明 細 書
蛋白質の固定化方法及び定量方法 技術分野
本発明は、 固相への蛋白質の新規な固定化方法、 それを用いた蛋白質 の定量方法、 ィムノブロッテイング方法並びに蛋白質固定化用試液、 更 には該固定化方法を用いた異常型プリオン蛋白質の検出方法及びプリォ ン病 (特に牛海綿状脳症、 Bovine Spongiform Encephalopathy, 以下 BSEと略記する。) の判定方法等に関するものである。 技術背景
蛋白質の定量は、 従来、 溶液内で蛋白質の化学的反応性の高い部分と 蛋白質反応試液とを反応させたり [Lowry,O.H.et al., J.Biol.Chem., 193: 265-275 (1951)、 Smith,P.K. et al., Anal.Biochem., 150:76-85 (1985)]、 蛋白質と特異的に吸着する色素試液と反応させることで [Bradford,M., Anal.Biochem., 72: 248-254 (1976)、 Watanabe,N. et al" Clin.Chem., 32:1551-1554 (1986)]、 溶液の吸光度を変化させ、 その吸 光度変化に基づいて測定する方法、 いわゆる液相法が主流であった。 し かしながら、 生化学的サンプルには、 通常、 蛋白質の他、 非蛋白質性生 体成分や緩衝剤、 塩類、 酸化防止剤、 キレート剤、 糖類、 有機溶媒、 人 エボリマ一、 界面活性剤等多数の物質が共存しており、 多くのサンプル では、 これらの共存物質が原因となって蛋白質と蛋白質測定試液の相互 作用 (反応 ·結合) を阻害し、正確な蛋白質の測定ができない場合が多々 ある。 そこで、 蛋白質を膜等の固相面に吸着させ、 上記共存物質のよう な蛋白質測定に対する阻害物質を洗い流し、 固相面に滞留した蛋白質を 蛋白質測定試液で反応させ定量する方法、 いわゆる固相化法が開発され
た [Kuno, H. et al., Nature, 215:974-975 (1967) 、 Gates,R., Anal.Biochem., 196:290.295 (1991) 、 Said'Fernandez'S.et al., Anal.Biochem. 191: 119- 126 (1990)、 Ghosh,S. et al., Anal.Biochem. 169:227-233 (1988)、 Lim,M.K. et al., BioTechniques 21 :888.895 (1996)]。
しかしながら、 これらの蛋白質の膜固定化方法は、 阻害物質を除去す ることはできるが、一定の割合で蛋白質を膜に固定化することができず、 やはり正確な蛋白質の定量を行えないため、問題解決には至っていない。 一方で、蛋白質の固定化法として蛋白質変性 'チャージ中和作用のある トリクロ口酢酸や酢酸溶液、 酢酸 Zメタノール溶液を夫々固定化溶液と して用いる方法が古くから行われている。 しかし、 蛋白質によっては十 分な固定化ができない場合があるため、 蛋白質の測定を定量的に行えな い。 そのため、 新たな蛋白質の固定化/定量方法の開発が望まれている 現状にあった。 ところで、 BSE、 ヒッジのスクレイピー及びヒトのクロイツフェル ト ·ヤコブ病に代表されるプリオン病は、プリオン蛋白質(Prion Protein, 以下、 PrP と略記する。) が異常化し、 脳の組織がスポンジ状になり、 運動失調などの神経症状を引き起こす病気である。 PrPの遺伝子自体は ゥシだけでなく、 ヒトゃヒッジ、 ネコ等、 ほ乳類が普通に持っている。 正常な個体の正常組織に存在する PrP (以下、 正常型 PrPと記載する。) は、 プロティナ一ゼ Kで容易に分解される。 しかし、 BSE等の疾患でみ られる PrPは、 蛋白質分解酵素や、 加熱、 紫外線照射などの物理化学的 処理にも抵抗性であるという特徴を有する (この PrP を以下、 異常型 PrPと記載する)。 BSEでは、 この異常型 Ρι'Ρが脳内に蓄積され、 細胞 が死滅することで脳がスポンジ状になり神経障害を引き起こすことが知
られている。
プリオン病の判定は、 異常型 PrP を検出することにより行われるが、 異常型 PrP の検出方法としては、 ELISA法とウェスタン · ブロット法 が知られている。
ELISA法による異常型 PrPの検出方法は、 まず被検試料中の PrPの うち正常型 PrP を酵素処理等により分解し、 異常型 PrP のみにしたの ち、 ELISE用プレートに結合した抗 PrP抗体 (一次抗体)、 次いで標識物 質で標識した抗 PrP抗体 (二次抗体)と反応させ、 異常型 PrPに結合した 抗 PrP抗体の標識を発色させて測定するというものである。 この方法で は、異常型 PrPのみと抗 PrP抗体を結合させるために、予め正常型 PrP と他の蛋白質を完全に分解させる必要があるが、実際には正常型 PrPや その他の蛋白質が完全には分解されずに、 残ったこれらの蛋白質が抗 PrP抗体と結合する場合があり (偽陽性判定がされる原因)、異常型 PrP を特異的に検出することが困難であるという問題がある。
またウエスタン,プロット法による判定方法は、 ELISA法の場合と同 様に被検試料中の PrP のうち正常型 PrP を分解した後、 電気泳動を行 う。 分離した電気泳動分画をシートに転写し、 異常型 PrPと結合して発 色する試薬を添加し、 その発色を測定する方法である。 この方法では、 電気泳動を行うことで、 被検試料中の蛋白質を分子量別に分類できるの で、 被検試料中に正常型 PrPやその他の蛋白質があつたとしても、 異常 型 PrP画分だけを判別することが出来る。 しかしながら、 ウェスタン - プロット法では、 電気泳動の結果を得るために数時間を要し、 また一度 に泳動できる検体数が限られているという問題がある。
そのため、 より迅速且つ精度の高い異常型 PrPの検出方法及びプリォ ン病の判定方法が望まれている現状にあった。
本発明は、 これら上記した如き状況に鑑みなされたもので、 従来の固 相化法では容易に固定化できなかった試料中の蛋白質を固相に固定化で き、 且つ試料中に共存する阻害物質の影響を軽減して蛋白質の定量的測 定 /検出を行うことができる固定化方法、 それを用いた蛋白質の定量方 法、 ィムノブロッテイング方法並びに蛋白質固定化用試液、 更には該固 定化方法を用いた異常型 PrP の迅速且つ精度の高い検出方法及びプリ オン病 (特に BSE) の判定方法等を提供することを課題とする。 発明の開示
本発明は、 上記課題を解決する目的でなされたものであり、 以下の構 成よりなる。
( 1 ) 低級アルコールと、 ハロゲノカルボン酸及び/又は長鎖アルキル 硫酸塩の共存下で、 蛋白質を、 疎水性表面を有する固相と接触させるこ とを特徴とする、 当該蛋白質の当該固相への固定化方法。
( 2 )上記 (1)の方法により蛋白質が固定化された固相に蛋白質染色液を 接触させ、 それにより生じた発色の程度に基づいて行うことを特徴とす る、 蛋白質の定量方法。
( 3 )上記(1)の方法により蛋白質が固定化された固相を用いることを特 徴とする、 ィムノブロッテイング方法。
( 4 )異常型 PrPを含有する被検試料を、上記 (1)の方法により処理して 異常型 PrP を当該固相に固定化させた後、 異常型 PrP に結合し得る抗 体を反応させ、 それにより生じた抗原抗体複合物の量を測定し、 その結 果に基づいて行うことを特徴とする、 異常型 PrPの検出方法。
( 5 )上記 (4)の方法により異常型: PrP蛋白質を検出し、その結果に基づ いて行う、 プリオン病の判定方法。
( 6 ) 低級アルコールと、 ハロゲノカルボン酸及び Z又は長鎖アルキル
硫酸塩とを含有する、 蛋白質固定化用試液。
( 7 ) 低級アルコ一ルと、 ハロゲノカルボン酸及び/又は長鎖アルキル 硫酸とを含有する固定化用試液 1、 (2)低級アルコール、 八口ゲノカルポ ン酸及び非イオン性界面活性剤を含有する固定化用試液 2、及び (3)異常 型 PrPと特異的に結合し得る標識抗体、 を構成試薬として含有してなる、 異常型 PrP検出用キット。 即ち、 本発明者等は、 従来の固相化法では蛋白質の固定化がうまく行 かない要因について検討を行ったところ、 その最大の要因は、 蛋白質を 固相に固定化する段階で、 目的の蛋白質を充分に (一定の割合で) 固相 に固定化できないために、 蛋白質の定量的な測定が行えないのが原因で あるということを見出した。
そこで、 固定化を効率よく行う方法について更に検討を行った結果、 エタノール等の低級アルコール類と、 トリクロロ酢酸等のハロゲノカル ボン酸の共存下に蛋白質の固定化を行うと、 固相に蛋白質を充分に固定 化できることを見出した。
また、 界面活性剤のうち、 長鎖アルキル硫酸塩が蛋白質の固定化にュ 二一クな特性を持つことを見出した。 即ち、 長鎖アルキル硫酸塩を、 低 級アルコール、 又は低級アルコールとハロゲノカルボン酸とが存在する 条件下で蛋白質の固定化を行うと、蛋白質の吸引'ろ過を行う過程で、蛋 白質に何らかの影響を及ぼし、 その結果、 蛋白質の膜吸着を促進し安定 化する一方、 阻害物質等の共存物質を膜固相面から排除するように働く (阻害物質の膜滞留を抑える) ことが明らかとなった。 長鎖アルキル硫 酸塩のこうした働きは、 蛋白質含有固定化用試料溶液をマイクロプレー トウエル等の固相面に静置した場合でも起こり得る。
一般的に非イオン性界面活性剤等の界面活性剤は、 疎水性物質の吸着 を阻害する性質を有しており、 一方、 蛋白質と膜の結合は疎水結合によ ると考えられている。 そのため、 これまで界面活性剤が蛋白質の固定化 時に好んで用いられることはなく、 それ故に界面活性剤の持つ蛋白質に 対する作用と、 作用を受けた蛋白質の固相面に対する相互作用を詳細に 論じた報告は殆ど無い。 そのため、 界面活性剤の一種である長鎖アルキ ル硫酸塩が、 蛋白質の固定化に有効であるということは今まで知られて いなかった。
従って、 長鎖アルキル硫酸塩を、 従来から蛋白質固定化に用いられて いた低級アルコール類、 若しくは低級アルコールとハロゲノカルボン酸 と共存させることで、蛋白質を充分に固相に固定化できるということは、 本発明者らが初めて見出したことである。 更に、 従来の固相法では界面 活性剤が共存する試料中の蛋白質を効率よく固定化することができなか つたため、 このような試料については蛋白質の定量も行えなかったが、 本発明の固定化法によれば、 そのような試料中の蛋白質も効率よく固定 化することができ、 極めて有効な、 利用価値の高い蛋白質固定化方法を 完成した。 更に、 当該蛋白質固定化方法を用いて異常型 PrPを検出し、 その結果 を基にプリオン病の判定を行えば、 従来の ELISA法やウェスタン · ブ ロット法よりも迅速で高精度の判定が行えるのではないかと考え、 鋭意 研究の結果、 従来の組織試料の調製方法及び本発明に係る蛋白質固定化 方法を利用することによって、 従来の ELISA法に比較して偽陽性が出 ずに精度良く判定が行え、 また従来のウエスタン · ブロット法に比較し て判定に要する時間を 1 / 3に短縮することができることを見出し、 本 発明を完成した。
尚、 本発明に於いて、 蛋白質の固定化法という場合、 蛋白質を固相に 固定化する方法をいい、 固相法による蛋白質の測定又は定量という場合 は、 本発明に係る固定化方法で蛋白質を固相に固定化した後、 蛋白質の 測定又は定量を行うことを意味する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において得られた、 各固定化用試料中の蛋白質を固 定化したポリビニリデンジフロラィド膜 (PVDF膜) を Pyromolex試液 で染色した後、 600nmにおける吸光度 (シグナル強度) を測定した結果 を示す。
図 2は、 実施例 2に於いて得られた、 各固定化用試料中の蛋白質を固 定化した PVDF膜を Pyromolex試液で染色した後、 600nmにおける吸 光度 (シグナル強度) を測定した結果を示す。
図 3は、 実施例 3に於いて得られた、 各固定化用試料中の蛋白質を固 定化した PVDF膜を Pyromolex試液で染色した後、 600nmに於ける吸 光度 (シグナル強度) を測定した結果を示す。
'図 4は、 実施例 4に於いて得られた、 各固定化用試料中の蛋白質を固 定化した PVDF膜を Pyromolex試液で染色した後、 600nmに於ける吸 光度 (シグナル強度) を測定した結果を示す。
図 5は、 実施例 5に於いて得られた、 蛋白質試料として卵白アルブミ ン (OVA) を用いて、 PVDF膜に固定化、 定量を行って得られた検量線 を示す。
図 6は、 実施例 6に於いて得られた、 固相法により蛋白質を測定した 結果又は液相法により蛋白質を測定した結果に基づいて得られた相対値 を示す。
