JP2002236127A - 銀染色による高感度微量蛋白定量法 - Google Patents
銀染色による高感度微量蛋白定量法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、免疫学的な方法を使わず微量の尿蛋
白質を、高感度にかつ簡便に多数の検体を定量出来る方
法である。 【解決手段】本発明による染色液は、銀イオンを硫酸第
一鉄による還元剤とあらかじめ反応させ銀コロイド状に
した後、セルロースアセテート膜中の蛋白と銀コロイド
を結合させ安定化する方法を使用することにより定量化
することが可能となった。本発明は、緩衝化しない乾燥
状態にあるセルロースアセテート膜に直接検体を一定量
点着し、この状態のまま蛋白質をスルホサリチル酸とト
リクロル酢酸で固定した後、希釈した酢酸溶液で良く洗
浄する。洗浄後、前述の銀染色液で蛋白質を染色するこ
とで課題を解決した。
白質を、高感度にかつ簡便に多数の検体を定量出来る方
法である。 【解決手段】本発明による染色液は、銀イオンを硫酸第
一鉄による還元剤とあらかじめ反応させ銀コロイド状に
した後、セルロースアセテート膜中の蛋白と銀コロイド
を結合させ安定化する方法を使用することにより定量化
することが可能となった。本発明は、緩衝化しない乾燥
状態にあるセルロースアセテート膜に直接検体を一定量
点着し、この状態のまま蛋白質をスルホサリチル酸とト
リクロル酢酸で固定した後、希釈した酢酸溶液で良く洗
浄する。洗浄後、前述の銀染色液で蛋白質を染色するこ
とで課題を解決した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ヒトの臨床検査を行う上で、
最も簡単に安価にかつ人体に何の苦痛も無く採取出来る
検体の１つとして尿検査は重要視され、初診時や住民検
診などで、尿糖・尿蛋白質などの検査が日常的に実施さ
れている。本発明は、その中の１つである尿蛋白質の定
量検査に関するものである。普通ヒトにおいて正常成人
の尿蛋白質の出現は、１日１５０ｍｇ／Ｌ以下と言われ
ている。この１５０ｍｇ／Ｌという濃度は、血中総蛋白
質の量に比べ１／１０００程度である。尿蛋白質の約４
０％は、アルブミンであり、残りの６０％はいろいろな
種類のグロブリンである。病的な尿蛋白の出現は、腎前
性蛋白尿（ベンスジョーンズ蛋白尿、ヘモグロビン尿、
ミオグロビン尿）や腎性蛋白尿のうち糸球体性蛋白尿
（糸球体腎炎、腎盂腎炎、ネフローゼ、腎硬化症、妊娠
腎）、循環障害（うっ血腎、ショック腎）、その他の腎
前性蛋白尿（黄疸、脳出血、脳震糖とう、重症貧血、多
血症、糖尿病、胃炎、腸閉塞、熱射病、甲状腺機能亢進
症）、尿細管性蛋白尿（フアンコニ症候群、水銀・カド
ニゥム中毒）、腎後性蛋白尿（腎盂以下の炎症、結石、
腫瘍、潰瘍）などが知られている。尿の中に含まれる蛋
白を検査する方法としては、定性検査と定量検査があ
る。定性検査は、尿試験紙法による検査に代表されるよ
うに、尿中にある一定量以上の蛋白が含まれているかど
うか、または多量に含まれているかどうかなど大まかに
調べる方法である。それに対して定量検査は免疫法や色
素結合法で代表されるように蛋白の濃度が数値で得られ
るような検査で、医療機関が患者の重症度の判定、ある
いは経過観察などのために行うものとされてきた。
最も簡単に安価にかつ人体に何の苦痛も無く採取出来る
検体の１つとして尿検査は重要視され、初診時や住民検
診などで、尿糖・尿蛋白質などの検査が日常的に実施さ
れている。本発明は、その中の１つである尿蛋白質の定
量検査に関するものである。普通ヒトにおいて正常成人
の尿蛋白質の出現は、１日１５０ｍｇ／Ｌ以下と言われ
ている。この１５０ｍｇ／Ｌという濃度は、血中総蛋白
質の量に比べ１／１０００程度である。尿蛋白質の約４
０％は、アルブミンであり、残りの６０％はいろいろな
種類のグロブリンである。病的な尿蛋白の出現は、腎前
性蛋白尿（ベンスジョーンズ蛋白尿、ヘモグロビン尿、
ミオグロビン尿）や腎性蛋白尿のうち糸球体性蛋白尿
（糸球体腎炎、腎盂腎炎、ネフローゼ、腎硬化症、妊娠
腎）、循環障害（うっ血腎、ショック腎）、その他の腎
前性蛋白尿（黄疸、脳出血、脳震糖とう、重症貧血、多
血症、糖尿病、胃炎、腸閉塞、熱射病、甲状腺機能亢進
症）、尿細管性蛋白尿（フアンコニ症候群、水銀・カド
ニゥム中毒）、腎後性蛋白尿（腎盂以下の炎症、結石、
腫瘍、潰瘍）などが知られている。尿の中に含まれる蛋
白を検査する方法としては、定性検査と定量検査があ
る。定性検査は、尿試験紙法による検査に代表されるよ
うに、尿中にある一定量以上の蛋白が含まれているかど
うか、または多量に含まれているかどうかなど大まかに
調べる方法である。それに対して定量検査は免疫法や色
素結合法で代表されるように蛋白の濃度が数値で得られ
るような検査で、医療機関が患者の重症度の判定、ある
いは経過観察などのために行うものとされてきた。
【０００２】
【従来の技術】検査法：従来使われている尿蛋白質の検
査法は、スルホサリチル酸法と煮沸法及び試験紙法など
の定性検査が主体である。特に試験紙法は、住民や学童
の健康診断などに広く使われており良く知られている。
