenerse de organismos vivos. Entre los acidos nucleicos se incluyen, por ejemplo, ADN cromosomico, ADN plasmfdico, ADN vmco y ADN recombinante obtenido de multiples fuentes. Entre los acidos nucleicos se incluyen ademas los ARN, por ejemplo los ARN mensajeros, los ARN ribosomicos y los ARN transferentes. Entre los polipeptidos se incluyen, por ejemplo, enzimas, protemas de transporte, protemas receptoras y protemas estructurales, tales como protemas de cubierta vmca. Los polipeptidos preferentes son enzimas y anticuerpos. Los polipeptidos particularmente preferentes son los anticuerpos monoclonales. Entre las hormonas se incluyen, por ejemplo, la insulina y la hormona tiroidea T4. Entre los agentes farmacologicos se incluyen, por ejemplo, los glucosidos cardfacos. Evidentemente se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invencion incluir sustancias sinteticas que son qmmicamente similares a materiales biologicos, tales como polipeptidos sinteticos, acidos nucleicos sinteticos y membranas sinteticas, vesmulas y liposomas. Lo anterior no pretende ser una lista completa de las sustancias biologicas adecuadas para la utilizacion en la presente invencion, sino que unicamente pretende ser ilustrativa del amplio alcance de la invencion.
Ademas, tfpicamente el analito de interes se encuentra presente a una concentracion de 10-3 molar o inferior, por ejemplo por lo menos de tan solo 10-18 molar.
La expresion "reactivo espedfico de analito" (REA) segun la presente invencion debe entenderse como una molecula o biomolecula (por ejemplo una protema o anticuerpo) con la capacidad de unirse espedficamente al analito. Los "reactivos espedficos de analito" (REA) son una clase de moleculas biologicas que pueden utilizarse para identificar y medir la cantidad de una sustancia qrnmica individual en espedmenes biologicos. Los REA son, por ejemplo, anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, protemas receptoras espedficas, ligandos, secuencias de acidos nucleicos y reactivos similares que, mediante una union espedfica o una reaccion qrnmica con sustancias en un especimen, estan destinadas a la utilizacion en una aplicacion diagnostica para la identificacion y cuantificacion de una sustancia qrnmica o ligando individual en espedmenes biologicos. En terminos simples, un reactivo espedfico de analito es el ingrediente activo de un ensayo. Un REA satisfara tanto los criterios de afinidad como los de especificidad de union del analito.
El termino "anticuerpo" se utiliza en el sentido mas amplio y cubre espedficamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpos. El termino “anticuerpo” comprende las diversas formas de estructura de anticuerpo, incluyendo anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo segun la invencion es, en una realizacion, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo derivado de otras especies animales, tales como el raton, la cabra o la oveja, un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un anticuerpo con agotamiento de antfgeno de celulas T. La ingeniena genetica de los anticuerpos se describe en, por ejemplo, Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984, patentes US n° 5.202.238 y n° 5.204.244; Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985; Lonberg N., Nat. Biotechnol. 23:1117-1125, 2005.
Puede utilizarse cualquier fragmento de anticuerpo que satisfaga los criterios anteriormente indicados para un reactivo espedfico de analito. Los anticuerpos se generan mediante procedimientos del estado de la tecnica, por ejemplo tal como se describen en Tijssen (Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, la totalidad de la obra, especialmente las paginas 43 a 78). Ademas, el experto en la materia conoce perfectamente los metodos basados en inmunosorbentes que pueden utilizarse para el aislamiento espedfico de anticuerpos. Mediante dichos metodos puede mejorarse la calidad de los anticuerpos y por lo tanto su rendimiento en inmunoensayos (Tijssen P., supra, paginas 108 a 115).
Un "reactivo de deteccion" segun la presente invencion comprende un reactivo espedfico de analito (REA) marcado con un grupo electroquimioluminiscente, o un homologo de analito marcado con un grupo electroquimioluminiscente. Segun el formato de ensayo, es conocido por el experto en la materia que reactivo de deteccion debe seleccionarse para los diversos formatos de ensayo (por ejemplo un ensayo de tipo sandwich, un ensayo de puente de doble antfgeno (EPDA), un ensayo competitivo, un ensayo homogeneo y un ensayo heterogeneo). Un reactivo de deteccion en un inmunoensayo heterogeneo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo. Es conocido por el experto en la materia que el reactivo de deteccion puede inmovilizarse sobre una fase solida. En una realizacion, el metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion electroquimioluminiscente puede llevarse a cabo como ensayo homogeneo. En una realizacion, el metodo puede llevarse a cabo como ensayo heterogeneo. En una realizacion, el metodo puede llevarse a cabo en un formato de ensayo de tipo sandwich. En una realizacion, el metodo puede llevarse a cabo en un formato de ensayo competitivo. Tambien en una realizacion, el metodo puede llevarse a cabo en un formato de ensayo de puente de doble antfgeno (EPDA). Se describen en detalle los formatos de inmunoensayo conocidos en la obra de Price C.P. y Newman D.J., Principles and Practice of Immunoassay, 2a ed., 1997.
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El termino "marcaje" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia que es capaz de producir una senal detectable, visiblemente o mediante la utilizacion de instrumentacion adecuada. Entre los diversos marcajes adecuados para la utilizacion en la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cromogenos, compuestos fluorescentes, quimioluminiscentes o electroquimioluminiscentes, catalizadores, enzimas, sustratos enzimaticos, pigmentos, partfculas metalicas y no metalicas coloidales y partfculas de latex y polfmero organico.
El termino "luminiscencia" se refiere a cualquier emision de luz que no obtenga energfa de la temperatura de una fuente energetica (por ejemplo una fuente de radiacion electromagnetica, una reaccion qmmica o energfa mecanica). En general, la fuente provoca que un electron de un atomo se desplace de un estado de energfa mas bajo a un estado de energfa mas alto "excitado"; entonces el electron libera esa energfa en forma de luz emitida al retornar a un estado de energfa mas bajo. Dicha emision de luz habitualmente se produce en el rango visible o proximo al visible del espectro electromagnetico. El termino "luminiscencia" incluye, aunque sin limitarse a ellos, fenomenos de emision lummica tales como la fosforescencia, la fluorescencia, la bioluminiscencia, la radioluminiscencia, la electroluminiscencia, la electroquimioluminiscencia y la termoluminiscencia.
La expresion "marcaje luminiscente" se refiere a un marcaje que genera una senal luminiscente, por ejemplo una emision de luz que no deriva energfa de la temperatura de la fuente emisora. El marcaje luminiscente puede ser, por ejemplo, una molecula fluorescente, una molecula fosforescente, una molecula radioluminiscente, un quelato luminiscente, un compuesto de fosforo o que contiene fosforo, o un punto cuantico.
Un "ensayo de electroquimioluminiscencia" o "EEQL" es un ensayo electroqmmico en el que la molecula de analito unida se detecta con un marcaje unido a un agente de deteccion (molecula diana). Un electrodo inicia electroqmmicamente la luminiscencia de un marcaje qmmico unido a un agente de deteccion. La luz emitida por el marcaje se mide con un fotodetector e indica la presencia o cantidad de complejos de molecula de analito/molecula diana unidos. Los metodos ECLA se describen en, por ejemplo, las patentes US n° 5.543.112, n° 5.935.779 y n° 6.316.607. La modulacion de la senal puede maximizarse para diferentes concentraciones de molecula de analito para conseguir mediciones precisas y sensibles.
En un procedimiento de EEQL pueden suspenderse micropartfculas en la muestra para la union eficiente al analito. Por ejemplo, las partfculas pueden presentar un diametro de entre 0,05 pm y 200 pm, de entre 0,1 pm y 100 pm, o de entre 0,5 pm y 10 pm, y un componente de superficie capaz de unirse a una molecula de analito. En un sistema de EEQL utilizado frecuentemente (Elecsys, Roche Diagnostics, Alemania), las micropartfculas presentan un diametro de aproximadamente 3 pm. Las micropartfculas pueden estar formadas de almidon entrecruzado, dextrano, celulosa, protema, polfmeros organicos, copolfmero de estireno, tal como copolfmero de estireno/butadieno, copolfmero de acrilonitrilo/butadieno/estireno, copolfmero de acrilato de vinilacetilo, copolfmero de cloruro de vinilo/acrilato, partfculas inorganicas inertes, dioxido de cromo, oxidos de hierro, sflice, mezclas de sflice, materia proteica, o mezclas de los mismos, incluyendo, aunque sin limitacion, perlas de sefarosa, perlas de latex, partfculas de cubierta-nucleo, y similares. Las micropartfculas preferentemente estan monodispersadas y pueden ser magneticas, tales como perlas paramagneticas. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 4.628.037, n° 4.965.392, n° 4.695.393, n° 4.698.302 y n° 4.554.088. Las micropartfculas pueden utilizarse en una cantidad de entre aproximadamente 1 y 10.000 pg/ml.
