CN111487210B - 一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒及其检测方法和运用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白检测技术领域，进一步来说，本发明涉及一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒及其检测方法和运用。所述试剂盒属于双缩脲尿比色法的改良。以侧链烷基取代胆酸盐、乙基苯基聚乙二醇、二喹啉甲酸、氢氧化钠水溶液作为A液，以硫酸铜、酒石酸钠、氢氧化钠及碳酸盐缓冲液混合溶液作为B液，以牛血清白蛋白、氯化钠、叠氮化钠或Proclin300作为标准液，能对脂溶性、疏水性强的或疏水亲水混合性蛋白样品快速定量，同时标准液具有细菌防腐性，可长期冷藏放置。相较于常规的蛋白定量方法，本发明具有操作简单、价格低廉、用途广泛、结果稳定、保质期长等优点。

Description

一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒及其检测方法和运用
技术领域
本发明涉及蛋白检测技术领域，尤其涉及一种利用生化方法对动、植物中蛋白进行定量技术的检测试剂盒及其检测方法和运用。
背景技术
蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,其定性、定量分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验、诊断疾病、生物药物质量检验中最重要的工作。测定蛋白质的方法有很多，分为定性测定和定量测定。定性测量主要是通过蛋白质与显色试剂的显色反应来判断，定量测定是对蛋白质的含量进行精准的测定，其测定方法有多种，包括《食品安全国家标准GB5009.5-2010—食品中蛋白质的检测》以及
《GB/T6432—1994—饲料中粗蛋白检测方法》中公开的蛋白检测方法凯氏定氮法、紫外吸收法，还有生化实验室中常用到的考马斯亮蓝法、双缩脲法、BCA法、Folin-酚法等，凯氏定氮法能精准反应蛋白质中氮的含量，但操作起来繁杂，设备及日常消耗成本高，且样本检测通量低；考马斯亮蓝法、紫外吸收法操作简单，但测量灵敏度不高，对检测蛋白的分子量大小有限制；传统的双缩脲法、Folin-酚法、BCA法等操作简单，灵敏度较高，但不适宜于含脂量高、疏水性强等样本的测定，且标准液放置一段时间后易染菌变质。
针对上述情况，有必要研究一种运用于含脂量高、疏水性强的蛋白定量检测试剂盒，且不易变质、能明显适用于多种混合性样品的测定，以扩大检测范围，节约检测成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用广泛的能对动、植物中蛋白进行定量技术检测试剂盒，改变现有技术中存在的不适宜于含脂量高、疏水性强等样本的测定，且标准液放置一段时间后易染菌变质的缺陷。
为了实现上述目的，本发明提供了一种适用性广泛的蛋白定量检测试剂盒，包含试剂A、试剂B、测量品溶解液、标准样品。其中：
所述试剂A包含有终浓度为(w/v)0.1-4％的侧链烷基取代胆酸盐、(v/v)0.2-0.35％乙基苯基聚乙二醇、40-80mM二喹啉甲酸；
进一步地，所述试剂A为碱性；
进一步地，所述试剂A中侧链烷基取代胆酸盐可以是结构如式(I)的一种或多种：
式(I)包含的化合物有：R1-R6号位烷基单取代胆酸盐、R1-R6号位烷基二取代胆酸盐、R1-R6号位烷基三取代胆酸盐、R1-R6号位烷基四取代胆酸盐、R1-R6号位烷基五取代胆酸盐、R1-R6号位烷基六取代胆酸盐；
优选地，所述试剂A中的侧链烷基取代胆酸盐为侧链烷基一取代胆酸盐、侧链烷基二取代胆酸盐、侧链烷基三取代胆酸盐的一种或多种。
优选地，所述试剂A中的侧链烷基取代胆酸盐为侧链烷基一取代胆酸钠、侧链烷基二取代胆酸钠、侧链烷基三取代胆酸钠的一种或多种。
所述试剂B包括150-300mM硫酸铜水溶液，2-20mM酒石酸钠及缓冲物质水溶液；