図 7は、 実施例 7に於いて得られた、 ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)
を含有しない IgG試料又は SDS含有する IgG試料を蛋白質試料として 用い、 本発明に係る固定化、 蛋白質の定量を行って得られた検量線を示 す。
図 8は、 実施例 1 0に於いて得られた、 ィムノブロッテイングの結果 を示し、 Aは PVDF膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発光反応に より行い、 X 線フィルムに感光させ検出したものである。 Bは、 PVDF 膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発色反応により行い、 検出した ものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係る低級アルコールとしては、 メタノール、 エタノール、 プ 口パノ一ル等が挙げられ、中でもエタノール又はメ夕ノ一ルが好ましい。 本発明に係るハロゲノカルボン酸のハロゲン原子としては、 臭素、 フ ッ素、塩素等が挙げられ、中でも塩素が好ましい。カルボン酸としては、 酢酸、 プロピオン酸等が挙げられ、 中でも酢酸が好ましい。 このような ハロゲノカルボン酸としては、 例えばトリクロ口酢酸 (TCA)、 トリフ ロロ酢酸 (TFA) 等が挙げられる。 本発明に係る長鎖アルキル硫酸塩の長鎖アルキル基としては、 炭素数 7〜25のものが好ましく、 中でも 8〜: 15が好ましい。 より好ましくはド デシル基である。 また、 硫酸塩としては、 ナトリウム塩、 カリウム塩等 が好ましく、 中でもナトリウム塩が好ましい。 このような長鎖アルキル 硫酸塩の具体例としては、 例えばドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 等が 挙げられる。 本発明に係る固定化方法に於いて、 蛋白質を低級アルコールと、 ハロ
ゲノカルボン酸及び/又は長鎖アルキル硫酸塩と共存させる方法として は、 蛋白質を、 疎水性表面を有する固相と接触させる際に、 当該蛋白質 が低級アルコールと、 ハロゲノカルボン酸及び Z又は長鎖ァルキル硫酸 塩と共存している状態にできるものであれば、どのような方法でも良い。 例えば、 (1) 蛋白質を含有する試料と、 低級アルコールを含有する溶 液と、 八ロゲノカルボン酸を含有する溶液及び Z又は長鎖アルキル硫酸 塩を含有する溶液を混合する方法、 (2) 蛋白質を含有する試料と、 低級 アルコールと、 ハロゲノカルボン酸及び z又は長鎖アルキル硫酸塩を直 接混合する方法等が挙げられるが、 特に限定されるものではない。 低級アルコールを含有する溶液、 長鎖アルキル硫酸塩を含有する溶液 及びハロゲノカルボン酸を含有する溶液を調製する際に用いられる溶液 としては、 例えば精製水、 緩衝液等が挙げられ、 緩衝液を構成する緩衝 剤としては、 例えば MOPS,HEPES等のグッド緩衝剤、 トリス (Tris) 緩衝剤、 リン酸緩衝剤、 ベロナ一ル緩衝剤、 ホウ酸緩衝剤等、 通常この 分野で用いられている緩衝剤が挙げられるが、 なるべく蛋白質の固定化 や測定に対する影響を回避するために、 精製水を用いるのが好ましい。 蛋白質と疎水性表面を有する固相とを接触させる固定化用試料中の各 試薬の好ましい濃度としては 低級アルコール濃度が 30〜50 V/V%、 好 ましくは 35〜50W/V%、 ハロゲノカルボン酸濃度が 0.08〜: 10W/V%、 好 ましくは 0.5〜 5 W/V%、 長鎖アルキル硫酸塩濃度が 0.1〜 1 W/V%、 好 ましくは 0.:!〜 0.4W/V%である。 本発明に係る疎水性表面を有する固相とし tは、 例えば疎水性表面を 有する膜、 疎水性表面を有するプレート等が挙げられる。 疎水性表面を 有する膜の具体例としては、 例えば疎水性膜であるポリビニリデンジフ
口ライド膜 (PVDF 膜)、 ニトロセルロース膜、 濾紙等が挙げられ、 疎 水性表面を有するプレートの具体例としては、 例えば通常 ELISA等で よく用いられるプラスッチックプレート等が挙げられる。 蛋白質を、 疎水性表面を有する固相と接触させる方法としては、 上記 方法により調製した、 蛋白質と、 低級アルコールと、 ハロゲノカルボン 酸及び/又は長鎖アルキル硫酸塩を含有する固定化用試料を、 当該疎水 性表面を有する固相と接触させればよい。 例えば固定化用試料を当該固 相上に滴下する、 塗布する等の方法がある。 当該固相として疎水性膜を用いる場合には、 当該疎水性膜上に当該固 定化用試料を滴下等した後、 静置して当該疎水性膜に当該固定化用試料 を浸透させるか、 又は固定化用試料を、 当該疎水性膜を通して吸引濾過 する、 通常のフィルトレーシヨン法、 或いは遠心濾過法による方法を用 いれば良い。 フィルトレ一ション法による蛋白質の固定化方法を、 市販のドッ卜ブ ロッターもしくはスロットブロッタ一を用いる方法を例に挙げて具体的 に説明すると、 以下の通りである。
まず、 メタノール、 次いで蒸留水に浸した PVDF膜等の疎水性膜及び 要すればその上に蒸留水に浸した濾紙となるようにドットプロッタ一に セットする。 次に、 一定量の蛋白質と低級アルコール、 長鎖アルキル硫 酸塩及び Z又は八ロゲノカルボン酸を含有する固定化用試料 (最大 400 L) をドッ トブロッターのゥエルにアプライし、 真空ポンプで、 約 15Kpa 程度の引圧でゆっくり吸引する (フィルトレーシヨンする) と、 固定化用試料中の蛋白質は PVDF膜に吸着される。固定化試料を完全に
吸引した後、 洗浄液を各ゥエルにアプライし、 吸引する。 次いで、 ドッ トブロッターから PVDF膜を取り出し、 ペーパー夕オル、 濾紙等の上に 乗せ、 約 30分以上かけて真空乾燥を行う。 蛋白質が吸着し易いか否かは、 その蛋白質の疎水性と固相膜面の疎水 性の関係により決まる。 例えばその条件下で吸着し易い蛋白質は、 速く 吸引した場合も十分吸着されるが、 中程度もしくは弱い吸着性しか示さ ない蛋白質の吸着の程度は吸引速度に大きく影響される。 従って、 目的 の蛋白質を十分吸着させるためには、 一般にゆつくり吸引することが好 ましい。 例えば 10分以上をかけて吸引することが好ましい。 当該固相として、 疎水性表面を有するプレートを用いる場合には、 例 えば当該プレート上に当該固定化用試料を滴下又は塗布等した後、 静置 して自然乾燥させる方法等を行えばよい。 蛋白質の定量を行うには、 蛋白質を固定化した固相を通常の蛋白質定 量方法に付し、 試料中の蛋白質量を測定すればよい。 本発明に係る蛋白質の定量方法としては、 上記方法により蛋白質を固 相に固定化させた後、 蛋白質染色液として例えばアミノブラック、 ピロ ガロールレッド -モリブデン酸複合体(Pyromolex)溶液を用いた方法、 クマシ一ブリリアントブルー (CBB)-G250 を用いたブラッドフォード 法、 ビシンコニン酸を用いた BCA法等によって染色を行い、 生じた発 色の程度を測定することによって行う、 自体公知の蛋白質測定方法によ つて測定を行えばよい。
実際の定量には、 測定しょうとする蛋白質毎に、 蛋白質濃度既知の蛋 白質試料を用いて同様に固定化、 染色、 測定を行い、 検量線を作成して おく。 そして、 その検量線をもとに、 試料中の蛋白質濃度を決定する。 例えば、 Pyromolex 発色法による定量方法を例にとって説明すると、 先ず、蛋白質試料中の蛋白質を本発明の方法により PVDF膜に固定化さ せた後、 PVDF膜を精製水又はリン酸緩衝食塩水 (PBS) 等の緩衝液で 洗浄する。 要すれば室温で 30分程度真空乾燥させた後、 Pyromolex含 有染色試液に 20〜35分程度浸漬させて、 発色させる。 その後、 デンシ トメ一ター、 CCDカメラ等により 600nmの吸光度を測定する。 得られ た吸光度を、予め濃度既知の蛋白質試料を用いて同様に蛋白質の固定化、 測定を行って得られた検量線から、 蛋白質の濃度を決定すればよい。 尚、 蛋白質の固定化、 蛋白質濃度測定通の各工程の間に固相の洗浄処 理操作を行うのは任意であるが、 行うことが好ましい。 その際の洗浄液 としては、 精製水又は PBS等の緩衝液等が用いられる。 本発明に係るィムノブロッティング方法としては、 本発明の方法によ つて固相に蛋白質を固定化させる以外は、 当該蛋白質に対する抗体ゃ標 識抗体を用いて抗原抗体反応による当該蛋白質の測定 検出を行う、 通 常のィムノブロッテイング方法が適用できる。 本発明に係る固定化方法 を行えば、 蛋白質を効率的に固相に固定化できるので、 本発明に係るィ ムノブロッテング方法によれば、 従来よりも感度よく蛋白質の検出及び 分析を行うことができる。 本発明の固定化方法によって固定化できる蛋白質は、 従来の固相化法 によって固定化されていた蛋白質は全て挙げられるが、 例えば血液、 血
清、 血漿、 髄液等の各種体液や尿、 リンパ球、 血球、 細胞類等の生体由 来の試料中に含まれる蛋白質が挙げられる。
具体的には、 例えばリゾチーム, チトクロ一ム c、 DNase 等の酵素、 IgG、 IgM、 IgE等の抗体、 フイブリノ一ゲン等の糖蛋白質、 ゥシ血清ァ ルブミン (BSA) , ヒト血清アルブミン (HAS) 等の血清蛋白質、 卵白 アルブミン (OVA) , PrP 等の蛋白質、 トリプシンインヒビ夕一等のィ ンヒビ夕一、 インシュリン等のホルモン等が挙げられるが、 これらに限 定されるものではない。 尚、 本発明は、 例えば従来の固相化法では固相に充分固定化できなか つたチトクローム c等の塩基性蛋白質をも固定化することができ、 蛋白 質の定量を行える点で、 特に有効である。 本発明に係る蛋白質の固定化方法に於いて、 固相に固定化できる蛋白 質の濃度上限は、 例えば、 固相が膜の場合約 500 Z gZcm2 程度、 固相 がマイクロプレートの場合約 10 g/cm 2 程度であるので、 固定化用試 料中の蛋白質の量は、 固定化する固相の種類に応じて、 その最大保持能 を超えないように、 調製することが望ましい。 本発明に係る異常型 PrPの検出方法は、 異常型 PrP を含有する被検 試料を、本発明に係る蛋白質の固定化方法により処理して異常型 PrPを 当該固相に固定化させた後、 異常型 PrP に結合し得る抗体を反応させ、 それにより生じた抗原抗体複合物の量を測定し、 その結果に基づいて行 う方法である。 本発明に係る異常型 PrP の検出方法に用いられる異常型 PrP を含有
する被検試料の調製方法は、 従来の BSE の判定方法に於いて行われて いる、 動物組織由来の試料の調製方法に従って行ってもよい。 即ち、 異常型 PrPを検出すべき動物組織を、 適当な緩衝液や糖類溶液 中でホモジナイズし、得られたホモジネートをプロティナーゼ Kで処理 して正常型 PrPを分解させる。次いで反応物に蛋白質沈降剤を加えて異 常型 PrPを沈殿させ、 沈殿物を適当な溶媒 (緩衝液、 尿素水溶液等) に 溶解して、 ELISA又はウェスタン ·ブロッティングに付すという方法で ある。 但し、下記工程による調製方法で異常型 PrPを検出すべき動物組織を 処理すれば、 上記した従来法よりも、 効率よく動物組織から異常型 ; PrP を抽出することが出来る。
即ち、
1 )異常型 PrPを検出すべき動物組織を界面活性剤の存在下に破砕処理 する工程、
2 ) 不溶物を除去する工程、
3 ) 上清に分解酵素を加えて正常型 PrPを分解する工程、
4 ) 異常型 PrPを沈降させる工程、
5 ) 沈降物を回収したのち、 沈降物の溶液を得る工程、
である。 上記工程 1 ) に於いて用いられる界面活性剤としては、 SDS、 ラウリ ルベンゼンスルホン酸、 デォキシコール酸、 コール酸、 トリス (ヒドロ キシメチル) ァミノメタンドデシルサルフェイト(Tris DS)等の陰イオン 性界面活性剤、 ポリオキシエチレンセチルエーテル, ポリオキシェチレ
ンラウリルエーテル等のポリォキシエチレンアルキルエーテル類、 例え ばポリオキシエチレンォクチルフエ二ルエーテル (Triton X-100、 口-ム ァ ンド Λ-ス社商品名)等のポリォキシエチレンアルキルフエニルエーテル類、 例えばポリォキシエチレンソルビタンモノォレエ一卜, ポリォキシェチ レンソルビ夕ンモノパルミテート, ポリオキシエチレンソルビタンモノ ステアレ一卜, ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオ キシエチレンアルキルエステル類、例えばォクタノィル -N-メチルダルカ ミド, ノナノィル -N-メチルダルカミド, デカノィル -N-メチルダルカミ ド等のメチルダルカミド誘導体、例えば n-ォクチル - )3 -D-グ ルコシド等 のアルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。 中でも Triton X-100, デォキシコール酸が好ましい。 これらは単独又は二種以 上混合して用いられる。