La expresion "de interes" se refiere a un analito o sustancia de posible relevancia que debe analizarse o determinarse.
La "deteccion" incluye cualesquiera medios de deteccion, incluyendo las detecciones directa e indirecta. El termino "deteccion" se utiliza en el sentido mas amplio, incluyendo mediciones tanto cualitativas como cuantitativas de un analito, en la presente memoria mediciones de un analito. En un aspecto, se utiliza un metodo de deteccion tal como se indica en la presente memoria, con el fin de identificar la mera presencia de un analito de interes en una muestra. En otro aspecto, el metodo puede utilizarse para cuantificar una cantidad de analito en una muestra.
La expresion "reducir o inhibir" se refiere a disminuir o reducir una actividad, funcion y/o cantidad en comparacion con una referencia. La expresion "reducir o inhibir" se refiere a la capacidad de causar una reduccion global preferentemente de 10% o superior, mas preferentemente de 25% o superior, y todavfa mas preferentemente de 50%, 75%, 90%, 95% o superior.
La expresion "incremental-", por ejemplo "incrementar senales espedficas" o "el incremento de las senales de EEQL" se refiere a incrementar o elevar una actividad, funcion y/o cantidad en comparacion con una referencia. La expresion "incrementar o elevar" se refiere a la capacidad de causar un incremento global preferentemente de 10% o superior, mas preferentemente de 25% o superior, y todavfa mas preferentemente de 50% o superior.
El termino "determinar" se utiliza en la presente memoria para la deteccion tanto cualitativa como cuantitativa de un analito y puede incluir la determinacion de la cantidad y/o concentracion del analito.
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El termino "medir"/"medicion" en ciencia es el procedimiento de estimar o determinar la magnitud de una cantidad, tal como una longitud o masa, respecto a una unidad de medicion, tal como un metro o un kilogramo. El acto de medir/la medicion utiliza un punto de referencia respecto al que pueden evaluarse otras cosas. El termino medicion tambien puede utilizarse para referirse a un resultado espedfico (valores determinados) obtenido de un procedimiento de medicion. Es la base para una comparacion. El experto en la materia conocera materiales y metodos para correlacionar las senales medidas o los valores determinados con las concentraciones.
Una "composicion de reactivos" o "composicion de reactivos de EQL" segun la presente invencion comprende reactivos que permiten la generacion de senales EQL, por ejemplo un co-reactivo, un agente tamponador para el control del pH, y opcionalmente otros componentes. El experto en la materia conocera componentes presentes en una composicion de reactivos que resultan necesarios para la generacion de la senal EQL en metodos de deteccion electroquimioluminiscentes.
Una "solucion acuosa" tal como se utiliza en la presente memoria es una solucion homogenea de partfculas, sustancias o compuestos lfquidos disueltos en agua. Una solucion acuosa comprende ademas solventes organicos. Los solventes organicos son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo metanol, etanol o dimetilsulfoxido. Tal como se utiliza en la presente memoria tambien debe entenderse que una solucion acuosa puede comprender como maximo 50% de solventes organicos.
Una especie que participa en el marcaje EQL en el proceso de EQL se denominan en la presente memoria "co- reactivos" de EQL. Entre los co-reactivos utilizados comunmente para la ELC se incluyen las aminas terciarias (por ejemplo la tripropilamina (TPA)), el oxalato y el persulfato. El experto en la materia conocera los co-reactivos disponibles que resultan utiles para los metodos de deteccion electroquimioluminiscente.
Una "fase solida", tambien conocida como "soporte solido", es material polimerico insoluble funcionalizado al que pueden engancharse o unirse covalentemente elementos de biblioteca o reactivos (con frecuencia mediante un conector) para inmovilizarse o dejar que se separen facilmente (mediante filtracion, centrifugacion, lavado, etc.) de los reactivos en exceso, los productos secundarios de reaccion solubles, o los solventes. Las fases solidas para el metodo segun la invencion se encuentran ampliamente descritos en el estado de la tecnica (ver, por ejemplo, Butler J.E., Methods 22:4-23, 2000). La expresion "fase solida" se refiere a una sustancia no fluida e incluye partfculas (incluyendo micropartfculas y perlas) preparadas con materiales tales como polfmero, metal (partfculas ferromagneticas, paramagneticas), vidrio y ceramica; sustancias de gel, tales como los geles de sflice, alumina y polfmero; capilares, que pueden prepararse con polfmero, metal, vidrio y/o ceramica; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microtitulacion; tiras solidas; y cubetas, tubos, chips u otros recipientes de muestra para espectrometro. Un componente de fase solida de un ensayo se distingue de las superficies solidas inertes con las que el ensayo puede encontrarse en contacto en que una "fase solida" contiene por lo menos una fraccion sobre su superficie, que esta destinado a interactuar con el anticuerpo de captura o molecula de captura. Una fase solida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta, chip o placa de microtitulacion, o pueden ser componentes no estacionarios, tales como perlas y micropartfculas. Las micropartfculas tambien pueden utilizarse como fase solida para formatos de ensayo homogeneo. Puede utilizarse una diversidad de micropartfculas que permiten la union no covalente o covalente de protemas y otras sustancias. Entre dichas partfculas se incluyen partfculas de polfmero tales como poliestireno y poli(metilmetacrilato); partfculas de oro, tales como nanopartfculas de oro y coloides de oro, y partfculas ceramicas, tales como partfculas de sflice, vidrio y de oxido metalico. Ver, por ejemplo, Martin C.R. et al., Analytical Chemistry-News & Features 70:322A-327A, 1998, que se incorpora como referencia en la presente memoria.
Los terminos "chip", "biochip", "chip de polfmero" o "chip de protema" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una coleccion de un gran numero de sondas, marcadores o marcadores bioqmmicos dispuestos sobre un sustrato compartido (por ejemplo una fase solida) que podna ser una parte de una oblea de silicio, una tira de nilon, una tira de plastico o un portaobjetos de vidrio.
Metodos:
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para medir un analito en una muestra mediante la deteccion electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de: a) incubar la muestra con un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente, b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y separado del analito, c) incubar el reactivo de deteccion marcado que se ha separado, con una composicion de reactivos que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas del acido carbonico de formulas I y II,
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con Ri=CH3, CH2F, CH2CI, CH2CH3, CHCICH3, CH2CH2CI, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CCIHCH2CH3 o
CH2CH2CH2CH3, con R2=H, y con R3=H,
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d) inducir electroqdmicamente la liberation de luminiscencia, y e) determinar la senal de electroquimioluminiscencia (EQL), midiendo de esta manera el analito.
Un aspecto de la invention se refiere a metodos de EQL mejorados basados en las composiciones de reactivos de la presente invencion, particularmente los metodos EQL que presentan limites de detection bajos. Las composiciones de reactivos inesperadamente incrementan las senales espetificas y reducen la senales de fondo. Mas concretamente, los metodos de la invencion proporcionan una sensibilidad mejorada a niveles de deteccion bajos mediante la reduction de la electroquimioluminiscencia de fondo en ausencia de marcajes EQL.
Los inventores inesperadamente han descubierto que la utilization de determinados compuestos del grupo de las amidas del acido carbonico proporcionan varias ventajas, entre ellas una generation de senales mejoradas en los metodos de deteccion EQL y, de esta manera, un rendimiento mejorado del ensayo EQL.
Una caracteristica de la invencion son metodos para la determination de un analito en una muestra que debe investigarse utilizando un marcaje electroquimioluminiscente, en el que se utiliza uno de los metodos listados siguientes para medir los fenomenos electroquimioluminiscentes.
Inesperadamente, los metodos que utilizan compuestos seleccionados de entre el grupo de amidas de acido carbonico emiten menos luminiscencia de fondo que los reactivos de ensayo convencionales sin dichos compuestos. Lo anterior resulta particularmente una ventaja a niveles de deteccion bajos en los que el incremento de la proportion de senal a fondo (=proporcion de senal a ruido) mejora en gran medida la sensibilidad. Inesperadamente, los inventores han encontrado que la realizacion de una deteccion electroquimioluminiscente utilizando un metodo segun la presente invencion resulta en una proporcion mejorada de senal a ruido de 10% a 60% de la deteccion EQL.
El metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion electroquimioluminiscente segun la presente invencion puede llevarse a cabo en una realizacion en una solucion acuosa.
En una realization, la amida de acido carbonico utilizada en el metodo se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida.