进一步地，所述试剂B中缓冲物质缓冲物质选自磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种，优选碳酸盐缓冲液。
进一步地，所述试剂B为碱性。
所述测量品溶解液为100mM-180mM氯化钠、终浓度(v/v)0.01％-0.1％的防腐剂；
进一步地，所述测量品溶解液中防腐剂为叠氮化钠或proclin300水溶液。
所述标准样品为溶解于上述测量品溶解液中含0.01mg/ml-5mg/ml牛血清白蛋白的水溶液。
本发明还提供了所述适用性广泛的蛋白定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)试剂A：称取符合浓度的侧链烷基取代胆酸盐、乙基苯基聚乙二醇，溶于去离子水中，加入二喹啉甲酸，加氢氧化钠至碱性，过滤后得到澄清的溶液A。
2)试剂B：称取硫酸铜颗粒或水合硫酸铜溶于去离子水中，另外称酒石酸钠、氢氧化钠及缓冲物质溶于上述溶液中，配制成缓冲液，抽真空过滤，得到澄清的溶液B。
3)测量品溶解液：称取氯化钠固体，溶于去离子水中，再加入防腐剂，充分混合，抽真空过滤后制得测量品溶解液。
4)标准样品制备：将已知含量的牛血清白蛋白溶于步骤1中制备的测量品溶解液，通过不同体积的稀释，制备成0.01mg/ml-5mg/ml范围内的梯度标准样品。
本发明另外一方面还提供了所述适用性广泛的蛋白定量检测试剂盒运用于蛋白含量检测中的方法，包括以下步骤：
I.待测样品制备：将待测品原料与不同体积的测量品溶解液充分混合，分散均匀，制成合适浓度梯度的待测样品；
进一步地，所述待测品原料为含蛋白的动、植物原料或衍生品，包括未经提纯处理和未经处理的含蛋白原料。
II.工作液制备：取所述检测试剂盒中的试剂A和试剂B，按照体积比1：20-1：
60充分混合，作为工作液。
III.空白样品制备：将含蛋白浓度0mg/ml的所述检测试剂盒中的测量品溶解液作为空白样品。
IV.将步骤B中制备的工作液分别与步骤I的待测样品、步骤III的空白样品以及所述检测试剂盒中的标准样品分别以10：1的体积进行混合，分别记为样品a、b、c；其中加入的待测样品中蛋白含量理论上要在本试剂盒的测量的线性范围内，如果浓度过高或过低需要进行稀释或浓缩操作，再进行混合。
进一步地，在混合前，对所述待测样品浓度进行预估，并进行稀释或浓缩，使浓度在试剂盒测定的浓度范围5-2000ug/ml之内；对于蛋白含量无法预估的待测样品，通过预实验预测蛋白含量。
V.经步骤IV中处理的样品a、b、c置于37-80℃的震荡设备中低速震动5-35分钟，或37-80℃水浴5-35分钟孵育。
VI.孵育处理后的样品使用分光光度计在562nm波长下测量吸光度值。
VII.根据步骤VI中的吸光度值，及所述检测试剂盒中标准样品的已知浓度值，得到标准样品与吸光度值间的拟合方程①，并可以通过方程②计算待测样品中蛋白的含量：
①标准样品中蛋白含量＝X×吸光度值2+Y×吸光度值+Z，
②待测样品中蛋白含量＝(X×吸光度值2+Y×吸光度值+Z)×W，
进一步地，X、Y、Z为方程①中已知的拟合常数，W为所述步骤IV中所述待测样品稀释的倍数，例如稀释了4倍，W＝4；浓缩了4倍，W＝1/4。
本发明的有益效果为：
本发明属于双缩脲尿比色法的改良，能对脂溶性、疏水性强的或疏水亲水混合性蛋白样品快速定量，同时标准液具有细菌防腐性，可长期冷藏放置。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的实施例1中标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值拟合的曲线；
图2为本发明提供的实施例2中标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值拟合的曲线；
图3为本发明提供的实施例3中不同时间条件下标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值拟合的曲线；
图4为本发明提供的实施例3中标准样品摇床反应1小时和2小时后的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1
(1)制备试剂A、试剂B及测量品溶解液