動物組織を界面活性剤の存在下に破碎処理する方法としては、 動物組 織を破砕処理する際に界面活性剤が共存するように、 動物組織に界面活 性剤又はこれを含有するホモジナイズ用溶液を添加しても、 またその逆 に界面活性剤又はホモジナイズ用溶液に動物組織を加えても良い。
工程 1 ) に於いて用いられる界面活性剤の濃度は、 ホモジナイズされ た時のホモジネート中の濃度が 0.015〜15.6W/V%、 好ましくは 0.078 〜7.8W/V%である。 また、 ホモジナイズ用溶液中の濃度として、 0.02 〜20W/V%、 好ましくは 0.:!〜 10W/V%である。
尚、 当該ホモジナイズ溶液中には上記界面活性剤の他に例えばトリス 緩衝剤、 リン酸緩衝剤、 ベロナール緩衝剤、 ホウ酸緩衝剤、 グッド緩衝 剤等の緩衝剤、 糖類、 N a C l等の塩類、 界面活性剤、 防腐剤、 蛋白質 等が含まれていても良い。 上記工程 2 ) に於ける不溶物を除去する方法としては、 不溶物を分離
除去することが出来る方法で有れば良く、 遠心分離による方法が簡便で ある。 上記工程 3 ) に於いて用いられる分解酵素としては、 正常型 PrPを分 解するが異常型 PrPを分解しない性質を持つ酵素であればよい。例えば 従来の異常型 prp の検出に於いて用いられるプロティナーゼ K等が挙 げられる。 その濃度及び分解反応時の条件等は、 分解酵素が正常型 PrP を分解できる条件、 濃度であればよい。 上記工程 4 ) に於いて異常型 PrPを沈降させるために用いられる蛋白 質沈降剤としては、 異常型 PrPを沈降させる性質を持つものであれば良 く、従来の異常型 PrPの検出に於いて用いられるものを使用すればよい が、 例えば 3-ブ夕ノール、 2-ブ夕ノールとメタノールの混合溶媒等が挙 げられる。 工程 5 ) に於いて沈降物を回収する方法としては、 上清を除いて沈殿 した異常型 PrPを回収できる方法で有れば良く、遠心分離による方法が 簡便である。
また、 工程 5 ) に於いて沈降物の溶液を得るには、 沈降物を適当な沈 降物溶解液中に溶解すればよい。
沈降物溶解液を構成する溶媒としては、 異常型 PrPが固相上に吸着或 いは結合するのを妨げる性質を有するものでなければ良く、 例えば精製 水、 例えばトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 ベロナール緩衝液、 ホウ酸緩 衝液、 グッド緩衝液等、 この分野で普通に用いられている緩衝液は全て 挙げられる。 緩衝液の pH としては抗原抗体反応を抑制しない範囲であ れば特に限定されないが、 通常 5〜9の範囲が好ましい。
また、 これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、 通常 10〜500mM、 好ましくは 10〜300mMの範囲から適宜選択される。 また、 この溶解液 中には、抗 PrP抗体が固相上に吸着或は結合するのを妨げない量であれ ば、 例えば糖類、 N a C 1等の塩類、 界面活性剤、 防腐剤、 蛋白質等が 含まれていても良い。
更に、 沈降物溶解液中には、 工程 3 ) の分解酵素を失活させ、 異常型 PrPを不活性化させる (病原性一感染性を失わせる) ために、 例えば尿 素、 SDS、 蟻酸、 チォシアン酸グァニジン、 塩酸グァニジン、 三塩化酢 酸、 フエノール等の界面活性剤、 酸化剤又は蛋白質変性剤を共存させて おく必要がある。 その濃度は、 沈殿物溶解液中の濃度として 0.5%W/V% 以上、 好ましくは 2 % W/V%以上である。
尚、 分解酵素を失活させる為、 この分野で用いられる加熱処理を行つ ても良い。 また、 工程 1 ) 〜 5 ) の各工程に於いて使用するその他の試薬、 器具 類や、 処理条件等 (反応温度、 反応時間等) は、 すべて自体公知の上記 した如き異常型 PrP を検出すべき動物組織を処理する方法に準じて選 択すればよい。 従来の BSEの判定方法における動物組織由来の試料の調製方法では、 動物組織をホモジナイズ処理及びプロティナーゼ K処理後、蛋白質沈降 剤により異常型 PrPを沈降させるが、 ここに至るまでの過程でホモジネ —トを除去する操作を行わない。そのため得られた異常型 PrPを含有す る被検試料中には、 異常型 PrP以外の多種の蛋白質も多量に共存するこ とになり、 抗 PrP抗体の非特異的結合を起こさせ BSEの判定の際に偽 陽性の判定をもたらす危険性が高くなる。
これに対し、 上記工程 1 ) では、 非イオン性界面活性剤等の界面活性 剤の存在下に動物組織を破砕処理することにより、 細胞膜を可溶化して 細胞膜に結合した形で存在する PrP を細胞膜より遊離させることが出 来る。 そのため、 次の工程 2 ) で沈殿物を除去する工程を行っても、 PrP は組織片と一緒に沈殿してしまうことがないので、 上清を回収すれば、 PrPを含有し且つ動物組織片を含有しない溶液が得られる。 この溶液に ついて工程 3 ) を行えば、 従来のホモジネートをそのまま酵素処理する よりも、 効率よく正常型 PrP を分解出来るので、 正常型 PrP を含有し ない、且つ異常型 PrPを含有する被検試料を得ることができるのである。 また、 工程 2 ) 及び 5 ) の工程に於いて異常型 PrP以外の成分の除去 操作が複数回行われることにより、動物組織片ゃ異常型 PrP以外の蛋白 質が除かれるので、 次の固定化処理の工程で、 固相が目詰まりしてしま う危険性を排除できる。 更に工程 1 ) 及び 5 ) に於いて、 被検試料を非イオン性界面活性剤と 共存させることにより、 測定対象でない他の蛋白質や、 正常型 PrPを分 解できる。 一方異常型 PrPは変性, 分解しにくい蛋白質なので、 非ィォ ン性界面活性剤の共存下でも変性, 分解されない。 そのため、 固相への 固定化方法を行った際に、分解された蛋白質は固相を通過してしまうが、 分解されなかった異常型 PrP は固相上に残るので、 異常型 PrPのみを 固相に固定化することができるのである。 異常型 PrP を含有する被検試料中の異常型 PrP を固相に固定化させ る方法は、 本発明に係る蛋白質の固定化方法に従い、 上記の方法により
調製した異常型 PrPを含有する被検試料から、 低級アルコールと、 ハロ ゲノカルボン酸及び/又は長鎖アルキル硫酸塩を含有する異常型 PrP 固定化用試料を調製し、 当該疎水性表面を有する固相と接触させればよ い。 当該方法に用いられる低級アルコール, ハロゲノカルボン酸, 長鎖ァ ルキル硫酸塩の具体例、 これらを含有する溶液の調製方法及び当該溶液 中の濃度、 当該被検試料を低級アルコールと、 ハロゲノカルボン酸及び 又は長鎖アルキル硫酸塩と共存させる方法等の好ましい態様及び具体 例は、 前記した通りである。 また、 当該異常型 PrP固定化用試料を疎水性表面を有する固相と接触 させる方法に用いられる固相の具体例は前記した通りであるが、 例えば 疎水性膜である PVDF膜、 ニトロセルロース膜、 濾紙等が好ましい。 異常型 PrP固定化用試料を、疎水性表面を有する固相と接触させる方 法及び接触させるさせる条件等は前記した通りであるが、 中でも。 当該 疎水性膜を通して吸引濾過する、 通常のフィルトレ一シヨン法、 或いは 遠心濾過法による方法が、 好ましい。 これらの方法により、 固相上には 測定対象である異常型 PrPが固定化され、それ以外の蛋白質は固相を通 過してしまうので、 より効率的である。 当該方法では、異常型 PrPを固相に固定化するために試料を固相と接 触させた後、 1分〜 3 0分、 好ましくは 10 分程度静置し、 その後吸引 濾過処理を行う。 従来の ELISA法によれば、 ELISA用プレートに蛋白 質を固定化するために約 75 分程度静置する必要があつたが、 本発明の
方法によれば、 この時間を大幅に短縮することが出来る。 フィルトレーション法による異常型 PrPの固定化方法を、市販のドッ トブロッターもしくはスロットブロッターを用いる方法を例に挙げて具 体的に説明すると、 以下の通りである。
まず、 メタノール、 次いで蒸留水に浸した PVDF膜等の疎水性膜及び 要すればその上に蒸留水に浸した濾紙となるようにドットブロッターに セットする。 次に、 例えば上記の方法で調製した、 異常型 PrP、 低級ァ ルコ一ル、 長鎖アルキル硫酸塩及び Z又はハロゲノカルボン酸を含有す る異常型 PrP固定化用試料 (最大 400 /2 L) をドットブロッターのゥェ ルにアプライし、真空ポンプで、 約 15Kpa程度の引圧でゆつく り吸引す る (フィルトレ一ションする) と、 異常型 PrP固定化用試料中の異常型 PrPは PVDF膜に吸着される。 溶液を完全に吸引した後、 洗浄液を各ゥ エルにアプライし、 吸引する。 異常型 PrP を固相に固定化するための吸引操作は、 異常型 PrP を十 分吸着させる条件で行えば良く、 約 2KPa〜30Kpa程度の引圧で吸引す ればよい。 吸引に要する時間、 吸引速度等は特に制限されない。 異常型 PrP を含有する被検試料中の異常型 PrP を固相に結合させた 後、 吸引濾過することにより、 固相に結合しなかった正常型 PrPやその 他の蛋白質等の被検試料中の成分を除去することが出来、 測定対象であ る異常型 PrPのみを固相に固定化することが出来る。 尚、 固相上には抗体を変性させる畏れのある SDSが残存している。そ こで、 本発明に係る固定化方法では、 固定化処理の後固相を精製水又は
PBS 等の緩衝液で洗浄することを任意に行うことは先に述べた通りで ある。 異常型 PrPを固相に固定化する方法に於いては、 上記の吸引濾過 の工程を行った後、 非イオン性界面活性剤を含有する溶液で固相を洗浄 する工程を更に追加して行うことにより、試料中の SDSを除き、続く異 常型 Ρι'Ρの検出工程に付すことが好ましい。 この方法では、 ①他の蛋白 質は非イオン性界面活性剤により変性してしまう可能性があるが、 異常 型 PrPはこの処理では変性しないこと、 ②非イオン性界面活性剤が、 固 相に蛋 β質を一様に広げる作用があることから、特に異常型 PrPのよう な変性しにくい蛋白質の固定化を行うには有効な方法である。
当該洗浄工程に用いられる溶液には、 非イオン性界面活性剤の他に、 低級アルコール及びハロゲノカルボン酸を含有していることが望ましレ 当該洗浄処理に用いられる、 低級アルコール、 ハロゲノカルボン酸及 び非イオン性界面活性剤の好ましい具体例は上記した通りである。
また、 当該洗浄処理における洗浄剤 (固定化用試液 2とする) 中の好 ましい濃度としては、 低級アルコール濃度が 80〜50V/V%、 好ましくは 30〜50V/V%、 ノ、ロゲノカルボン酸濃度が 0.08〜: 10W/V%、 好ましくは 1〜4 W/V%非イオン性界面活性剤濃度が 0.01〜: L0V/V%、 好ましくは 0.04〜 2 V/V%程度である。 本発明に係る異常型 PrPの検出方法に於いて、 固相に固定化できる蛋 白質の濃度上限は、 前記した通りである。 本発明に係る異常型 PrPの検出方法に於いては、本発明の方法によつ て固相に異常型 PrPを固定化させる以外は、 当該蛋白質に対する抗体や 標識抗体を用いて自体公知の免疫測定法 [例えば酵素免疫測定法 (E I A )、 放射免疫測定法 (R I A )、 蛍光免疫測定法 (F I A ) 等] の測定
操作法に準じて以上型 prpの測定 検出を行う、通常のィムノブロッテ イング方法が適用できる。 また、 その際に使用する例えば緩衝剤、 発色 剤、 蛍光物質、 酵素、 基質、 放射性同位元素等の試薬類もこれら自体公 知の免疫学的測定法に於いて用いられるものの中から適宜選択して用い れば足りる。 本発明の異常型 PrPの検出方法において用いられる抗体としては、異 常型 PrP に結合し得る性質を有するものであれば、 正常型 PrP とも反 応性を有するものであっても良く、 特に限定されない。
また、 これらの抗体の由来については特に限定されないが例えば、 ヒ ト、 兎、 馬、 ゥシ、 羊、 山羊、 ラット、 マウス等に由来する、 上記した 如き性質を有するものが挙げられる。 また、 坊 PrP抗体は、 ポリクローナル抗体でもモノクロ一ナル抗体で も何れにても良い。 例えば、 モノクローナル抗体は、 市販品、 或いは細 胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法 〔; Eur.J immunol, 6, 511 (1976)] 等によって産生された、 上記した如き性質を 有するモノクローナル抗体は全て使用可能である。 また、 ポリクロ一ナ ル抗体は、 市販のものを使用しても良いし、 また、 動物抗血清から公知 の方法 (例えば、 「タンパク質精製法, Robert.K.Scopes著, シュプリン ガー · フヱアラーク東京株式会社, 1985年, 37頁〜 179頁」 等に記載 された方法等。) で取得されるポリクローナル抗体を使用しても良い。 これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。 また、 これら抗体は、 要すればペプシン, パパイン等の酵素を用いて 消化して F (ab')2、 F ab'、 或は F abとして使用してもよいことは言うま でもない。