En una realizacion preferente, la amida de acido carbonico utilizada en el metodo se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida y butanamida.
En una realizacion preferente, la amida de acido carbonico utilizada en el metodo se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, propanamida y butanamida.
En una realizacion preferente, la amida de acido carbonico se utiliza en el metodo en una concentration de entre 0,01 M y 0,25 M. En una realizacion preferente adicional, la amida de acido carbonico se utiliza a una concentracion de entre 0,01 M y 0,2 M. En una realizacion preferente adicional, la amida de acido carbonico se utiliza a una concentracion de entre 0,01 M y 0,1 M.
En una realizacion, el metodo segun la presente invencion resulta particularmente adecuada para detectar biomoleculas, tales como protemas, polipeptidos, peptidos, fragmentos peptidicos, hormonas, hormonas peptidicas, vitaminas, provitaminas, metabolitos de vitamina y aminoacidos en una muestra de interes.
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La muestra utilizada en los metodos segun la presente invencion es en una realizacion una muestra Kquida, por ejemplo sangre completa, suero o plasma. La muestra, o mas espedficamente la muestra de interes, en una realizacion puede comprender cualquier lfquido corporal y heces. En una realizacion, la muestra es una muestra lfquida, tal como saliva, extractos de heces, orina, sangre completa, plasma o suero. En una realizacion, la muestra es de sangre completa, plasma o suero.
Es conocido por el experto en la materia que las etapas "a) incubar la muestra con un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente" y "b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y libre de analito" en el metodo podna llevarse a cabo en el mismo sitio, por ejemplo en el mismo recipiente de reaccion. Dichas etapas (a) y (b) podnan llevarse a cabo en un procedimiento automatico controlado por medios de control.
Los componentes de muestra no espedficos y el reactivo de deteccion marcado libre de analito pueden separarse en la etapa (b) segun el metodo en un procedimiento de separacion. Por ejemplo, el reactivo de deteccion marcado unido a analito y libre de analito pueden separarse utilizando una etapa de lavado.
Ademas pueden utilizarse otros componentes de ensayo que permitan la deteccion electroquimioluminiscente en los metodos segun la presente invencion.
Un aspecto de la invencion cubre la necesidad de una conservacion eficaz, por ejemplo para el almacenamiento a largo plazo de mezclas de reactivos y composiciones de reactivos. Los conservantes adecuados no debenan presentar ningun efecto sobre la generacion de senales EQL o en un caso ideal, una influencia positiva sobre la generacion de senales EQL.
Como compuestos conservantes adecuados se identificaron el acido borico y/o borato, que controla eficazmente el crecimiento bacteriano y fungico e inesperadamente incrementa las senales EQL espedficas. Un metodo de deteccion EQL con una composicion de reactivos que comprende acido borico y/o borato como conservante presenta el efecto positivo inesperado de un incremento de la senal EQL espedfica generada.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para medir un analito en una muestra mediante la deteccion electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de: a) incubar la muestra con un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente, b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y separado del analito, c) incubar el reactivo de deteccion marcado que se ha separado, con una composicion de reactivos que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, d) inducir electroqmmicamente la liberacion de luminiscencia, y e) determinar la senal electroquimioluminiscente (EQL), midiendo de esta manera el analito.
En una realizacion, el metodo de medicion de un analito en una muestra mediante deteccion
electroquimioluminiscente se caracteriza porque la composicion de reactivos para la generacion de senales EQL comprende un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato a uan concentracion de entre 0,1% y 5%, preferentemente a concentraciones de entre 0,5% y 4%, y mas preferentemente a una concentracion de entre 0,5% y 2%.
En una realizacion, el metodo de medicion de un analito en una muestra mediante deteccion
electroquimioluminiscente se caracteriza porque la composicion de reactivos para la generacion de senales EQL comprende acido borico como conservante a concentraciones de entre 0,1% y 5%, preferentemente a concentraciones de entre 0,5% y 4%, y mas preferentemente a una concentracion de entre 0,5% y 2%.
En una realizacion, el metodo de medicion de un analito en una muestra mediante deteccion
electroquimioluminiscente se caracteriza porque la composicion de reactivos para la generacion de senales EQL comprende borato como conservante a concentraciones de entre 0,1% y 5%, preferentemente a concentraciones de entre 0,5% y 4%, y mas preferentemente a concentraciones de entre 0,5% y 2%.
Los inventores han encontrado que un metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion electroquimioluminiscente que combina el efecto de las amidas de acido carbonico y acido borico y/o borato en una composicion de reactivos puede resultar en una proporcion de senal a ruido adicionalmente mejorada en la deteccion EQL. El efecto acumulado de las amidas de acido carbonico y acido borico y/o borato en una composicion de reactivos conduce a una generacion de senales mejorada por lo menos al 10%, al 25% o al 50% en la deteccion EQL.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para medir un analito en una muestra mediante la deteccion electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de: a) incubar la muestra con un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente, b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y separado de analito, c) incubar el reactivo de deteccion marcado que se ha separado, con una composicion de reactivos que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e iii) por lo menos un conservante seleccionado de
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entre el grupo que consiste de acido borico y borato, d) inducir electroqmmicamente la liberacion de luminiscencia, y e) determinar la senal electroquimioluminiscente (EQL), midiendo de esta manera el analito.
En una realizacion, el metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion electroquimioluminiscente se caracteriza porque la composicion de reactivos comprende ademas un detergente y un agente tamponador.
En una realizacion, el metodo para medir un analito en una muestra mediante deteccion electroquimioluminiscente se caracteriza porque la composicion de reactivos comprende ademas una sal y/o un agente antiespumante.
En una realizacion, la invencion se refiere a un metodo para llevar a cabo un ensayo electroquimioluminiscente, en el que se induce electroquimioluminiscencia en presencia de una composicion de reactivos segun la presente invencion.
Un procedimiento de medicion EQL tfpico para un inmunoensayo EQL comprende multiples intercambios de lfquidos y/o mezclas en la celda de medicion EQL (por ejemplo una celda de flujo). Un procedimiento de medicion EQL tfpico consiste de varias etapas explicadas posteriormente.
El experto en la materia conocera que la celda de medicion EQL debe acondicionarse o regenerarse antes de que tenga lugar la etapa de deteccion eQl mediante enjuague de dicha celda de medicion EQL con una composicion de reactivos segun la presente invencion y adicionalmente la aplicacion de un potencial electrico. Dicha etapa es una parte del procedimiento de determinacion de analitos utilizando la EQL. Se ha descrito en la patente EP n° 1 051 621 que durante dicha etapa de acondicionamiento se forma una capa sobre la superficie del electrodo o electrodos de medicion que permiten la generacion de una senal durante la medicion de un analito en una celda de medicion EQL.
Para un procedimiento tfpico de medicion EQL, se induce una mezcla de reactivos en la celda de medicion EQL limpia y acondicionada a traves del canal de entrada de lfquidos en la cavidad de la celda de medicion EQL. Dicha mezcla es una incubacion de la muestra, reactivos y partfculas magneticas. Dicha mezcla inducida en la celda de medicion puede circundarse de una composicion de reactivos segun la presente invencion que fluya delante y despues de dicha mezcla.
En dicho inmunoensayo EQL, un reactivo de deteccion que comprende moleculas de complejo que se marcan con un grupo electroquimioluminiscente y que son caractensticos para el analisis, se une a dichas partfculas magneticas mediante un par de parejas de union bioqmmica espedficas, por ejemplo estreptavidina y biotina. Las partfculas magneticas se recubren, por ejemplo, con estreptavidina-polfmero, mientras que la biotina se une a las moleculas del complejo.
En la celda de medicion EQL, las partfculas magneticas resultan atrapadas en la superficie del electrodo conjuntamente con las moleculas de complejo marcadas unidas al mismo en el campo magnetico de un iman dispuesto en proximidad a dicho electrodo. Se aplica el campo magnetico durante un flujo continuo de la mezcla, de manera que lo incubado y/o la composicion de reactivos se descarga de la cavidad de la celda de medicion EQL mediante el canal de salida de lfquido.
Tras atrapar las partfculas magneticas, se induce la entrada de una composicion de reactivos segun la presente invencion que contiene un co-reactivo EQL en la celda de medicion EQL en una etapa siguiente, lavando de esta manera las partfculas magneticas con dicha composicion de reactivos. Esta etapa de lavado esta destinada a eliminar los componentes no unidos de dicho incubado del electrodo que potencialmente interfieren con la reaccion electroqmmica.