试剂A：称取终浓度(w/v)0.5％的侧链烷基一取代胆酸盐、(v/v)0.35％的乙基苯基聚乙二醇，加入二喹啉甲酸、氢氧化钠，使其摩尔浓度分别为52mM、83mM，调PH至碱性。抽真空过滤，得到澄清的溶液A。
试剂B：将硫酸铜颗粒、酒石酸钠，碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠溶于去离子水中，使其摩尔浓度分别为150mM、2mM、120mM、100mM、83mM。过滤后得到澄清的溶液B。
称取氯化钠固体，溶于去离子水中，使其摩尔浓度为124mM，再加入终浓度(v/v)0.02％的叠氮化钠，充分混合，抽真空过滤后制得测量品缓冲液。
(2)样品制备
将含蛋白浓度0mg/ml的测量品缓冲液作为空白样品。
将20mg的牛血清白蛋白溶于10ml的测量品缓冲液中，充分溶解，按照如下表1方法对该蛋白浓度进行梯度稀释，使蛋白浓度处于0.025mg/ml-2mg/ml的范围内，作为标准样品。
表1：
将未知浓度含脂肪的小鼠组织裂解液，用测量品缓冲液稀释20倍，制成待测样品。
(3)取3ml的步骤(1)中的试剂A，加入60ul步骤(1)中的试剂B，充分混合，制成工作液。
(4)取步骤(2)中三个样品各25ul于三个微孔板中，分别加入步骤(3)制成的工作液200ul。
(5)将上步处理样品充分混合，置于60℃摇床低速震动10分钟。
(6)取出微孔板使用分光光度计在562nm波长下测量实例步骤(5)中处理后样品的吸光度值。
(7)根据如下表2中的吸光度值，得到标准样品与吸光度值间的拟合方程①，并可以通过方程②计算待测样品中蛋白的含量：
①标准样品中蛋白含量＝160.6×吸光度值2+495×吸光度值-48.505
②待测样品中蛋白含量＝(160.6×吸光度值2+495×吸光度值-48.505)×20＝18.9mg/ml；
其中，稀释倍数＝20。
表2：
(8)根据表2标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值，拟合的曲线如附图1所示。
如(7)中结果所示，R平方(回归平方和与总离差平方和的比值)值为0.9993，介于0～1之间，接近1，回归拟合效果优。
实施例2
(1)制备试剂A、试剂B及测量品溶解液
称取终浓度(w/v)1％的侧链烷基一取代胆酸盐、(v/v)0.2％的乙基苯基聚乙二醇，加入二喹啉甲酸、氢氧化钠，使其摩尔浓度分别为80mM、105mM，调PH至碱性。抽真空过滤，得到澄清的溶液A。
将硫酸铜颗粒、酒石酸钠，碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠溶于去离子水中，使其摩尔浓度分别为250mM、10mM、155mM、123mM、105mM。过滤后得到澄清的溶液B。
称取氯化钠固体，溶于去离子水中，使其摩尔浓度为124mM，再加入终浓度(v/v)0.02％的Proclin300，充分混合，抽真空过滤后制得测量品缓冲液。
(2)样品制备
将含蛋白浓度0mg/ml的测量品缓冲液作为空白样品(blank)。
将20mg的牛血清白蛋白溶于10ml的测量品缓冲液中，充分溶解，按照表1方法对该蛋白浓度进行梯度稀释，使蛋白浓度处于0.025mg/ml-2mg/ml的范围内，作为标准样品。
将未知浓度含脂肪的小鼠组织裂解液，用测量品缓冲液稀释20倍，制成待测样品。
(3)取5ml步骤1中试剂A，加入150ul步骤1中试剂B，充分混合，制成工作液。
(4)取步骤(2)中三个样品各25ul于三个微孔板中，分别加入步骤(3)制成的工作液200ul。
(5)将上步处理样品充分混合，置于37℃水浴30分钟。
(6)取出微孔板使用分光光度计在562nm波长下测量实例步骤(5)中处理后样品的吸光度值。
(7)根据如下表3中的吸光度值，得到标准样品与吸光度值间的拟合方程③，并可以通过方程④计算待测样品中蛋白的含量：
③标准样品中蛋白含量＝158.78×吸光度值2+518.98×吸光度值-52.888
④待测样品中蛋白含量＝(158.78×吸光度值2+518.98×吸光度值-52.888)
×20＝19.4mg/ml，其中稀释倍数＝20。