尚、 均一の性質を有する抗体の特異性を考慮すると、 ポリクローナル 抗体よりもモノクロ一ナル抗体の方が好ましい。 本発明に係る異常型 PrPの検出方法に於いて、 抗 PeP抗体を標識す るために用いられる標識物質としては、 例えば E I Aに於いて用いられ る西洋ヮサビ由来ペルォキシダーゼ等のペルォキシダ一ゼ, アル力リホ スファ夕一ゼ, )3 -ガラクトシダーゼ, マイク口パーォキシダーゼ, グル コースォキシダーゼ, グルコース- 6-リン酸脱水素酵素, リンゴ酸脱水素 酵素, ルシフェラーゼ等の酵素類、例え ば R I Aで用いられる "mT c, 131 1 , 125 1 , 3H等の放射性同位元素、 例えば F I Aで用いられ るフルォレセィン, ダンシル, フルォレスカミン, クマリン, ナフチル ァミン或はこれらの誘導体等の蛍光物質、 例えばルシフェリン, ィソル ミノール, ルミノール, ビス(2,4,6-トリフロロフエニル)ォキザレート等 の発光性物質、 例えばフエノール, ナフトール, アントラセン或はこれ らの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、 例えば 4-ァミノ- 2,2,6,6-テ トラメチルピ ペリジン- 1-ォキシル, 3-ァミノ- 2,2,5,5-テトラメチルピロ リジン- 1-ォキシル , 2,6-ジ ブチル - α -(3,5-ジ十ブチル -4-ォキゾ -2,5- シクロへキサジェン -1-ィリデン) -ρ -卜リルォキシル等のォキシル基を有 する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等 が挙げられるが、 これらに限定されるものではないことは言うまでもな い。
中でもペルォキシダ一ゼ等の酵素類が、取扱いが簡便なため好ましい。 また、 上記した如き標識物質を抗 PrP抗体に結合させる (標識する) には、 例えば自体公知の EIA、 RIAあるいは FIA等において一般に行わ れている自体公知の標識方法 [例えば、 医化学実験講座、 第 8巻、 山村
雄一監修、 第 1版、 中山書店、 1971 ; 図説 蛍光抗体、 川生明著、 第 1 版、 (株) ソフトサイエンス社、 1983;酵素免疫測定法、 石川栄治、 河 合忠、 室井潔編、 第 2版、 医学書院、 1982等] を適宜利用して行えば よい。 尚、 当該標識物質を標識した抗 PrP抗体は市販されているので、 それを用いても良い。 標識抗 PrP抗体含有溶液を調製するための溶媒としては、標識抗 PrP 抗体が固相上に吸着或いは結合するのを妨げる性質を有するものでなけ れば良く、 例えば精製水、 例えばトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 ベロナ ール緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 グッド緩衝液等通常抗原抗体反応を利用し た測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられる。 緩衝液の pH とし ては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、 通常 5〜9の範囲が好ましい。
また、 これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、 通常 10〜500mM、 好 ま しくは 10〜300mM の範囲から適宜選択される。 また、 この溶液中 には、抗 PrP抗体が固相上に吸着或は結合するのを妨げない量であれば、 例えば糖類、 N a C l等の塩類、 界面活性剤、 防腐剤、 蛋白質等が含ま れていても良い。 抗原抗体反応の結果生成する抗原抗体複合物中の標識量を測定する方 法としては、 標識物質の種類により異なるが、 標識物質が有している何 らかの方法により検出し得る性質に応じて、 それぞれ所定の方法に従い 実施すればよい。 例えば、 標識物質が酵素の場合には EIAの常法、 例え ば 「酵素免疫測定法」 (蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、 北川常廣 ·南原 利夫 ·辻章夫 ·石川榮治編集、 51〜63,共立出版 (株)、 1987) 等に記載 された方法に準じて測定を行えばよく、 標識物質が放射性物質の場合に
は RIAの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応 じて液浸型 GM カウンター、 液体シンチレ一ションカウンター、 井 戸型シンチレーシヨンカウンタ一、 HPLC用カウン夕一等の測定機器 を適宜選択して使用し、 測定を行えばよい (例えば医化学実験講座、 第 8巻、 山村雄一監修、 第 1版、 中山書店、 1971等)。 また、 標識物質が 蛍光性物質の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いる FIAの常法、例 えば 「図説 蛍光抗体、 川生明著、 第 1 版、 (株) ソフトサイエンス社、 1983」 等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、 標識物質が発光 性物質の場合にはフォトカウンタ一等の測定機器を用いる常法、 例えば 「酵素免疫測定法」 (蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、 北川常廣,南原利 夫 -辻章夫 ·石川榮治編集、 252〜263、 共立出版 (株)、 1987) 等に記 載された方法に準じて測定を行えばよい。 さらに、 標識物質が紫外部に 吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によ つて測定を行えばよく、 標識物質がスピンの性質を有する場合には電子 スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」 (蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、 北川常廣 ·南原利夫 ·辻章夫 ·石川榮治編集、 264 〜271、 共立出版 (株)、 1987) 等に記載された方法に準じてそれぞれ測 定を行えばよい。 より具体的には、 例えば標識物質が酵素である場合は、 これを酵素反 応で発色を生じる基質等の発色試薬と反応させて発色反応に導き、 その 結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の 方法が挙げられる。
このような目的で用いられる発色試薬としては、 例えばトリメチルベ ンジルピペラジン (TMB)、 テトラメチルベンジジン、 0 -フエ二レンジ ァミン、 0 -二トロフエニル - jS -D-ガラク トシド、 2, 2, -アジ-ノ-ビス (3-
ェチルベンズチアゾリン -6-スルホン酸) (ABTS;)、 N-ェチル -N-スルホ プロピル- m-ァニシジン (ADPS)、 p-ニトロフエニルリン酸等、 通常こ の分野で用いられる発色試薬が挙げられる。
また、 発色反応を停止させるには、 例えば反応液に 1〜6Nの硫酸等の 酵素活性阻害剤を添加する等、 通常この分野で行われている反応停止方 法を利用すればよい。 本発明の異常型 PrPの検出方法に於いて使用する標識抗体、発色試薬 及びその他の試薬や、 測定条件等 (反応温度、 反応時間、 測定波長、 測 定装置等) はすべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法におけるそ れらに準じて選択すれば足り、 自体公知の免疫学的測定法の測定操作法 に準じて実施すれば良く、 自動分析装置、 分光光度計等も通常この分野 で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。 本発明の異常型 PrPの検出方法を、 以下に具体的に説明する。
即ち、 本発明に係る方法で得た異常型 PrPを固定化した固相に、 例え ば POD標識抗 PrP抗体をアプライし、 10分程度静置後、吸引濾過して、 PrPに結合しなかった標識 PrP抗体を除く。次いで洗浄剤をアプライし、 吸引する。 この洗浄操作を数回行うことは任意である。 次いで TMB を 含有する発色液をアプライし、 30分程度反応させる。 反応後吸引濾過し て発色液を除去した後、 停止液を添加して反応を停止させる。 450nmに 於ける吸光度をマイクロプレートリーダ一等により測定する。 本発明に係る固定化方法を行えば、異常型 PrPを効率的に固相に固定化 できるので、 本発明に係るィムノブロッテング方法によれば、 ELISA法 やウェスタン,ブロット法等の従来の異常型 PrP検出方法よりも、 感度
よく異常型 PrPの検出及ぴ分析を行うことができる。 本発明に係る異常型 PrP の検出方法に於いて異常型 PrP を検出し得 る動物組織としては動物由来の延髄、 小脳、 脊髄その他の中枢神経系組 織、 リンパ節等の細網リンパ系組織、 骨等が挙げられる。 これらの由来 動物としては、 ヒト、 ゥシ、 ヒッジ、 ハムスター、 マウス等が挙げられ る。 本発明に係るプリオン病の判定方法としては、 例えばカツトオフ値を 設定して行う方法がある。 以下にその一例として BSE を判定する場合 の例を示す。 すなわち、 先ず PrP (正常型) を試料として用いて上記の PrPの検出 方法を行い、 標識抗 PrP抗体の標識量 (例えば吸光度。 以下同じ)を測定 し、 この平均値と標準偏差 (SD) をだす。 この平均値 + 2 SDをカット オフ値とする。
別に、 同様の方法で BSE を判定すべき被検試料を用いて同様の方法 で標識抗 PrP抗体の標識量を測定し、 検体値とする。
検体値がカットオフ値よりも低い場合には検体はプリオン病陰性と判 定し、 反対に検体値がカッ トオフ値と同じかそれよりも高い場合にはプ リオン病陽性と判定するという方法である。
カツトオフ値を得るために用いられる PrPは、動物組織から精製した ものでも、 遺伝学的法で調製したリコンビナント PrPであってもよレ 。 本発明のプリオン病の判定方法によって判定し得るプリオン病として は、 特に B S Eが挙げられる。
本発明に係る蛋白質固定化用試液としては、 本発明に係る低級アルコ —ルと、 ハロゲノカルボン酸及び/又は長鎖アルキル硫酸塩とを含有し ていればよく、 その具体例は前記した通りである。
また、 蛋白質固定化用試液中の低級アルコールの濃度は、 蛋白質を固 相に固定化する際に 30〜 50V/V%になるような濃度、 ハロゲノカルボン 酸の濃度は 0.1〜: 10W/V%になるような濃度、長鎖アルキル硫酸塩の濃度 は、 0.1〜1W/V%になるような濃度であればよい。 より好ましくは、 低 級アルコールは 35〜50V/V%、 ノ、ロゲノカルボン酸は 0.5〜5W/V%、 長 鎖アルキル硫酸塩は 0.:!〜 0.4W/V°/。、 である。 更に、 本発明に係る蛋白質固定化用試液には、 蛋白質の固相への固定 化、 またそれに続く蛋白質の定量に影響を及ぼさないものであれば、 そ の他に塩類、 キレート等を含有していてもよい。 本発明に係る異常型 PrP検出用キットとしては、(1)低級アルコールと、 八ロゲノカルボン酸及び _ 又は長鎖アルキル硫酸とを含有する固定化用 試液 1、 (2)低級アルコール、 八ロゲノカルボン酸及び界面活性剤を含有 する固定化用試液 2、及び (3)異常型プリオン蛋白質と特異的に結合し得 る標識抗体、 を構成試薬として含有してなるものであり、 その具体的な 実施態様は前記した通りである。 尚、 当該キットを構成する標識抗体が酵素標識抗体である場合には、 更に当該酵素の反応により検出可能なシグナルを発生し得る当該酵素の 基質を構成試薬として含有して成る。 その好ましい態様及び具体例は前 記した通りである。
以下に実施例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明は これらにより何等限定されるものではない。 実施例
実施例 1 .