A continuacion, se induce electroqmmicamente la liberacion de la senal electroquimioluminiscente (EQL) mediante la aplicacion de un potencial electrico, de manera que la intensidad de la luz luminiscente se detecta mediante un fotosensor y puede evaluarse como medida de la concentracion de las moleculas de complejo marcadas sobre las partfculas magneticas localizadas en la superficie del electrodo, de manera que dicha concentracion nuevamente sirve como medida para la concentracion del analito en la muestra.
Tras la deteccion electroquimioluminiscente, la celda de medicion EQL habitualmente se enjuaga con un lfquido de lavado.
Un aparato para llevar a cabo los metodos de deteccion mediante electroquimioluminiscente se menciona en la seccion de ejemplos (Ejemplo 1, 2 o 3) o se describe en el documento n° EP 1 892 524 (A1). Ademas, dicho aparato puede comprender medios para controlar la temperatura de la unidad medidora y/o un recipiente de lfquido. La unidad de medicion se entiende que es una celda en la que se mide la electroquimioluminiscencia. El recipiente de lfquido puede ser un recipiente de almacenamiento, aunque tambien un dispositivo de alimentacion, por ejemplo un tubo para la solucion de reactivos, contenida en la unidad de medicion durante las mediciones.
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Composiciones:
Un aspecto de la invencion se refiere a una composicion de reactivos mejorada para la generacion de senales EQL, que conduce a proporciones de senal a ruido mejoradas. Mas concretamente, la composicion de reactivos de la invencion proporciona una sensibilidad mejorada a niveles de deteccion bajos mediante la reduccion de la electroquimioluminiscencia de fondo en ausencia de marcajes EQL. Inesperadamente, una composicion de reactivos que comprende compuestos como amidas de acido carbonico emite menos luminiscencia de fondo que los reactivos de ensayo convencionales sin estos compuestos. Lo anterior resulta particularmente una ventaja a niveles de deteccion bajos en los que el incremento de la proporcion de senal a fondo (=proporcion de senal a ruido) mejora en gran medida la sensibilidad. Dicha composicion de reactivos mejorada contiene un compuesto del grupo de las amidas de acido carbonico, asf como otros compuestos que permiten el metodo para generar EQL. De manera similar, los inventores han encontrado que la realizacion de una deteccion electroquimioluminiscente utilizando una composicion de reactivos segun la presente invencion resulta en una proporcion mejorada de senal a ruido de 10% a 60% de deteccion de EQL.
Un aspecto de la invencion se refiere a una composicion de reactivos que proporciona proporciones de senal a fondo elevadas en ensayos de electroquimioluminiscencia. Se incrementa la diferencia de senal entre las senales espedficas y las senales de fondo. Dichas propiedades mejoradas se han conseguido mediante la identificacion de combinaciones ventajosas de co-reactivo de EQL, agentes tamponadores del pH, detergente y pH y, en particular, mediante la utilizacion de compuestos seleccionados de entre el grupo que consiste de amidas de acido carbonico.
La composicion de reactivos proporciona un medio adecuado para inducir eficientemente que los marcajes EQL emitan EQL y para medir con precision marcajes EQL mediante la medicion de la EQL. La composicion de reactivos de la invencion puede comprender opcionalmente componentes adicionales, entre ellos conservantes, detergentes, agentes antiespumantes, especies activas EQL, sales, compuestos acidos y basicos para el control del pH (agentes tamponadores), iones metalicos y/o agentes quelantes de metales. La composicion de reactivos de la invencion puede incluir ademas componentes de un ensayo biologico, que en algunos casos pueden marcarse con un marcaje EQL, incluyendo reactivos de union, enzimas, sustratos enzimaticos, cofactores y/o inhibidores de enzimas. La invencion incluye ademas reactivos de ensayo, composiciones, kits, sistemas y componentes del sistema que comprenden la composicion de reactivos de la invencion y, opcionalmente, componentes de ensayo adicionales. La invencion incluye ademas metodos para llevar a cabo ensayos EQL utilizando la composicion de reactivos de la invencion.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo.
En una realizacion, la amida de acido carbonico de la composicion de reactivos se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3- cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida.
En una realizacion preferente, la amida de acido carbonico se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida y butanamida. En una realizacion adicional, la amida de acido carbonico se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, propanamida y butanamida. Las amidas de acido carbonico presentan optimos individuales de concentracion para el efecto potenciador de la EQL. Tal como se muestra en los experimentos (especialmente en las Tablas 2, 3 y 4), el experto en la materia sabra seleccionar la concentracion apropiada para la amida de acido carbonico seleccionada en la composicion de reactivos. Los metodos para determinar la concentracion optima para una amida de acido carbonico en la composicion de reactivos son conocidos por el experto en la materia.
En una realizacion, la composicion de reactivos comprende las amidas de acido carbonico a una concentracion de entre 0,01 M y 0,25 M. En una realizacion adicional, la composicion de reactivos comprende las amidas de acido carbonico a una concentracion de entre 0,01 M y 0,2 M. En una realizacion adicional, la composicion de reactivos comprende las amidas de acido carbonico a una concentracion de entre 0,01 M y 0,1 M.
El co-reactivo de la composicion de reactivos en una realizacion se selecciona de entre el grupo de las aminas terciarias (por ejemplo tripropilamina (TPA)), oxalato y persulfato. En una realizacion preferente, el co-reactivo es TPA.
Puede resultar beneficioso al almacenar una composicion de reactivos incluir un conservante que evite el crecimiento microbiano. Ademas, se identifican conservantes adecuados para controlar el crecimiento bacteriano y fungico para permitir el almacenamiento a largo plazo y la utilizacion de la composicion de reactivos. La composicion de reactivos segun la presente invencion puede contener ademas uno o mas conservantes. En una realizacion de la presente invencion, la composicion de reactivos comprende un conservante (agente conservante).
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En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) por lo menos un conservante.
Preferentemente, el conservante presenta un efecto nulo o positivo sobre la generacion de senales EQL. Es conocido por el experto en la materia que las oxazolidinas (por ejemplo Oxaban A o 4,4-dimetil-oxazolidina), la azida y los conservantes relacionados son compatibles con la EQL. Las oxazolidinas a concentraciones de entre 0,01% y 1% se utilizan normalmente en los reactivos de ensayo. En una realizacion, la composicion de reactivos comprende conservantes seleccionados de entre el grupo de las oxazolidinas, preferentemente Oxaban A. En una realizacion, la composicion de reactivos comprende conservantes a una concentracion de entre 0,01% y 1%; en otra realizacion, la composicion de reactivos comprende conservantes a una concentracion de entre 0,1% y 1%. Tambien puede resultar beneficioso utilizar una mezcla de dos o mas conservantes.
La amida de acido carbonico 2-cloroacetamida (CAA), tal como ya se ha mencionado anteriormente, presenta ademas de su efecto potenciador de la senal EQL, tambien una funcion conservante.
Tal como se ha indicado anteriormente, un aspecto de la invencion cubre la necesidad de anadir un conservante eficaz que presenta una influencia nula o positiva sobre la generacion de senales EQL. Como compuestos inorganicos adecuados se ha identificado el acido borico y/o borato, que controla eficazmente el crecimiento bacteriano y fungico. Inesperadamente los inventores han encontrado que el acido borico y/o borato presente en una composicion de reactivos para determinar la EQL no presenta ninguna influencia negativa sobre la generacion de senales EQL. Inesperadamente se ha encontrado que una composicion de reactivos que comprende acido borico o borato como conservante presenta un efecto positivo sobre el proceso de generacion de senales EQL, es decir, un incremento de la senal espedfica. Ademas, su actividad elevada y bajo grado de problemas asociados a riesgos de seguridad o problemas medioambientales resultan ventajosos. El acido borico o borato, al contrario que algunos otros conservantes utilizados comunmente en composiciones de reactivos, se encuentra libre de halogenos y no libera formaldetudo. Los resultados presentados por el acido borico en la generacion de senales EQL se muestran en la seccion de ejemplos, por ejemplo en el Ejemplo 2.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) por lo menos un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) el conservante acido borico.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) por lo menos un co-reactivo, e ii) el conservante borato.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) por lo menos un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
En una realizacion, la composicion de reactivos segun la presente invencion comprende acido borico o borato como conservante a una concentracion de entre 0,1% y 5%, preferentemente a una concentracion de entre 0,5% y 4%, y resulta particularmente preferente una concentracion de entre 0,5% y 2%.
En una realizacion preferente, la composicion de reactivos segun la presente invencion comprende acido borico como conservante a concentraciones de entre 0,1% y 5%, preferentemente a una concentracion de entre 0,5% y 4%, y resulta particularmente preferente una concentracion de entre 0,5% y 2%.
En una realizacion preferente, la composicion de reactivos segun la presente invencion comprende borato como conservante a concentraciones de entre 0,1% y 5%, preferentemente a una concentracion de entre 0,5% y 4%, y resulta particularmente preferente una concentracion de entre 0,5% y 2%.