表3：
(8)根据表3标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值，拟合的曲线图如附图2所示。
如步骤(7)中结果所示，R平方(回归平方和与总离差平方和的比值)值为0.9995，介于0～1之间，接近1，回归拟合效果优。
实施例3
(1)制备试剂A、试剂B及测量品溶解液
称取终浓度(w/v)0.1％的侧链烷基二取代胆酸钠和侧链烷基三取代胆酸钠、(v/v)0.2％的乙基苯基聚乙二醇，加入二喹啉甲酸、氢氧化钠，使其摩尔浓度分别为52mM、83mM，调PH至碱性。抽真空过滤，得到澄清的溶液A。
将硫酸铜颗粒、酒石酸钠，碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠溶于去离子水中，使其摩尔浓度分别为150mM、2mM、120mM、100mM、83mM。过滤后得到澄清的溶液B。
称取氯化钠固体，溶于去离子水中，使其摩尔浓度为180mM，再加入终浓度(v/v)0.1％的叠氮化钠，充分混合，抽真空过滤后制得测量品缓冲液。
(2)样品制备
将含蛋白浓度0mg/ml的测量品缓冲液作为空白样品(blank)。
将20mg的牛血清白蛋白溶于10ml的测量品缓冲液中，充分溶解，按照表1方法对该蛋白浓度进行梯度稀释，使蛋白浓度处于0.025mg/ml-2mg/ml的范围内，作为标准样品。
将未知浓度的含脂肪的小鼠组织裂解液，用测量品缓冲液稀释20倍，制成待测样品。
(3)取3ml的步骤(1)中的试剂A，加入120ul步骤(1)中的试剂B，充分混合，制成工作液。
(4)取步骤(2)中三个样品各25ul于三个微孔板中，分别加入步骤(3)制成的工作液200ul。
(5)将上步处理样品充分混合，置于40℃摇床低速震动分别于0.5小时、1小时、2小时、4小时测量吸光度。
(6)取出微孔板使用分光光度计在562nm波长下测量实例3-5中处理后样品的吸光度值。
(7)根据如下表4中的吸光度值，得到标准样品与吸光度值间的拟合方程⑤：
⑤标准样品中蛋白含量＝X×吸光度值2+Y×吸光度值+Z
表4：
0.5h吸光度值 1h吸光度值 2h吸光度值 4h吸光度值
Blank 0.101 0.109 0.122 0.144
标准样品1 0.148 0.172 0.207 0.26
标准样品2 0.323 0.394 0.495 0.632
标准样品3 0.518 0.639 0.801 1.019
标准样品4 0.842 1.048 1.308 1.663
标准样品5 1.164 1.43 1.777 2.226
标准样品6 1.447 1.779 2.191 2.652
标准样品7 1.96 2.378 2.81 3.088
标准样品8 2.331 2.732 3.07 3.166
R2 0.9998 0.9997 0.9996 0.9993
(8)根据表4标准样品蛋白已知浓度值和测量吸光度值，拟合的曲线如附图3所示。如步骤(7)中结果所示，R平方(回归平方和与总离差平方和的比值)值分别为为0.9998、0.997、0.996、0.993，介于0～1之间，均接近1，回归拟合效果优。说明标准样品稳定性好。
(9)40度摇床反应1小时、2小时后对应的颜色信号情况如附图4所示。
不同反应时间后，颜色信号梯度明显，附图为实际实验效果图。
实施例4
根据实施例1中所示的方法制备试剂A、试剂B、测量品溶解液、空白样品、标准样品、待测样品(含脂肪的小鼠组织裂解液)，并组成相应试剂盒。将新配制的上述试剂盒、放置半年后的上述试剂盒以及放置一年后的上述试剂盒分别用于检测实施例1所述的待测样品中的蛋白含量，所述待测样品中的蛋白含量测定结果在表5中示出。
表5：
*P>0.05表明放置半年后的试剂盒和放置一年后的试剂盒,与新配制的试剂盒测得的结果相比所测定的结果在统计学上无显著差异。
从表5中的结果可以看出，本发明所述的试剂盒在放置1年后仍然能够准确检测出样品中的蛋白含量，测定结果稳定可靠。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。

Claims (9)