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
卵白アルブミン (以下、 OVAと略記する。 ニヮトリ卵白由来、 和光純 薬工業 (株)製)、ヘモグロビン(ゥシ血液由来、和光純薬工業 (株)製)、 IgG (ゥシ由来、 和光純薬工業 (株)製)、 チトクローム c (ゥマ心筋由来、 和 光純薬工業 (株)製)、 リゾチーム (ニヮトリ卵白由来、 和光純薬工業 (株) 製)、 を夫々秤量し、 精製水に溶解して 250 Z gZmL溶液としたものを 蛋白質試料として用いた。
(2)固定化用試液
各試薬を精製水に溶解して、 下記の固定化用試液を調製した。 この中 で固定化用試液 3〜 5が、 本発明に係る固定化用試液である。
尚、 各試薬は、 エタノール (和光純薬工業 (株)製、 特級)、 トリクロ口 酢酸 (以下、 TCAと略記する。 和光純薬工業 (株)製、 化学用)、 ドデシル 硫酸ナトリウム (以下 SDSと略記する。 和光純薬工業 (株)製、 化学用) を用いた。
対照 :精製水
固定化用試液 1 : 0.2 W/V % SDS、
固定化用試液 2 : 0.2 W/V % SDS、 2.5W/V% TCA
固定化用試液 3 : 0.2 W/V % SDS 45V/V% エタノール
固定化用試液 4 : 0.2 W/V % SDS、 2.5W/V% TCA、 45V/V% ェタノ
ール
固定化用試液 5 : 2.5W/V% TCA 45V/V% エタノール
(3)固定化用試料
蛋白質試料 20 / L (蛋白質 5 g) と、 所定の固定化用試液 300 Lと を混合したものを調製し、 固定化用試料とした。 固定化用試料中の各試 薬の終濃度 (PVDF 膜と接触させる際の濃度。 以下同じ。) は、 夫々下 記の通りである。
固定化用試料 1 : 0.19 W/V % SDS、
固定化用試料 2 : 0.19 W/V % SDS、 2.3 W/V% TCA
固定化用試料 3 : 0.19 W/V%SDS, 42.2V/V%エタノール
固定化用試料 4 : 0.19 W/V % SDS、 2.34W/V% TCA、 42.2V/V% ェ 夕ノール
固定化用試料 5 : 2.34W/V% TCA, 42.2V/V% エタノール [蛋白質の固定化及び測定]
ドットブロッタ一 ADVANTEC DP-96 (アドバンテック製) に親水化 処理したポリビニリデンジフロライ ド膜 (PVDF膜、 ミリポア製、 ィモ ビロン PS Q O.l ^ m)をセットした。次に PVDF膜に固定化用試料 320 L をアプライし、 真空ポンプ (パイォクラフト社製) にて、 15KPa ( lOcmHg) で 10分間吸引濾過した。 次いで pH7.4 リン酸緩衝食塩水 (PBS) 300 Lをアプライし、 同様に吸引濾過して、 PVDF膜を洗浄 した。 PVDF膜を取り出し真空乾燥させた後、 Pyromolex試液 (Protein Assay Rapid Kit wako 和光純薬工業 (株)製) で発色させ、 次いでデン シトメ一夕一 SHIMADZU CS-9000 ((株)島津製作所 製) で 600nmの 吸光度 (シグナル強度) を測定した。
[結果]
結果を図 1に示す。 図 1に於いて、 各バ一は下記固定化用試料を用い た場合の結果を夫々示す。
図 1から明らかなように、試薬として SDSのみを含有する固定化用試 料 1を膜に固定化させた場合は、 シグナル強度が全く測定できなかった (固定化用試料 1 )。 また、 SDSと TCAを含有する固定化用試料 2を用 いた場合は、 少しシグナル強度が強くなつた (測定できた) が、 対照 (精 製水を用いた場合、 従来の固定化法) ほど高いシグナル強度は得られな かった。 これに対し、 SDSとエタノールを含有する固定化用試料 3を用いた場 合は、 対照と同等若しくはそれ以上のシグナル強度が得られた。
また、 TCA とエタノールを含有する固定化用試料 5を用いた場合は、 チトクローム cを固定化した場合以外は、 すべて対照と比較して遙かに 高いシグナル強度が得られた。 更に、 TCAとエタノールと SDSを含有する固定化用試料 4を用いた 場合には、 チトクローム cを固定化した場合も含めて、 全ての場合で対 照と比較して遙かに高いシグナル強度が得られた。
以上のことより、 低級アルコール^ハロゲノカルボン酸及び 又は長 鎖アルキル硫酸塩の共存下で行う本発明に係る固定化法によれば、 従来 の水や緩衝液だけを用いて行っていた固定化法と比較して、 膜への蛋白
質の固定化率を飛躍的に向上させることができることが判る。 また、 固定化用試料 3及び 4で、 対照と同程度又はそれより高いシグ ナル強度が測定できたことから、 本発明の固定化法によれば、 予め SDS 等を含有する試料を用いても、 蛋白質を固定化することができることが 判る。 実施例 2 .
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料 .
リゾチーム、チトクローム c、 IgG、フイブリノ一ゲン(ヒト血漿由来、 和光純薬工業 (株)製)、 BSA (牛血清アルブミン、 和光純薬工業 (株)製)、 OVA, トリプシンインヒビ夕一 (大豆由来、 和光純薬工業 (株)製)、 へモ グロビンを夫々秤量し、 精製水に溶解して 250 gZmL溶液としたもの を蛋白質試料として用いた。
尚、 これらの蛋白質は等電点 piが 4.0-11.4の幅広い範囲にあり、 分 子量は 12000-150,000と広範囲のものである (久保ら,蛋白質 生化学ハ ンドブック,丸善株式会社, 54-73 (1984)参照)。
(2)固定化用試液
2.5 W/V% TCA> 45 V/V% エタノール、 及び所定濃度 (0〜0.4W/V%) の SDSを含有するように、精製水に溶解して調製したものを固定化用試 液として用いた。
(3)固定化用試料
所定の蛋白質試料 20 L (蛋白質量 5 g) と固定化用試液 300 Lと を混合したものを調製し、固定化用試料とした(TCA終濃度 2.34W/V%、 ェタノール終濃度 42.2V/V°/。)。
[蛋白質の固定化及び測定]
実施例 1と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質を PVDF膜に固 定化し、 洗浄、 染色処理し、 次いでデンシトメ一ターで 600nm の吸光 度 (シグナル強度) を測定した。
[結果]
結果を図 2に示す。
図 2に於いて、 —△—はリゾチーム、 ——はチトクローム(:、 一〇— は IgG、 一口一はフイブリノ一ゲン、 —秦一は BSA、 —♦—は OVA、
—◊一はトリプシンインヒビ夕一を含有する蛋白質試料を用いた場合の 結果を夫々示す。また、横軸は固定化用試液中の SDS濃度を示す。更に、 図 2中の、 各ポイントのバーは、 土 SDを示す。
図 2から明らかな如く、 殆どの蛋白質で SDS共存下に PVDF膜に固 定化させると、 一旦シグナル強度が増加するが、 SDS 濃度が 0.1W/V% 以上になるとシグナル強度がある一定の値を示す傾向を示した。 このこ とから、 固定化用試液中の SDS濃度を 0.1W/V%以上 (固定化用試料中 の終濃度 0.09W/V%以上) とすることにより、 試料中の蛋白質の PVDF 膜への固定化率が一定となると考えられる。
また、デ一夕のバラツキを示す CV値(CV値 =標準偏差/平均値(%) ) についてみると、 どの蛋白質も固定化用試液中の SDS濃度が 0.1 W/V% より低い濃度では、 CV 値が大きく、 シグナル強度が安定していないこ とが分かる。 それに対し、 固定化用試液中の SDS濃度が 0.1W/V%以上 の場合は、 CV 値が比較的小さく、 上述したようにこの濃度範囲でシグ ナル強度の値が安定であることが示されている。 この結果は、 試料中の 蛋白質の固相膜に固定化される量を示していると考えられる。 また、 デ
一夕は示していないが、 この結果は再現性があることを確認している。 一般に、 SDS等の長鎖アルキル硫酸塩は、 0.0025 W/V%といったかな りの低濃度でも蛋白質の構造崩壊作用を示し、 構造崩壊の程度により蛋 白質結合 (染色) 色素に対する反応性に違いを生ずるといわれている (Orsonneau, J-L et al" Clin. Cheni., 35, 2233-2236 (1989))。 従って、 ここでも、 それが要因となって、 SDS濃度が 0.1 W/V%より低い固定化 溶液を用いた場合で、 シグナル強度が上昇する等の急激な変化を示し、 且つ、 それが変化の途中過程にあるため、 CV 値 (く 15%) が大きくな つたと推察される。 また、 このことは、 0.1 W/V%より低い SDS濃度条 件下では、 試料中の蛋白質の; PVDF膜への固定化率が変動している (一 定でない) 可能性をも示唆している。 以上のことより、 図 2に於いて、 SDSの濃度変化の影響を受けずに吸 光度 (シグナル強度) が安定した時、 始めて蛋白質の PVDF膜への固定 化率が一定になっているのではないかと推察された。
そこで、図 2の結果を基に、蛋白質試料として BSAを用い、 0.1 W/V% SDS を含有する固定化用試液で固定化した後測定を行った場合のシグ ナル強度を 100 (基準値) とした。 そして、 基準値に対する、 その他の 各蛋白質を蛋白質試料として用い、 0.1W/V%SDS、 0.2 W/V%SDS, 0.3 W/V%SDS又は 0.4 W/V%の SDS固定化用試液を用いて同様に固定化及 び測定を行って得られたシグナル強度の相対値を夫々算出した。 表 1に、 SDS濃度が 0.2W/V%〜0.4W/V%まで変化するまで、 表 2に は SDS濃度が 0.1W/V%〜0.4W/V%まで変化するまでの、 各ボイントの CV値を平均化した値(平均 CV値(%:) )、各ボイントの相対値の平均値、 そのポイント間の絶対偏差を平均した値(平均絶対偏差)、平均絶対偏差
をその平均値で割りパーセント表示した値 (ポイント間変動率 (%)) を 夫々示す。 ボイ,ント間変動率とは、 SDS濃度変化に伴うシグナル強度の 変化を変動率として算出した値のことで、 この数字が小さいほど、 SDS 濃度に影響されずにシグナル強度 (測定結果) が一定であることを示し ている。
表 1
表 2 蛋白質 平均 CV値 (¾) 平均値 平均絶対偏差 ポイント間変動率 (%)
BSA 3.9 74.2 13.87 18.7 トリフ。シンインヒビタ- 2.5 54.4 4.62 8.5 フイブリノ一ゲン 1.5 62.7 6.38 10.2
OVA 1.3 69.6 2.32 3.3 へモゲロビン 1.7 68.6 5.94 8.7
IgG 0.8 98.3 3.17 3.2 チトクローム c 2.1 127.4 2.93 2.3 リ チーム 1.8 92.0 9.48 10.3
CV値の平均 ポイント間変動率の平均 2.0 8.1
その結果、 表 1より、 SDS濃度が 0.2 W/V°/。— 0.4W/V%間で、 例えば フイブリノ一ゲン、 OVA、 IgG、 チトクローム c は、 そのポイント間変 動率が最も安定し、 1.4一 2.7%を示した。 また、 これら蛋白質の平均 CV 値 (0.8— 1.9%) と比較しても遜色ない結果であり、 SDS濃度が変化し てもシグナル強度の変動が非常に少ないことを示している。
また、 表 2より、 フイブリノ一ゲンを除く 3つの蛋白質は、 SDS濃度 が 0.1— 0.4 W/V%の間でもボイント間変動率が 2.3— 3.3%であり、 SDS 濃度の影響によるシグナル強度の変動が少ないことがわかる。