La composicion de reactivos segun la presente invencion comprende opcionalmente ademas otros componentes de ensayo. Otros componentes de ensayo se seleccionan de entre el grupo que consiste de por lo menos un detergente, por lo menos un compuesto potenciador de la senal, agentes tamponadores que comprenden agentes acidos y basicos para el control del pH, y agua.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) por lo menos un conservante, iv) agentes tamponadores, v) por lo menos un detergente, vi) una sal y/o agente antiespumante, y vii) opcionalmente otros componentes de ensayo.
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Los detergentes adecuados para una composicion de reactivos segun la presente invencion son aquellos pertenecientes al grupo que consiste de etoxilatos de alcohol de acido graso, incluyendo eteres de poli(etilenglicol), por ejemplo polidocanol u otros eteres de poli(etilenglicol) de formula CxEOy, en la que x=8-18 e Y=2-9, genapol (isotridecilpoli(eter de etilenglicol)n), Plantaren® (alquilpoliglucosido), octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosido), as^ como detergentes zwiterionicos como Zwittergent 3-12 o una mezcla de los mismos. Los detergentes se utilizan a concentraciones de entre 0,01% y 2%. La concentracion optima puede determinarse facilmente para cada detergente. Las concentraciones mas adecuadas son las comprendidas en el intervalo de entre 0,05% y 1%.
En una realizacion, la composicion de reactivos segun la presente invencion comprende detergentes seleccionados de entre el grupo que consiste de polidocanol u otros eteres de poli(etilenglicol) de formula CxEOy, en la que x=8-18 e Y=2-9, octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosido) o detergentes zwiterionicos como Zwittergent 3-12 o una mezcla de los mismos. En una realizacion preferente, la composicion de reactivos comprende detergentes seleccionados de entre el grupo que consiste de polidocanol, octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosido) y Zwittergent 3-12, o una mezcla de los mismos.
Ademas, la senal electroquimioluminiscente tambien puede incrementarse mediante el ajuste del pH a un valor de entre 6,0 y 8,0, preferentemente de entre 6,0 y 7,5, resulta particularmente preferente un valor de entre 6,2 y 6,9. Lo anterior puede llevarse a cabo convencionalmente mediante la utilizacion de un agente tamponador del pH adecuado para dicho intervalo, conocido por el experto en la materia. En una realizacion, el agente tamponador adecuado para la composicion de reactivos comprende KOH y acido fosforico (H3PO4).
Ademas, la senal puede incrementarse mediante la adicion de sales, incluyendo sales inorganicas como, por ejemplo, NaBr, NaCl y Nal. Las sales, especialmente NaCl, se anaden a concentraciones de entre 1 mM y 1 M, preferentemente de entre 10 mM y 100 mM y mas preferentemente de entre 10 mM y 50 mM.
Puede resultar beneficioso, especialmente en aplicaciones de HTS (por sus siglas en ingles, cribado de alto rendimiento), para evitar la produccion de burbujas o espuma. Por ello, puede resultar deseable anadir agentes antiespumantes a la composicion de reactivos. Muchos agentes antiespumantes comerciales (incluyendo Antifoams o-30, Antifoam 204, Antifoam A, Antifoam SE-15, Antifoam SO-25 y Antifoam 289) pueden anadirse a la composicion de reactivos segun la presente invencion.
La composicion de reactivos de la invencion puede incluir marcajes EQL. Los marcajes EQL pueden ser marcajes EQL convencionales. Entre los ejemplos de marcajes EQL se incluyen compuestos tris-bipiridil-rutenio (RuBpy) y otros compuestos organometalicos, en los que el metal es de, por ejemplo, los metales de los grupos VII y VIII, incluyendo Re, Ru, Ir y Os. Estos marcajes EQL son utilizados por el experto en la materia para marcar un reactivo espedfico de analito con un grupo electroquimioluminiscente o para marcar el analito mismo con un grupo electroquimioluminiscente. En una realizacion, la composicion de reactivos de la invencion contiene un analito marcado y/o un reactivo espedfico de analito marcado, en el que el marcaje EQL se selecciona de entre el grupo que consiste de los marcajes EQL dados a conocer en la patente US n° 5.310.687 (A) (BPRu=Ru(bpy)2-bpyCO- OSu), documento n° US 2003/0124572 (A1) (ester de NHS de sulfo-BPRu), documento n° EP720614(A1) (Bpy2-Ru- bpy-CO-UEEK-korks.-OSu) y documento n° WO 2002/027317 (A2) (BPRu-(UE)-25-K y BPRu2SK4),
respectivamente.
Los reactivos y mezclas de los mismos utilizados en la composicion de reactivos pueden proporcionar en forma lfquida, congelada, ultracongelada, sublimada inversamente, liofilizada, gaseosa, solida o seca antes de la utilizacion. Por lo menos antes de la utilizacion de la composicion de reactivos, estos se disuelven en un solvente. Las composiciones de reactivos de la presente invencion se encuentran en una solucion acuosa. En una realizacion preferente, los reactivos se disuelven en agua.
Estas formulaciones mejoradas resultan de particular valor en los ensayos de alta sensibilidad. En algunas realizaciones de la invencion, se mejora el rendimiento de los ensayos EQL adicionalmente mediante combinaciones optimas de la composicion de reactivos con la composicion de electrodo. Dichas composiciones de electrodo EQL adecuadas comprenden electrodos de Ir, Pt o carbono.
Estas combinaciones ventajosas, incluyendo las amidas de acido carbonico potenciadoras de la EQL anteriormente indicadas y conservantes adecuados seleccionados de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, los cuales presentan ambos propiedades mejoradas. Entre ellas se incluyen un rango dinamico mas elevado y una proporcion mejorada de senal EQL del marcaje unido a senal EQL de fondo, utilizando la composicion de reactivos dada a conocer segun la presente invencion. Esta sensibilidad incrementada resulta importante, por ejemplo, en ensayos que se benefician de un lfmite de deteccion mas bajo (por ejemplo el ensayo de troponina T (TNThs, n° de catalogo 05092744), ensayo de antfgeno de cubierta del virus de la hepatitis B (HBeAg, n° de catalogo 11820583), ensayo anti-receptor de tirotropina (anti-TSHR; n° de catalogo 04388780); para mas informacion ver la seccion de Ejemplos).
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Dichas formulaciones mejoradas de composiciones de reactivos pueden proporcionar una mejor precision que puede resultar en un Kmite de deteccion mas bajo en los ensayos EQL.
Otro aspecto de la invencion se refiere a una reduccion de los costes debido a una reduccion de los volumenes requeridos de muestra, reactivos espedficos de ensayo y/o reactivo de ensayo. La perdida de senal con volumenes de reactivo mas bajos puede compensarse mediante la utilizacion de la composicion de reactivos ventajosa segun la presente invencion.
Todav^a otro aspecto de la invencion se refiere a sistemas y aparatos mejorados que contienen la composicion de reactivos de la invencion y/o sistemas y aparatos mejorados adaptados para llevar a cabo los metodos mejorados de la invencion.
La generacion de senales EQL tambien puede mejorarse utilizando los resultados anteriormente indicados solos o en combinacion entre sr
Mezcla de reactivos:
Para la determinacion de la EQL, la composicion de reactivos segun la presente invencion puede mezclarse con compuestos adicionales que forman una mezcla de reactivos. En una realizacion, la presente invencion se refiere a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la ELC, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, una muestra que debe investigarse y iv) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, iii) por lo menos un conservante, iv) una muestra que debe investigarse y v) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, iv) una muestra que debe investigarse y v) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, ii) por lo menos un co-reactivo, iii) una muestra que debe investigarse y iv) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente. En una realizacion preferente, la mezcla de reactivos comprende el conservante acido borico. En una realizacion preferente, la mezcla de reactivos comprende el conservante borato.
La presente invencion se refiere tambien en una realizacion a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, ii) por lo menos un co-reactivo, iii) una muestra que debe investigarse y iv) un detergente, v) un agente tamponador, vi) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente, y vii) que comprende una sal y/o un agente antiespumante.
En una realizacion preferente adicional, la presente invencion se refiere a una mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, iv) una muestra que debe investigarse, v) un detergente, vi) un agente tamponador, y vii) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
La mezcla de reactivos ademas puede comprender por lo menos un detergente y un agente tamponador para el control del pH. Opcionalmente la mezcla de reactivos puede comprender una sal y/o un agente antiespumante.
Otros componentes de ensayo en la mezcla de reactivos se seleccionan de entre el grupo que consiste de reactivos espedficos de analito no marcados, homologos de analito, recubrimientos de fase solida y sustancias que reducen la interferencia.