1.一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂A、试剂B、测量品溶解液、标准样品，其中：
所述试剂A为包括侧链烷基取代胆酸盐、乙基苯基聚乙二醇、二喹啉甲酸及碱的混合溶液；
所述试剂B为包括硫酸铜水溶液，酒石酸钠、碱及缓冲溶液的混合溶液，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种；
所述测量品溶解液为氯化钠与防腐剂的混合溶液；
所述标准样品为溶解于所述测量品溶解液中含牛血清白蛋白的水溶液；
所述试剂A中所述侧链烷基取代胆酸盐如下结构式：
；
其中，所述结构式的侧链烷基取代胆酸盐为以下物质的一种或多种：R1-R6号位烷基单取代胆酸盐，R1-R6号位烷基二取代胆酸盐，R1-R6号位烷基三取代胆酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A中所述侧链烷基取代胆酸盐终浓度为0.1-4% g/L，所述乙基苯基聚乙二醇体积终浓度为0.2-0.35%，所述二喹啉甲酸为40-80mM。
3.根据权利要求1所述的一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂B中所述硫酸铜水溶液为150-300mM，所述酒石酸钠溶液为2-20mM，所述缓冲溶液为碳酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述测量品溶解液中：所述氯化钠为100-180mM，所述防腐剂为叠氮化钠、proclin300中的一种，所述防腐剂体积终浓度为0.01%-0.1%。
5.根据权利要求1所述的一种适用广泛的蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品浓度为0.01-5mg/ml。
6.权利要求1-5任一项所述蛋白定量检测试剂盒在蛋白含量检测中的应用。
7.应用权利要求1-5任一项所述蛋白定量检测试剂盒检测蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 空白样品制备：将所述检测试剂盒中测量品溶解液作为空白样品；
S2. 待测样品制备：将待测品稀释或浓缩，再与所述检测试剂盒中测量品溶解液按照不同的体积比充分混合，分散均匀，制成不同浓度梯度的待测样品；
S3. 标准样品制备：将牛血清白蛋白溶于所述检测试剂盒中测量品溶解液，通过不同体积的稀释，制备成0.01-5mg/ml范围内的梯度标准样品；
S4. 工作液制备：取所述检测试剂盒中的试剂A和试剂B，按照体积比1：20-1：60充分混合，作为工作液；
S5. 将S4中制备的工作液分别按体积比10：1分别加入所述步骤S1中的空白样品、所述步骤S2中的待测样品、所述步骤S3中标准样品中；
S6. 经S5中处理的样品分别置于37-80℃环境孵育5-35分钟；
S7. 取出S6中处理后的样品使用分光光度计在562nm波长下分别测量各样品的吸光度值；
S8. 根据S7中的吸光度值，及S3中标准样品的已知浓度值，得到标准样品与吸光度值间的拟合方程①，并可以通过方程②计算待测样品中蛋白的含量，所述方程：
①标准样品中蛋白含量=X×吸光度值2+Y×吸光度值+Z
②待测样品中蛋白含量=（X×吸光度值2+Y×吸光度值+Z）×W，
其中X、Y、Z为方程①中已知的拟合常数，W为步骤S2中样品进行的稀释倍数。
8.根据权利要求7中所述检测试剂盒检测蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤S2中待测样品为含蛋白的动、植物原料或衍生品；所述待测样品需稀释或浓缩至5-2000ug/ml。
9.根据权利要求7中所述检测试剂盒在检测蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤S6为在37-80℃的震荡设备中低速震动5-35分钟，或37-80℃水浴5-35分钟。
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