また、 SDS濃度が 0.1— 0.4 W/V%の間でボイント間変動率が 10%を超 えるフイブリノ一ゲン、 リゾチーム、 BSAについても、 SDS濃度を 0.2 - 0.4W/V%に限定すると安定した結果が得られることが判る。
以上のことより、 SDS 濃度が 0.1W/V° /。以上でポイント間変動率が安 定してくることから、この濃度範囲の SDSを含有する固定化用試液を用 いて、 蛋白質を固定化すると、 試料中の蛋白質量の正確な定量が行える ことが判る。 実施例 3 . 低級アルコールの検討
低級アルコールとしてエタノールの代わりにメタノールを用いた場合 の蛋白質試料の固定化及び測定を行った。
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
BSA、 OVA, ヘモグロビン、 IgG、 チトクローム c、 リゾチームを夫々 秤量し、 精製水に溶解して 250 ^ gZniL溶液としたものを蛋白質試料と して用いた。
(2)固定化用試液
精製水を用いて下記固定化用試液を調製した。
固定化用試液 1: 0.2 W/V% SDS、 2.5 W/V% TCA
固定化用試液 2: 0.2 W/V% SDS、 2.5 W/V% TCA、 45% ェタノ一ル 固定化用試液 3: 0.2 W/V% SDS、 2.5 W/V% TCA、 45% メタノール (和光純薬工業 (株)製、 特級) .
(3)固定化用試料
蛋白質試料 20 ^ L (蛋白質量 と、 所定の固定化用試液 300mL とを混合したものを調製し、 固定化用試料 1 , 2, 3とした。 固定化用試 料中の各試薬の終濃度は、 夫々 SDS 0.19W/V%、 TCA 2.34W/V% エタ ノール 42.2V/V%、 メタノール 42.2V/V%である。
[蛋白質の固定化及び測定]
実施例 1と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質を PVDF膜に固 定化し、 洗浄、 染色処理し、 次いでデンシトメ一夕一で 600nm の吸光 度 (シグナル強度) を測定した。
[結果]
結果を図 3に示す, 図 3に於いて、 各バーは夫々下記固定化用試料を 用いた場合の結果を示す。
図 3から明らかな如く、 メタノ一ルを含有する固定化用試液を用いて 調製した固定化用試料を用いた場合も、 エタノールを用いた場合と同程 度のシグナル強度が得られ、蛋白質を PVDF膜に固定化することができ たことが判る。
実施例 4 . 八ロゲノカルボン酸の検討
ハロゲノカルボン酸として、 TCAの代わりにトリフルォロ酢酸(以下、 TFA と略記する。) を用いた場合の蛋白質試料の固定化及び測定を行つ た。 '
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
BSA、 IgG、 リゾチームを夫々抨量し、 精製水に溶解して 2'50 7 niL溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
(2)固定化用試液
精製水を用いて、 下記固定化用試液を調製した。
固定化用試液 1: 0.2 W/V% SDS、 45 V/V% エタノール
固定化用試液 2: 0.2 W/V% SDS、 45 V/V% エタノール、 2.5 W/V%
TCA
固定化用試液 3 : 0.2 W/V% SDS、45 V/V% エタノール、 2.5 W/V% TFA (和光純薬工業 (株)製)
(3)固定化用試料
蛋白質試料 (蛋白質量 5 i g) と、 所定の固定化用試液 300mL とを混合したものを調製し、 固定化用試料 1,2, 3とした。 固定化用試 料中の各試薬の終濃度は、 夫々 SDS 0.19W/V%、 TCA 2.34W/V%, TFA 2.34W/V% エタノール 42.2V/V%である。
[蛋白質の固定化および測定]
実施例 1と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質を PVDF膜に固 定化し、 洗浄、 染色処理し、 次いでデンシトメ一夕一で 600nm の吸光 度 (シグナル強度) を測定した。
[結果]
結果を図 4に示す。 図 4に於いて、 各バーは夫々下記固定化用試料を 用いた場合の結果を示す。
図 4から明らかな如く、 TFAを含有する固定化用試試液用いて調製し た固定化用試料を用いた場合も、 TCAを用いた場合と同程度又はそれ以 上のシグナル強度が得られ、 蛋白質を有効に膜に固定化することができ たことが判る。 実施例 5 . 検量線の作成
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
OVAを 0〜20 /i gZ20 i Lとなるように精製水に溶解して蛋白質試料 とした。
(2)固定化用試液
0.2 V/V% SDS、 2.5 V/V% TCA、 45 V/V% エタノールとなるように精 製水に溶解して調製したものを固定化用試液として用いた。
(3)固定化用試料
蛋白質試料 20 z L (蛋白質量 5 i g) と、 固定化用試液 300 Lとを混 合したものを調製し、 固定化用試料とした。 固定化用試料中の各試薬の 終濃度は、夫々 SDS 0.19W/V%> TCA 2.34W/V%、エタノール 42.2V/V% である。
[蛋白質の固定化及び測定]
実施例 1と同様の方法で、各固定化用試料中の蛋白質を PVDF膜に固 定化し、 洗浄、 染色処理し、 次いでデンシトメ一夕一で 600nm の吸光 度 (シグナル強度) を測定した。
[結果]
その結果を基に、 蛋白質量 (; g) とシグナル強度との関係を示す検 量線を作成した。
結果を図 5に示す。 図 5に於いて、 各プロットのバ一は、 ± 2SDを示 す。
検量線から得られた結果は、 測定範囲 0.2— 20 / 蛋白質試料、 一致 係数 0.99以上、 平均 CV1.9%であった。
また、 蛋白質濃度 0.2 _ 5 gZ蛋白質試料の範囲で、 直線性が得られ た。 測定結果を統計処理して得られた、 この範囲での回帰直線式及び相 関係数は下記の通りである。
回帰直線式: y =0.12 x +0.01
相関係数 (R 2 ) : 0.99
X :蛋白質量
y : シグナル強度
図 5から明らかな如く、 本発明の方法により OVAを PVDF膜に固定 化し、 蛋白質量の測定を行ったところ、 良好な直線性を示す検量線が得 られるので、 本発明の固定化方法によれば、 高精度の OVA (蛋白質) 濃 度の定量測定が行えることが判った。
尚、 データは示していないが、 実施例 2で測定した他の蛋白質につい ても同様に測定を行った結果、 OVAと同様に直線性のある検量線が得ら れ、 これらの蛋白質についても定量測定が行えることが判った。
実施例 6 .
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
精製水を用いて、 BSA、 トリプシンインヒビ夕一、フイブリノ一ゲン、 OVA, ヘモグロビン、 IgG、 チトクローム c、 リゾチ一ム夫々の 5 g/ 20 L溶液を調製し、 蛋白質試料とした。
[固相化法による蛋白質の測定]
精製水を用いて 0.2W/V%SDS、 2.5W/V%TCA, 45V/V% エタノール を含有する固定化用試液を調製した。 次いで、 調製した蛋白質試料 20 L と固定化用試液 300 L を混合し、 得られた固定化用試料 320 L を用いて実施例 1と同様の方法で固定化用試料中の蛋白質を PVDF 膜 に固定化、 洗浄、 染色処理し、 次いで、 デンシトメ一夕一で 600nm の 吸光度 (シグナル強度) を測定した。 固定化用試料中の各試薬の終濃度 は、 夫々 SDS 0.19W/V%、 TCA 2.34W/V%、 エタノール 42.2V/V%であ る。
[液相法による蛋白質の測定]
上記で調製した蛋白質試料 20 Lに、 lmL Pyromolex液を添加して、 室温で 20分間インキュベーションし、 600mnの吸光度を測定した。
[結果]
蛋白質試料として BSAを用い、 0.2 W/V%SDSを含有する固定化用試 料を調製して、 BSAを固定化、 測定を行った場合の吸光度 (シグナル強 度) を 1 (基準値) とした時の、 基準値に対する各蛋白質について同様 に固定化、 測定を行って得られた吸光度の相対値を求めた結果を図 6に
示す。 また、 同様に蛋白質試料として BSA を用い、 液相法による測定 を行った場合の吸光度を 1 (基準値) とした時の、 基準値に対する各蛋 白質について同様に液相法による測定を行って得られた吸光度の相対値 を求めた結果も、 図 6に併せて示す。
尚、 図 6に於いて、 各バ一は夫々下記の方法により各蛋白質を測定し た結果に基づいて得られた、 上記相対値を示す。
図 6より明らかな如く、 液相法による測定では、 蛋白質濃度は同じで も、 蛋白質の種類によって、 BSAに対する吸光度の相対値が大きく異な り、 例えばフイブリノ一ゲンでは、 0.46程度であった。
これに対し、 本発明の固相法によって測定を行った場合の BSA に対 するフイブリノ一ゲンの吸光度(シグナル強度)の相対値は 0.75になり、 BSAの場合との吸光度の差が少なくなつていることが判る。 これは、 測 定した殆どの蛋白質についても言える。
また、 測定した全蛋白質の平均吸光度の、 BSAの場合のそれを 1とし た場合に対する相対値は、液相法の場合は 0.65であるのに対して本発明 の固相法の場合は 0.94となり、蛋白質種による定量誤差が改善されたこ とが判る。 これはタンパク質が変性状態で膜にトラップされることによ り、 液相法では反応できなかった、 例えばチトクローム c、 リゾチーム 等の塩基性アミノ酸が、 染色液と結合できる状態となり、 本発明に係る 固定化液で蛋白質が効率良く固定化され、 より正確な測定結果を得られ るようになったと考えられる。 実施例 7
[試料の調製と固定化]
精製水を用いて、 IgG試料(蛋白質量 0〜4 g/20 L)、 及び 2%SDS 含有 IgG試料 (蛋白質量 0~4 /z gZ20 L) を調製した。 別に精製水を 用いて 0.25W/V%SDS、 2.5W/V%TCA及び 45V/V%エタノールを含有す る固定化用試液を調製した。 次いで、 蛋白質試料 20 x Lと固定化用試液 300 Lを混合し、得られた固定化用試料 320 i Lを用いて実施例 1と同 様の方法で固定化用試料中の蛋白質を PVDF膜に固定化、 洗浄、 染色処 理し、 次いでデンシトメ一ターで 600nm の吸光度 (シグナル強度) を 測定した。
尚、 SDSを含有しない IgG試料を用いて得られた固定化用試料中の各 試薬の終濃度は、 夫々 SDS 0.23W/V%、 TCA 2.34 W/V%, エタノール 42.2V/V%である。 また、 2%SDS含有 IgG試料を用いて得られた固定化 用試料中の各試薬の終濃度は、夫々 SDS 0.36 W/V%, TCA 2.34 W/V%, エタノール 42.2 V/V%である。
[結果]
得られた結果を基に、 SDS を含有しない IgG試料を用いた場合と、 2%SDS含有 IgG試料を用いた場合夫々について、 蛋白質量 ( fi g) とシ グナル強度との関係を示す検量線を作成した。
結果を図 7に示す。 図 7に於いて、 一♦一は SDS を含有しない IgG 試料を用いた場合、 一△一は SDSを含有する IgG試料を用いた場合の 結果を夫々示す。 また、 各プロットのバ一は、 土 SDを示す。
図 7より明らかな如く、 両方の検量線は、 ほぼ一致した。
この結果から、 本発明の固定化方法により蛋白質を固定化させれば、 SDSが蛋白質試料中に存在していても、 それに影響されることなく、 目 的の蛋白質を固相に固定化させ、 蛋白質の定量を行うことができること
が判る。 実施例 8 .