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Utilizacion:
Un aspecto de la presente invencion se refiere a la utilizacion de una composicion de reactivos mejorada y/o una mezcla de reactivos mejorada de la invencion para llevar a cabo un metodo de deteccion electroquimioluminiscente.
En una realizacion, la invencion se refiere a la utilizacion de una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo de formulas I y II para llevar a cabo una deteccion electroquimioluminiscente. En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo de formulas I y II para llevar a cabo un procedimiento de un metodo de deteccion electroquimioluminiscente.
En una realizacion preferente, la invencion se refiere a la utilizacion de amidas de acido carbonico seleccionadas de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida, para llevar a cabo una deteccion electroquimioluminiscente.
En otra realizacion preferente, la invencion se refiere a la utilizacion de una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida y butanamida para llevar a cabo una deteccion electroquimioluminiscente. En otra realizacion, la invencion se refiere a la utilizacion de una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, propanamida y butanamida para llevar a cabo una deteccion electroquimioluminiscente.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una composicion de reactivos que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) por lo menos un conservante para la determinacion de la EQL.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una composicion de reactivos que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato para la determinacion de la EQL.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una composicion de reactivos que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de amidas de acido carbonico seleccionado de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3- cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida, ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) un conservante para la determinacion de la EQL.
La composicion de reactivos segun la presente invencion resulta, en una realizacion, apropiada para el acondicionamiento o regeneracion de una celda de medicion de EQL y para determinar una senal de EQL. En una realizacion, dicha composicion de reactivos se utiliza como solucion de acondicionamiento. En una realizacion, la composicion de reactivos segun la presente invencion se utiliza para el acondicionamiento o regeneracion de una celda de medicion de EQL. En una realizacion, dicha composicion de reactivos que comprende un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico seleccionadas de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida, se utiliza para el acondicionamiento o la regeneracion de celdas de medicion de EQL. En otra realizacion, dicha composicion de reactivos que comprende un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico seleccionadas de entre el grupo que consiste de acetamida, propanamida y butanamida se utiliza para el acondicionamiento o la regeneracion de celdas de medicion de EQL.
Para la utilizacion en la realizacion de un metodo de deteccion electroquimioluminiscente, la composicion de reactivos puede mezclarse con compuestos adicionales, por ejemplo una muestra que debe investigarse, por lo menos un reactivo de deteccion con un grupo electroquimioluminiscente, asf como otros componentes indicados posteriormente que permiten el metodo de formacion de una mezcla de reactivos.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una mezcla de reactivos que comprende una composicion de reactivos, a) que comprende i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) un conservante, b) una muestra que debe investigarse, y c) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente en la determinacion de la EQL.
La presente invencion se refiere a la utilizacion de una mezcla de reactivos que comprende una composicion de reactivos para determinar la EQL, a) que comprende i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, b) una muestra que debe investigarse, y c) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente en la determinacion de la EQL.
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En una realizacion adicional, la invencion se refiere a la utilizacion de acido borico o borato para la realizacion de una deteccion electroquimioluminiscente. Ademas, en una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato para llevar a cabo un procedimiento de un metodo de deteccion electroquimioluminiscente.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una mezcla de reactivos que comprende a) una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende i) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato, e ii) por lo menos un co-reactivo, b) una muestra que debe investigarse y c) por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente en la determinacion de la EQL.
Ademas, la mezcla de reactivos utilizada para determinar la EQL puede comprender componentes seleccionados de entre el grupo que consiste de un detergente y un agente tamponador para el control del pH. Opcionalmente la mezcla de reactivos utilizada puede comprender una sal y/o un agente antiespumante. Otros componentes de ensayo en la mezcla de reactivos se seleccionan de entre el grupo que consiste de reactivos espedficos de analito no marcados, homologos de analito, recubrimientos de fase solida y sustancias que reducen la interferencia.
Kit.
Un aspecto de la invencion se refiere a kits que comprenden, en uno o mas recipientes, uno o mas componentes de la composicion de reactivos de la invencion. Estos componentes pueden combinarse, opcionalmente con reactivos adicionales, para formar la composicion de reactivos de la invencion. Los kits pueden comprender ademas, en una realizacion, componentes adicionales relacionados con el ensayo, tales como marcajes EQL, reactivos de ensayo marcados de EQL, diluyentes, soluciones de lavado, reactivos desnaturalizantes de protemas, enzimas, reactivos de union, placas de ensayo, desechables, etc.
En una realizacion, la composicion de reactivos se encuentra contenida en uno o mas recipientes de vidrio o plastico, marcados apropiadamente con informacion sobre el contenido de la composicion de reactivos e instrucciones sobre el almacenamiento y utilizacion apropiados. La informacion sobre el contenido de la composicion de reactivos, numero de lote, fecha de produccion, fecha de caducidad, instrucciones sobre el almacenamiento y utilizacion apropiados, tambien pueden almacenarse en un chip IDRF sobre el recipiente de vidrio o plastico. La informacion almacenada en dicho chip IDRF puede leerse con una antena conectada a un dispositivo lector de IDRF y procesarse adicionalmente en medios de control.
En una realizacion, algunos o la totalidad de los componentes de la composicion de reactivos pueden almacenarse, en una realizacion, en un estado lfquido o seco.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo.
En una realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida, e ii) por lo menos un co-reactivo.
En otra realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida y butanamida, e ii) por lo menos un co- reactivo.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, y iii) un conservante.
En una realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, e ii) por lo menos un co-reactivo, y iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
En otra realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida, ii) por lo menos un co-reactivo, e iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
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En otra realizacion preferente, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende: i) una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida y butanamida, ii) por lo menos un co- reactivo, e iii) un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende por lo menos i) un conservante seleccionado de acido borico y borato e ii) por lo menos un co-reactivo.
Las medidas anteriormente indicadas per se ya mejoran significativamente los procedimientos conocidos. Ademas, resulta posible ademas incrementar significativamente la sensibilidad y/o el rango de medicion dinamico de un ensayo de deteccion de analito mediante la combinacion de dichas mediciones.
Los ejemplos y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprension de la presente invencion, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espmtu de la invencion.
Descripcion de las figuras
Mediciones de EQL utilizando tampones de ensayo (composiciones de reactivos) con amidas de acido carbonico
Figura 1 Resultados de medicion con concentraciones de propanamida de entre 0,001 M y 0,25 M (eje X); tasa de recuperacion relativa (% de la referencia) de la medicion de AEnsayo artificial (ensayo artificial fondo de tampon de ensayo); se muestra el fondo del tampon de ensayo y el ensayo del marcaje libre (eje Y). Ver el Ejemplo 1 para mas informacion.
Figura 2 Resultados de medicion con concentraciones de 2-cloroacetamida de entre 0,001 M y 1 M (eje X);
tasa de recuperacion relativa (% de la referencia) de la medicion de AEnsayo artificial (ensayo artificial-fondo de tampon de ensayo); se muestra el fondo del tampon de ensayo y el ensayo del marcaje libre (eje Y). Ver el Ejemplo 1 para mas informacion.
Figura 3 Resultados de medicion con concentraciones de butanamida de entre 0,001 M y 1 M (eje X); tasa de recuperacion relativa (% de la referencia) de la medicion de AEnsayo artificial (ensayo artificial-fondo de tampon de ensayo); se muestra el fondo del tampon de ensayo y el ensayo del marcaje libre (eje Y). Ver el Ejemplo 1 para mas informacion.
Figura 4 Resultados de medicion con concentraciones de acetamida de entre 0,001 M y 1 M (eje X); tasa de recuperacion relativa (% de la referencia) de la medicion de AEnsayo artificial (ensayo artificial-fondo de tampon de ensayo); se muestra el fondo del tampon de ensayo y el ensayo del marcaje libre (eje Y). Ver el Ejemplo 1 para mas informacion.
Figura 5 Resultados de las mediciones con concentraciones de acido borico de entre 0% y 5% (eje X); se utilizo el ensayo artificial como ejemplo para una senal espedfica elevada; el calibrador 1 de HET (hormona estimuladora del tiroides) como calibrador de nivel bajo proporciona una senal de fondo (HET Cal 1); el calibrador 2 de HET proporciona una sena a un nivel de deteccion elevado (HET Cal 2). Los resultados se representan como % de la composicion de reactivos de referencia sin adicion de acido borico. Ver el Ejemplo 2 para mas informacion.
Se llevaron a cabo mediciones de EQL utilizando el dispositivo Roche Elecsys® 2010 utilizando protocolos disponibles para los ensayos indicados posteriormente.
Se anadieron diversas concentraciones de compuestos seleccionados de entre el grupo de las amidas de acido carbonico tal como se indica en las Tablas 2, 3 y 4, al tampon de ensayo siguiente:
Tripropilamina (TPA) 180 mM polidocanol al 0,1% tampon fosfato 300 mM
Se ajusto el pH de la mezcla de reaccion a 6,8 utilizando KOH/H3PO4. Tambien se utilizo el tampon de ensayo como valor del blanco.
Los compuestos seleccionados de entre el grupo de las amidas de acido carbonico (las formulas qrnmicas de las amidas de acido carbonico se muestran en la Tabla 1) se anadieron al tampon de ensayo (composicion de reactivos) a las concentraciones indicadas. Se informan los resultados como recuperacion de senal respecto a las mediciones con un tampon de ensayo que no presenta dichos compuestos.
Se llevaron a cabo mediciones del tampon de ensayo de fondo con un tampon de ensayo que contema las amidas de acido carbonico a la concentracion mostrada en la Tabla 2. Los valores inferiores a 100% indican una senal de fondo de EQL reducida mediante la adicion de la amida de acido carbonico seleccionada a las concentraciones indicadas. La reduccion de la electroquimioluminiscencia de fondo en ausencia de marcajes EQL resulta
particularmente una ventaja a niveles de deteccion bajos, en los que el incremento de la proporcion de senal a fondo (=proporcion de senal a ruido) mejora en gran medida la sensibilidad del ensayo.
Tabla 2:
Fondo de tampon de ensayo
Concentracion
0,25 M 0,1 M 0,01 M 0,001 M 0,0001 M
2,2 dicloro-acetamida
30% 40% 70% 84% 93%
2-cloroacetamida
66% 69% 80% 94% 98%
2-clorobutanamida
91% 79% 80% 92% 98%
2-clor-N-hidroximetilacetamida
0% 46% 97% 91% 97%
2-clor-N,N-dimetilacetamida
64% 75% 92% 99% 98%
2-clor-N-metoxi-N-metilacetamida
0% 0% 88% 99% 102%
2-cloropropanamida
70% 68% 78% 93% 97%
3-cloropropanamida
n.d. n.d. 79% 91% 96%
Acetamida
79% 80% 90% 95% 97%
Acetoacetamida
n.d. 55% 85% 94% 98%
2-bromoacetamida
n.d. n.d. 39% 72% 93%
Butanamida
68% 68% 81% 108% 108%
Formamida
74% 75% 81% 94% 98%
2-fluoroacetamida
73% 77% 91% 101% 102%
2-hidroxi-acetamida
93% 90% 96% 100% 101%
Hexanamida
56% 53% 67% 83% 90%
2-yodoacetamida
0% 0% 0% 0% 34%
Propanodiamida
79% 84% 92% 91% 99%
N-metilpropanamida
88% 90% 94% 98% 100%
2,2 dimetilpropanamida
69% 68% 88% 98% 99%
propanamida (propionamida)
77% 74% 86% 95% 88%
2-pirrolidona
88% 84% 96% 101% 100%
2,5-butanimida
135% 103% 105% 103% 98%
2,2,2-trifluoro-acetamida
98% 85% 87% 95% 99%
Pentanamida
75% 63% 73% 91% 97%
n.d.=no determinado
5
En un experimento analogo se determinaron las senales del marcaje libre. El valor del marcaje libre representa la senal generada por una solucion que contiene un marcaje EQL libre en ausencia de micropartfculas (RuBpy 10 nM en el tampon de ensayo). Se indica dicho valor en la Tabla 3 respecto al tampon de ensayo sin ningun compuesto adicional, en %. Este formato de ensayo tambien es conocido como medicion homogenea o formato de ensayo 10 homogeneo. Los valores superiores a 100% indican una senal EQL incrementada mediante la adicion de la amida de acido carbonico seleccionada a la concentracion indicada. Se muestran los resultados en la Tabla 3.
Tabla 3:
Ensayo de marcaje libre
Concentracion
0,25 M 0,1 M 0,01 M 0,001 M 0,0001 M
2,2 dicloro-acetamida
33% 66% 145% 120% 104%
2-cloroacetamida
155% 151% 131% 109% 101%
2-clorobutanamida
157% 147% 126% 108% 100%
2-clor-N-hidroximetilacetamida
0% 6% 103% 125% 99%
2-clor-N,N-dimetilacetamida
125% 116% 103% 100% 100%
2-clor-N-metoxi-N-metilacetamida
2% 5% 124% 0% 0%
2-cloropropanamida
113% 155% 132% 110% 102%
3-cloropropanamida
n.d. n.d. 132% 107% 100%
acetamida
141% 132% 110% 102% 100%
acetoacetamida
6% 21% 130% 104% 97%
2-bromoacetamida
n.d. n.d. 89% 139% 110%
butanamida
145% 136% 114% 103% 99%
formamida
134% 145% 127% 111% 103%
2-fluoroacetamida
144% 134% 111% 102% 100%
2-hidroxi-acetamida
130% 137% 109% 101% 99%
hexanamida
118% 105,7% 120% 111% 103%
2-yodoacetamida
0% 0% 2% 3% 127%
propanodiamida
123% 135% 115% 115% 100%
5
10
15
20
25
N-metilpropanamida
106% 99% 97% 98% 98%
2,2 dimetilpropanamida
125% 120% 106% 99% 97%
propanamida (propionamida)
144% 135% 113% 101% 99%
2-pirrolidona
142% 130% 107% 100% 99%
2,5-butanimida
102% 136% 107% 100% 99%
2,2,2-triflouro-acetamida
130% 150% 116% 103% 100%
pentanamida
151% 140% 122% 108% 103%
n.d.=no determinado
Ademas, se determinaron los valores utilizando el ensayo simplificado que inclma perlas. Este ensayo artificial es un ensayo que incluye micropartfculas marcadas con RuBpy para una senal espedfica elevada. Este formato de ensayo tambien es conocido como medicion heterogenea o formato de ensayo heterogeneo. La diferencia entre la senal de ensayo artificial espedfica y la senal de fondo (fondo de tampon de ensayo) utilizando el tampon de ensayo tal como se ha indicado anteriormente con los compuestos adicionales indicados como AEnsayo artificial, en % respecto a tampon de ensayo sin ningun compuesto adicional. Los valores superiores a 100% indican una senal EQL incrementada mediante la adicion de la amida de acido carbonico seleccionada a la concentracion indicada. Se muestran los resultados en la Tabla 4.
Tabla 4:
AEnsayo artificial (ensayo artificial-fondo de tampon de ensayo)
Concentracion
0,25 M 0,1 M 0,01 M 0,001 M 0,0001 M
2,2 dicloro-acetamida
73% 67% 92% 122% 109%
2-cloroacetamida
160% 165% 148% 113% 104%
2-clorobutanamida
119% 152% 149% 119% 102%
2-clor-N-hidroximetilacetamida
100% 54% 109% 121% 107%
2-clor-N,N-dimetilacetamida
97% 115% 113% 103% 104%
2-clor-N-metoxi-N-metilacetamida
100% 100% 108% 100% 95%
2-cloropropanamida
63% 109% 145% 119% 104%
3-cloropropanamida
n.d. n.d. 148% 111% 104%
acetamida
138% 144% 123% 110% 106%
acetoacetamida
n.d. 61% 125% 107% 98%
2-bromoacetamida
n.d. n.d. 68% 129% 114%
butanamida
159% 161% 131% 95% 91%
formamida
51% 76% 116% 110% 105%
2-fluoroacetamida
148% 148% 118% 100% 97%
2-hidroxi-acetamida
32% 85% 108% 100% 99%
hexanamida
52% 59% 81% 113% 109%
2-yodoacetamida
0% 0% 0% 0% 125%
propanodiamida
50% 84% 112% 108% 100%
N-metilpropanamida
104% 106% 104% 102% 100%
2,2 dimetilpropanamida
147% 149% 119% 103% 99%
propanamida (propionamida)
157% 163% 133% 111% 116%
2-pirrolidona
117% 144% 116% 100% 99%
2,5-butanimida
-11% 84% 101% 98% 103%
2,2,2-trifluoro-acetamida
47% 130% 133% 106% 100%
pentanamida
129% 147% 136% 119% 107%
n.d.=no determinado
En la figura 1 se presenta un grafico que contiene los resultados para la propanamida, tal como se muestran en las Tablas 2, 3 y 4. En la figura 2 se presenta un grafico que contiene los resultados para la 2-cloroacetamida, tal como se muestran en las Tablas 2, 3 y 4. En la figura 3 se presenta un grafico que contiene los resultados para la butanamida, tal como se muestran en las Tablas 2, 3 y 4. En la figura 4 se presenta un grafico que contiene los resultados para la acetamida, tal como se muestran en las Tablas 2, 3 y 4.