SDS を含有する種々の蛋白質試料を用いて本発明に係る蛋白質の固 定化及び測定を行い、 当該測定に及ぼす SDSの影響を、液相法による測 定の場合と比較した。
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
精製水を用いて、 0W/V°/。SDS (対照)、 0.2W/V°/。SDS又は 2W/V°/。SDS を含有する蛋白質試料 (BSA、 トリプシンインヒビ夕一、 フイブリノ一 ゲン、 ヘモグロビン、 〇V A、 チトクローム c、 リゾチ一ム、 IgG、 トリ プシン (和光純薬工業 (株)製) 夫々 250 i gZmLを調製した。
[固定化法による蛋白質の測定]
精製水を用いて 0.1W/V%SDS、 2.5W/V%TCA、 45V/V%エタノールを 含有する固定化用試液を調製した。次いで調製した蛋白質試料 20 Lと 固定化用試液 300 z Lを混合し、 得られた固定化用試料 320 Lを実施 例 1と同様の方法で固定化、 洗浄、 染色処理し、 デンシトメ一ターで、 600nmの吸光度 (シグナル強度) を測定した。
[液相法による測定]
上記で調製した蛋白質試料 20 L に、 lmL Pyromolex 液 (Protein Assay Rapid Kit wako、 和光純薬工業 (株)製) を添加して、 20分室温で ィンキュベーションし、 600nmに於ける吸光度を測定した。
[結果]
得られた結果を、 夫々の対照 (SDS含有していない試料) を用いて得 られた結果を 100とした相対値で表し、 表 3にまとめた。 表 3
表 3から明らかな如く、 本発明に係る固相法による蛋白質の測定を行 つた場合には、 2W/V%SDS含有試料でも殆どの蛋白質で、対照に対し土 20%以内の測定結果が得られ、蛋白質試料中の SDSが蛋白質測定に及ぼ す影響を回避できたことが判る。
これに対して、 2W/V%SDS 含有試料を用いて液相法によって測定を 行った場合には、 全く測定ができなかった。
以上の結果から、 本発明の蛋白質の固定化法及び定量方法は、 あらゆ る蛋白質に適用することができることが判る。 また、 これまで知られて いたタンパク定量阻害剤、 特に蛋白質可溶化剤として汎用される SDS 含有試料中の蛋白質定量が可能になった点で、 非常に有用でもあること が明らかとなった。
実施例 9 .
試料中に含まれる界面活性剤が、 本発明の固定化用試液を用いた固定 化方法及び蛋白質の測定に及ぼす影響を調べた。
[固相法による固定化及び蛋白質の測定]
( 1 ) BSA又は IgG含有蛋白質試料中の蛋白質の測定
精製水で、 表 4記載の濃度となるように、 各界面活性剤を含有する BSA試料又は IgG試料 (蛋白質量 4 x gZ20 x L) を調製し、 蛋白質試 料とした。
別に、 精製水で 0.1W/V%SDS、 2.5 W/V% TCA、 45 V/V% エタノー ルを含有する固定化用試液を調製した。
次いで蛋白質試料 20 Lと固定化用試液 300 Lを混合して固定化用 試料を調製し、 その 320 Lを用いて、 実施例 1と同様の方法で固定化 用試料中の蛋白質を PVDF膜に固定化、 洗浄、 染色処理し、 600nm の 吸光度 (シグナル強度) を測定した。
固定化用試料中の各試薬の終濃度は、 SDSを含有しない蛋白質試料を 用いた場合は、 SDS 0.094W/V%, TCA 23.4W/V0/。、ェタノール 42.2V/V% である。 また、 SDS 含有蛋白質試料を用いた場合の各試薬の終濃度は、 TCA及びエタノールの終濃度は SDS を含有しない蛋白質試料を用いた 場合と同じであるが、 SDSの終濃度は、 1 % SDS含有蛋白質試料を用い た場合は 0.16W/V%、 2 %SDS 含有試料を用いた場合は 0.21W/V%、 4 %SDS含有試料を用いた場合は、 0.34W/V%となる。
( 2 ) OVA含有蛋白質試料中の蛋白質の測定
表 4記載の濃度となるように、各界面活性剤を含有する OVA試料(蛋 白質量 5 20 1^) を調製し、 蛋白質試料とした。
別に、 精製水で 0.2W/V%SDS、 2.5 W/V% TCA. 45 V/V% ェタノ一
ルを含有する固定化用試液を調製し、 上記 (1) と同様の方法で固定化 用試料を調製し、 実施例 1と同様の方法で PVDF膜に固定化、 洗浄、 染 色処理し、 600nmの吸光度 (シグナル強度) を測定した。
尚、 固定化用試料中の各試薬の終濃度は、 SDSを含有しない蛋白質試 料を用いた場合は、 SDS 0.19W/V% TCA 23.4W/V%、 エタノール 42.2V/V%である。 また、 2 % SDS 含有蛋白質試料を用いた場合の各試 薬の終濃度は、 SDS 0.31W/V%、 TCA 23.4%, エタノール 42.2W/V%と なる。 '
また、 界面活性剤 (阻害物質) を含有しない以外は上記と同様に調製 した BSA試料、 IgG試料、 OVA試料を用いて同様に固定化、 測定を行 い、 対照とした。
[液相法による蛋白質の測定]
表 4記載の濃度となるように各界'面活性剤を含有する BSA試料 (10 g/20 L) を調製したものを用い、 lmL Pyromolex溶液を使って、 実施例 6と同様の方法で測定した。
また、 界面活性剤 (阻害物質) を含有しない以外は上記と同様に調製 した BSA試料を用いて同様に液相法による測定を行い、 対照とした。 [結果]
夫々の測定は 3回ずつ行い、得られた吸光度の平均値を求めた。。対照 を用いて得られた平均値を 100として、 それに対する界面活性剤を含有 する試料を用いて得られた吸光度の平均値の相対値 (%) を求め、 その 相関変位 (CV) と併せて表 4に示す。
表 4に於いて、 界面活性剤 (阻害物質) の濃度は、 蛋白質試料中の濃 度を示す。 また、 液相法のデータ中、 左側の値は界面活性剤の濃度を、
右側の値は対照に対する、 界面活性剤を含有する試料を用いた場合の平 均測定値の相対値 (%) 土 CVを示す。
尚、 表 4に示したデータは、 界面活性剤の最大許容濃度時のデ一夕、 すなわち、 添加剤として界面活性剤を用いた場合に、 対照 (添加剤なし) と比較して平均値が士 20%となる結果が得られた時のデータを示してい る。
4
衣
固 相 化 法. 液 相 法 界面活性剤 濃 度 BSA(4jUg) IgG(4ii^ OVA(5 g) BSAdO g) mean(%)土 CV mean(%)土 CV mean(%)土 CV mean(%)土 CV
SDS 1% (w/v) 87 ±7.1 (0.01%(w/v), 92±6.0)
2% (w/v) 82 ±6.2 100 ±0.9 117 ±2.2
4% (w/v) 103 ±4.3
SLS 2%(w/v) 101 ±1.9 (0.1%(w/v), 109±7.3)
3% (wv) 94 ±3,7
TritonX-100 1% (w/v) 112 ±0.2 (0.1%(w/v), 107土 3.9)
2% (w/v) 98 ±1.9 115 土 1.5 113 ±3.0
NP-40 1% (w/v) 96 土 4.5 115 ±3.0 (0.1%(w/v), 116±4.7)
2% (w/v) 90 ±1.2. 115 ±2.4
Tween 20 0.05%(w/v) 110 ±4.4
0.1% (w/v) 97 ±4.5 116 ±2.8 115 士 1.0
0.2% (w/v) 89 ±2.6 109 ±1.6
Tween 80 0.05%(w/v) 105 ±2.7
0.1%(w/v) 82 ±2.0 112 ±0.6 111 ±0.7 112 ±1.4
Briji 35 1% (w/v) 107 ±3.4 (0.1%(wv), 108±3.2)
2%(w/v) 93 ±3.9 112 ±2.9
CHAPS 1% (w/v) 96 ±2.6 111 土 2.2 (0.1%(w/v), 104±0.0)
2% (w/v) 91 ±1.3 116 ±1.3 106 士 0.9
CTAB 0.05%(w/v) 112 ±0.2
0.1%(w/v) 123 ±1.0
SLS: N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム
Triton X-100 (ロ-ム アンド ハ-ス社商品名) : ホ。リオキシエチレン (10)ォクチルフエ二ルェ-テル NP-40 (日本エマルシ'ヨン (株)商品名) :ホ。リオキシ Iチレン (9)ォクチルフ Iニルヱ-テル
Tween 20 (花王 (株)商品名) : ホ。リオキシエチレンリルビタンモノラウレ-ト
Tween 80 (花王 (株)商品名) : ホ。リオキシエチレンリルビタンモノ才レエ-ト
Brij 35 (ICI社商品名) :ホ。リオキシ; Iチレンラウリルヱ-テル
CHAPS: 3-[(3-コラミドつ。ロピル)シ'メチルアンモニオフ。ロハ。ンスルホン酸〗
CTAB:セチルトリメチルアンモニゥムフ'ロマイト' 表 4から明らかな如く、 本発明の方法により蛋白質を固定化し測定し た場合、 蛋白質試料の調製時に一般に用いられる界面活性剤が高濃度共 存していても、 それに影響を受けずに蛋白質の測定が可能であることが 判る。 特に液相法と比較すると、 液相法の 10 倍又はそれ以上の濃度の 界面活性剤が蛋白質試料 に添加剤として共存していても、 測定可能で あることが判る。
以上のことより、 本発明の蛋白質の固定化方法は、 従来より添加剤と して汎用されている界面活性剤に起因する問題、 即ち蛋白質の定量を阻 害するという問題を解決し得るものであることが判る。 実施例 1 0 . ィムノブロッテイング
[試料及び試液の調製]
(1)蛋白質試料
マウス IgG (和光純薬工業 (株)製) を秤量し、精製水に溶解して 0~200 gZmL溶液としたものを蛋白質試料として用いた。
(2)固定化用試液
精製水で、 0.2 W/V% SDS、 2.5 W/V% TCA, 45 V/V% エタノールを 含有する固定化用試液を調製した。
(3)固定化用試料
上記で調製した各濃度の蛋白質試料夫々 20 / Lと、 固定化用試液 300 Lを混合したもの (SDS終濃度 0.19W/V%、 TCA終濃度 2.34W/V%、 エタノール終濃度 42.2V/V%) を調製し、 固定化用試料とした。
(4)プロッキング溶液
ブロックエース (雪印乳業 (株)製) を終濃度 25%となるように PBS (pH7.4) で希釈したものを用いた。
(5)抗体溶液
発光検出用抗体溶液:西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG 抗体 (アマシャムバイオサイエンス製) をブロッキング溶液で 1/10000 希釈したものを用いた。
発色検出用抗体溶液:アルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG抗 体 (和光純薬工業 (株)製) をブロッキング溶液で 1/1000希釈したものを 用いた。