Ejemplo 2
Acido borico como conservante potenciador de la senal
Se llevaron a cabo mediciones de EQL utilizando el dispositivo Roche Elecsys® 2010 utilizando los protocolos recomendados para los ensayos indicados posteriormente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se utilizo el tampon de ensayo de EQL siguiente para determinar el valor del blanco:
Tripropilamina (TPA) 180 mM Polidocanol al 0,1%
Oxaban A al 0,1%
Tampon de fosfato 300 mM
A dicho tampon de ensayo se anadieron cantidades crecientes de acido borico, tal como se indica. Se ajusto el pH final a 6,8 utilizando KOH/H3PO4.
Se llevaron a cabo mediciones del tampon de ensayo de fondo con un tampon de ensayo que contema acido borico a las concentraciones mostradas en la Tabla 5. El valor del marcaje libre representa la senal generada por una solucion que contiene un marcaje EQL libre en ausencia de micropartfculas (RuBpy 10 nM en el tampon de ensayo, medicion homogenea) respecto al tampon de ensayo sin ningun compuesto adicional, en %. El ensayo artificial es un ensayo que incluye micropartfculas marcadas con RuBpy para una senal espedfica elevada. Como ensayo diagnostico in vitro comercial, se utilizo el ensayo de HET Elecsys® (ensayo de tirotropina para Elecsys®, n° de catalogo 11731459) para determinar la AHET. Se utilizo el calibrado 1 de HET (HET juego de cal., n° de catalogo 04738551) como calibrador de niveles bajos (no hay analito presente) en el ensayo de HET, proporcionando una senal de fondo (HET cal. 1); el calibrador 2 de HET se utilizo en el ensayo de HET para proporcionar un valor de senal elevada (HET cal. 2).
Los resultados del ensayo artificial, HET cal. 1 y HET cal. 2 se representan graficamente en la figura 5 como recuperacion relativa en % del tampon de ensayo de referencia sin adicion de acido borico.
En particular, se llevaron a cabo las mediciones siguientes:
Tabla 5:
Recuperacion relativa (% de la referencia) - Comparacion con un tampon de ensayo sin acido borico
Conc. de acido borico
0% 0,1% 0,5% 1,0% 2,0% 5,0%
Fondo de tampon de ensayo
100% 103% 102% 98% 103% 103%
Ensayo de marcaje libre
100% 100% 99% 97% 93% 93%
Ensayo artificial
100% 104% 108% 107% 108% 108%
HET Cal. 2
100% 105% 108% 108% 109% 112%
HET Cal. 1
100% 100% 98% 95% 98% 94%
La adicion de acido borico como conservante en un tampon de ensayo mejora la senal heterogenea espedfica, especialmente en el ensayo artificial y en la determinacion del HET Cal. 2.
Efecto de los tampones de ensayo que contienen propanamida y acido borico en el limite de deteccion inferior de los ensayos Elecsys®
Se determino el lfmite de deteccion inferior con varios ensayos diagnosticos in vitro comerciales (HBeAg: n° de catalogo de Roche: 11820582; Anti-RHET: n° de catalogo de Roche: 04388780, TNThs: n° de catalogo de Roche: 05092744) con el fin de comparar dos preparaciones de tampon de ensayo.
Tampon de ensayo A:
TPA 180 mM, polidocanol al 0,1%, tampon fosfato 300 mM, Oxaban A al 0,1%.
Tampon de ensayo B:
TPA 180 mM, polidocanol al 0,1%, propanamida 50 mM, tampon fosfato 300 mM, acido borico al 1%.
Se ajusto el pH final de ambos tampones de ensayo, A y B, a 6,8 utilizando KOH/H3PO4.
Los tres ensayos disponibles comercialmente que se han indicado anteriormente se analizaron para mostrar el efecto del acido carbonico, amida, propanamida y el conservante acido borico sobre el rendimiento de ensayo en la deteccion de concentracions de analito muy bajas.
Los ensayos se midieron en un analizador Roche Elecsys® y se calibraron tal como se indica en las instrucciones en el envase. Para calcular el lfmite de deteccion inferior, se determinaron las senales de una muestra sin analito (HBeAg, anti-RHET) o con una concentracion de analito muy baja (TNThs). Se calculo la desviacion estandar de la determinacion 21, se multiplico por 2 (2SD) o 3 (3SD) y se anadio (HBeAg, TNThs) o resto (anti-RHET, ensayo competitivo) de la media de la senal. A continuacion, se determino la concentracion correspondiente de las senales
calculadas, utilizando la curva de calibracion para cada ensayo. Para muestras con una concentracion de analito baja (TNThs), se resto la concentracion de analito de la muestra de dichas concentraciones calculadas.
Los tres ensayos se beneficiaron de la composicion de reactivos mejorada que contema una amida de acido 5 carbonico segun la presente invencion, as^ como las que conteman acido borico, que tambien presenta una funcion conservante. Los resultados para los ensayos de HBeAg, anti-RHET y TNThs se muestran en las Tablas 6, 7 y 8, respectivamente.
10
Tabla 6:
Lfmite inferior de deteccion [u/ml]
HBeAg
2 SD 3 SD
Tampon de ensayo A
0,0030 0,0044
Tampon de ensayo B
0,0018 0,0030
Tabla 7:
Lfmite inferior de deteccion [u/ml]
anti-RHET
2 SD 3 SD
Tampon de ensayo A
0,324 0,500
Tampon de ensayo B
0,218 0,332
Tabla 8:
Lfmite inferior de deteccion [pg/ml]
TNThs
(2SD) -Conc. de la muestra (3SD) -Conc. de la muestra
Tampon de ensayo A
1,193 1,832
Tampon de ensayo B
0,782 1,140
15

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para medir un analito en una muestra mediante detection electroquimioluminiscente, que comprende las etapas de:
    a) incubar la muestra con un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente,
    b) separar el reactivo de deteccion marcado unido a analito y no unido analito,
    c) incubar el reactivo de de deteccion marcado y separado, con una composition de reactivos que comprende:
    i) por lo menos un co-reactivo, y
    ii) por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II,
    imagen1
    con Ri=CH3, CH2F, CH2C CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH^CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 o CH2CH2CH2CH3, con R2=H, y con R3=H,
    imagen2
    d) inducir electroqufmicamente la liberation de luminiscencia y
    e) determinar la senal de electroquimioluminiscencia (EQL), midiendo de esta manera el analito.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la medicion de un analito en una muestra utilizando la EQL se lleva a cabo en una solution acuosa.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que la amida de acido carbonico se selecciona de entre el grupo que consiste de acetamida, 2-fluoroacetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3- cloropropanamida, butanamida y 2-clorobutanamida.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la composicion de reactivos comprende una amida de acido carbonico a una concentration de entre 0,01 M y 0,25 M.
  5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la composicion de reactivos de la etapa 1c) comprende un conservante.
  6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado por que la composicion de reactivos de la etapa 1c) comprende un conservante a una concentracion de entre 0,1% y 5%.
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 5 o 6, caracterizado por que la composicion de reactivos de la etapa 1c) comprende un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
  8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la composicion de reactivos de la etapa 1c) comprende un detergente y un agente tamponador.
  9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, caracterizado por que la composicion de reactivos de la etapa 1c) comprende ademas una sal y/o un agente antiespumante.
  10. 10. Composicion de reactivos para determinar la EQL, que comprende:
    i) un compuesto seleccionado de entre el grupo de las amidas de acido carbonico de formulas I y II, y
    ii) por lo menos un co-reactivo, en el que el co-reactivo se selecciona de entre el grupo de las aminas terciarias (por ejemplo tripropilamina (TPA)), oxalato y persulfato.
  11. 11. Composicion de reactivos segun la reivindicacion 10, caracterizada por que la composicion de reactivos contiene ademas un conservante seleccionado de entre el grupo que consiste de acido borico y borato.
  12. 12. Mezcla de reactivos para determinar la EQL, que comprende una composicion de reactivos segun la reivindicacion 10 o 11, una muestra que debe investigarse y por lo menos un reactivo de deteccion marcado con un grupo electroquimioluminiscente.
    5 13. Utilizacion de una composicion de reactivos segun la reivindicacion 10 o 11 en la determinacion de la EQL.
  13. 14. Utilizacion de una amida de acido carbonico seleccionada de entre el grupo de formulas I y II para la realizacion de un procedimiento de deteccion electroquimioluminiscente.
    10 15. Kit para medir la EQL, que contiene una composicion de reactivos segun la reivindicacion 10 o 11.
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