(6)洗浄液
Tween 20 を、 終濃度 0.05%となるように PBS (pH7.4) で希釈した ものを用いた。
(7)検出試薬
発光検出用 : ECL Plus Western Blotting Starter Kit (アマシャムハ"ィォサイエ ンス (株)製)
発色検出用 : 0.033% ニトロブル一テトラゾリゥム (NBT,和光純薬ェ 業 (株)製)、 0.0165。/。 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルリン酸 (BCIP、 和 光純薬工業(株)製) Z lOOmM Tris-HCl pH9.5 ( lOOmM NaCL 5mM MgCl2含有)
[蛋白質の固定化および測定]
実施例 1 と同様の方法で、 上記した如く調製した固定化用試料を PVDF膜にアプライし、 吸引濾過後、 PBS (pH7.4) をアプライ し、 同様に吸引濾過を行った。 PVDF膜を取り出し、 ブロッキング溶液 に浸し、 ローテーションさせながら室温で 1時間インキュベーションし た (ブロッキング操作)。 その後、 発光検出用抗体溶液又は発色検出用抗
体溶液に浸し、 ローテ一ションさせながら室温 1時間ィンキュベーショ ンした (抗体反応)。 抗体反応後の膜を洗浄液で 5 回洗浄した後、 発光 検出試薬又は発色検出試薬に浸し、, 検出反応を行った。 発光検出は、 PVDF膜を発光検出処理後、 X線フィルム (アマシャムバイオサイェン ス製) に感光させて検出を行った。
[結果]
結果を図 8に示す。 図 8に於いて、 Aは PVDF膜に固定化した蛋白質 試料の免疫検出を発光反応により行い、 X線フィルムに感光させ検出し たものである。 Bは、 PVDF膜に固定化した蛋白質試料の免疫検出を発 色反応により行い、 検出したものである。 また、 各ドットは、 蛋白質試 料を各蛋白質量として固定化後に検出した場合の結果を夫々示す。
図 8より明らかな如く、 ィムノブロッテイングにより発光検出、 発色 検出した場合の何れも、 膜に固定化したマウス IgGを検出することがで きた。発光検出での検出限界は 0.0625 g、発色検出での検出限界は 0.5 a であつ† 従って、 本発明の蛋白質の固定化方法により固定化すれ ば、 高感度の免疫検出 (ィムノブロッテイングによる検出) が行い得る ことが判った。 実施例 1 1 -
[異常型 PrPを含有する被検試料の調製]
( 1 ) 試液の調製:下記試液を調製した
①ホモジナイズ用溶液
50mM Tris-HCl PH7.4(l50mM NaCL ImM KCh ImM EDTA、 1W/V% デォキシコール酸ナトリウム、 1W/V% Triton X-100含有)
②プロテア一ゼ溶液
プロティナ一ゼ K ( Tritirachium a 《 由来、 和光純薬工業 (株)製) 300 ^ gを lOmM Tris-HCl pH7.4(l50mM NaCL ImM KCL ImM EDTA、 20W/V% SDS、 10W/V% Triton X- 100含有) 1 mLに溶解したもの。
③蛋白質沈降剤
2—ブタノール: メタノールの 5 : 1 (W/W)混合溶媒
④沈殿物溶解液
50mM Tris-HCl pH7.4(l50mM NaCL ImM KCL ImM EDTA、 0.005W/V% BSA、 2W/V% SDS含有)
( 2 ) 異常型 PrPを含有する被検試料の調製
BSE 感染牛小脳 (凍結融解を繰り返したもの) 組織小片 3 2 0 m g (湿重量)をホモジナイズ用溶液 1.3ml中でマルチビーズショッカー(安 井器械 (株)製) を用いてホモジナイズ後、 20で、 5000gで 5分間遠心分 離を行い、 上清を得た。
得られた上清 500 Lにプロテア一ゼ溶液 500 Lを加え、 37°Cで 10 分間反応させた後、 蛋白質沈降剤 500 z Lを添加し混合させた。
次いで、 この液を 20000gで 5分間遠心分離を行い、 沈殿物を得た。 得られた沈殿物に沈殿物溶解液 60 Lを加えて溶解後、 100 で 5分 間処理し、 プロティナ一ゼ Kを失活させ、 異常型 PrPの病原性を不活性 化させた。
得られた溶液を異常型 PrPを含有する被検試料として用いた。
[異常型 PrPの固定化]
( 1 ) 試液の調製
①固定化用試液 1
精製水で、 0.1 W/V% SDS、 2.5 W/V% TCA、 45 V/V% エタノールを 含有する固定化用試液 1を調製した。
②固定化用試液 2
精製水で、 0.1 W/V% Tween 20、 2.5 W/V% TCA, 45 V/V% ェタノ一 ルを含有する固定化用試液 2を調製した。
③異常型 PrP固定化用試料
上記で調製した異常型 PrP を含有する被検試料 20 L と、 固定化用 試液 1 200 Lを混合したもの (SDS終濃度 0.27 W/V°/。、 TCA終濃度 2.3 W/V%、 エタノール終濃度 41 V/V%) を調製し、 異常型 PrP固定化 用試料とした。
④洗浄液
Tween 20を、 終濃度 0.05%となるように PBS[pH7.4、 0.02V/V% ス ラオフ(日本エン^ィ Dケミカルス'(株)商品名)含有]で希釈したものを用いた。
⑤抗体溶液
西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗 BSE モノクロナール抗体 (動物 衛生研究所製) を P S(pH7.4、 20W/V% ダリセロール、 0.1W/V% BSA 含有)で 1/500希釈したものを用いた。
⑥発色液
TMB Solution (和光純薬工業 (株)製、 マイクロウエル用)を用いた。
⑦停止液 0.1M HC1水溶液を停止液として用いた。 [異常型 PrPの固定化および検出]
上記で調製した異常型 PrP固定化用試料を PVDF膜をセットしてあ るマルチプレート (ミリポア社製) にアプライし、 10分間静置後、 吸引 濾過した。 次いで固定化用試液 2 100 Lをアプライし、 同様に吸引濾 過、 更に洗浄液 300 L をアプライし、 同様に吸引濾過を行い、 PVDF 膜を洗浄し、 この洗浄操作を再度行った。
その後、抗体溶液 50 Lをアプライし、 20分間反応させた。反応後、
洗浄液 300 Lをアプライし吸引濾過する操作を 5回行い、 PVDF膜を 洗浄した。
次いで、 発色液 50 Lをアプライし、 30分間反応させた。
反応後、 発色液を ELISAプレート吸引濾過し、 停止液 50 L を添 加して反応を停止させた後、 マイクロプレートリーダー (Molecular Devices製)にて、 450nmの吸光度を測定した。
別に陰性コント口一ル (0.1W7V% BSA、 0.02%スラオフを含有する PBS) と陽性コントロール [50mM Tris-HCl ρΗ7·4、 20 H g/mL リコンビ ナント PrP rPrP、広島大学から供与された)、 150mM NaCl、 ImM KCL ImM EDTA, 0.005W/V% BSA, 2W/V% SDS 含有]を用いて同様に吸光 度の測定を行った。 結果を表 5に示す。 比較例 1 (従来の ELISA法)
日本バイオ ·ラッド ラボラトリーズ (株)製のブラテリア ®BSEキット を用い、 以下の通り、 異常型 PrPの検出を行った。
[異常型 PrPを含有する被検試料の調製]
BSE 感染牛小脳 (凍結融解を繰り返したもの) 組織小片 350mg (湿 重量) をホモジナイズ液 (グルコース 50mg/rnl) 1.4mL 中でマリチビ 一ズショッカーを用いてホモジナイズした。
得られたホモジネート 500 L にプロティナ一ゼ K ( Tritirachium album 由来) を Reagent A液、 ( 尿素 0.12g/ml) で希釈したもの 500 Lを加え、 37°Cで 10分間反応させた。
次いで反応液に Reagent B液 (3-ブ夕ノール) 500 Lを添加し、 よ く混和後、 20000gで 5分間遠心分離を行い、 沈殿物を得た。
沈殿物に Reagent C1液 (尿素 0.36g/ml) を添加して溶解し、 100°C で 5分間処理し、 プロティナ一ゼ Kを失活させ、 異常型 Ρι'Ρの病原性
を不活性化させた。
得られた溶液を異常型 PrPを含有する被検試料として用いた。
[異常型 PrPの検出]
上記で調製した異常型 PrPを含有する被検試料 17 /I Lを、 希釈液 83 L に溶解し抗ヒト PrP マウスモノクローナル抗体を結合した 96 穴 ELISA用プラスチックプレートのゥエルに滴下した後、 37 で 75分間 静置した。 次いで洗浄液 350 Lで、 ゥエルを洗浄する操作を 6回行つ た。
各ゥエルに POD標識抗ヒト PrPマウ〇ス οモノクローナル抗体溶液 100 Lを加え、 4でで 60分間反応させた。
各ゥエルを洗浄液(トリス緩衝液)で 10回洗浄した。 洗浄後、 各ゥエル に基質発色液(TMB溶液) 100 Lをアプライし、 30分間反応させた。 反応後各ゥエルに反応停止液 (0.5M 硫酸) 100 ju L を加えて反応を停 止させた。
マイクロプレートリーダー(Molecular Devices製)にて、 450nmの吸 光度を測定した。
別に陰性コントロール (0.1W/V% BSAを含有する PBS) と陽性コン トロール (ヒトプリオン蛋白合成ペプチド) を用いて同様に吸光度の測 定を行った。 結果を表 5に併せて示す。
5 吸光度
陰性対照 陽性対照 被検試料
実施例 1 1 0. 082 3. 258 3. 099
比較例 1 0. 072 0. 385
表 5から明らかな如く、 実施例 1 1においては固定化から検出までの 工程を 6 0分以内に行うことが出来たが、 比較例 1に於いては、 蛋白質 の固定化の段階のみで 75 分を要し、 本発明の方法の方が、 迅速に B S E感染の判定を行うことが出来ることがわかる。
また、 BSE検体を用いた場合、 比較例 1では BSE検体の吸光度は陽 性対照よりもかなり低くなつてしまい、 凍結融解を繰り返した BSE 感 染牛小脳を試料として用いた場合には、 信頼度の高い BSE の判定が行 えないことがわかった。 これに対し、 実施例 1 1では陽性対照と同等の 吸光度が測定され、 検体の状態に関わらず BSE の判定が行えることが わかった。 産業上の利用の可能性 本発明に係る蛋白質固定化方法によれば、 従来の固定化方法よりも充 分に蛋白質を固相に固定化できる。 また、 従来の固定化方法では正確に 行えなかった蛋白質の定量も行うことができる。 更に、 本発明に係る蛋 白質固定化方法を用いれば、 ィムノブロッティングを行った際の感度も 高くなるという効果を奏する。
更に、 本発明に係る異常型 PrPの検出方法によれば、 より迅速且つ高 精度で異常型 PrP を検出し、 プリオン病 (特に BSE) をより迅速に精 度良く判定することができるという効果を奏する。