尿蛋白質の定量検査は、尿中に排出される尿蛋白質が非
常に微量のため放射線標識免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素
標識免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテックス凝集測定法（Ｌ
ＡＰＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）などの免疫学的な測定
法が使われている。これらの測定法は全て抗原抗体反応
を利用する免疫学的測定法である。免疫学的測定法は微
量の蛋白質を測定するのに利用できるが、高価な抗体を
使用するので測定キットは非常に高価なものになってい
る。これらの測定法の感度は、ほぼ５０ｍｇ／Ｌを目標
に作られている。これらの測定キットは蛋白質のうちア
ルブミンを特異的に検出する測定法が多く、総蛋白質を
測定するものではない。発明の属する技術分野で説明し
たように、尿中のアルブミンは蛋白質の約４０％を占め
残りの６０％は各種のグロブリンの集合体である。もし
グロブリンも測定する測定法を作る場合は各種のグロブ
リンに対応して多くの抗体を使うか、その特異性を吟味
してキットを作らねばならないので、総蛋白質を定量す
る免疫学的測定法は実質高価になりすぎ実用的では無
い。結局免疫学的測定法はそれぞれの特異蛋白質を個々
に測定するのに有効な測定法で、高感度で簡便にかつ安
価に総蛋白質を測定する方法は開発されていなかった。
一般的には色素結合法が用いられているが、感度は約３
００ｍｇ／Ｌと低い。尿中蛋白質には、Ｍ蛋白（ベンス
ジョーンズ蛋白、多発性骨髄腫などの腫瘍細胞が産生す
る蛋白）やＩｇＧ（非選択的糸球体性蛋白尿）、α１ミ
クログロブリン・β２ミクログロブリン（尿細管性蛋白
尿、糸球体、混合性蛋白尿尿）などのグロブリン領域の
蛋白質もある。医師は、尿中の総蛋白質（定量値）や尿
蛋白分画を見ながら総合的に診断を行い、治療をするこ
とが求められているが、従来の測定法では感度が低いの
で診断にあまり役に立っていなかった。個別的な技術に
ついて：従来利用していた支持体であるポリアクリルア
ミドゲルやアガロースゲル用の銀染色液は、銀イオンを
これらのゲル中の蛋白と結合させた後、ホルマリンなど
の還元剤で還元して銀粒子にする方法であった。この従
来の銀染色液は、高分子多孔質膜の一種であるセルロー
スアセテート膜の蛋白質を全く染色できなかったので、
使用されていなかった。
査法は、スルホサリチル酸法と煮沸法及び試験紙法など
の定性検査が主体である。特に試験紙法は、住民や学童
の健康診断などに広く使われており良く知られている。
尿蛋白質の定量検査は、尿中に排出される尿蛋白質が非
常に微量のため放射線標識免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素
標識免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテックス凝集測定法（Ｌ
ＡＰＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）などの免疫学的な測定
法が使われている。これらの測定法は全て抗原抗体反応
を利用する免疫学的測定法である。免疫学的測定法は微
量の蛋白質を測定するのに利用できるが、高価な抗体を
使用するので測定キットは非常に高価なものになってい
る。これらの測定法の感度は、ほぼ５０ｍｇ／Ｌを目標
に作られている。これらの測定キットは蛋白質のうちア
ルブミンを特異的に検出する測定法が多く、総蛋白質を
測定するものではない。発明の属する技術分野で説明し
たように、尿中のアルブミンは蛋白質の約４０％を占め
残りの６０％は各種のグロブリンの集合体である。もし
グロブリンも測定する測定法を作る場合は各種のグロブ
リンに対応して多くの抗体を使うか、その特異性を吟味
してキットを作らねばならないので、総蛋白質を定量す
る免疫学的測定法は実質高価になりすぎ実用的では無
い。結局免疫学的測定法はそれぞれの特異蛋白質を個々
に測定するのに有効な測定法で、高感度で簡便にかつ安
価に総蛋白質を測定する方法は開発されていなかった。
一般的には色素結合法が用いられているが、感度は約３
００ｍｇ／Ｌと低い。尿中蛋白質には、Ｍ蛋白（ベンス
ジョーンズ蛋白、多発性骨髄腫などの腫瘍細胞が産生す
る蛋白）やＩｇＧ（非選択的糸球体性蛋白尿）、α１ミ
クログロブリン・β２ミクログロブリン（尿細管性蛋白
尿、糸球体、混合性蛋白尿尿）などのグロブリン領域の
蛋白質もある。医師は、尿中の総蛋白質（定量値）や尿
蛋白分画を見ながら総合的に診断を行い、治療をするこ
とが求められているが、従来の測定法では感度が低いの
で診断にあまり役に立っていなかった。個別的な技術に
ついて：従来利用していた支持体であるポリアクリルア
ミドゲルやアガロースゲル用の銀染色液は、銀イオンを
これらのゲル中の蛋白と結合させた後、ホルマリンなど
の還元剤で還元して銀粒子にする方法であった。この従
来の銀染色液は、高分子多孔質膜の一種であるセルロー
スアセテート膜の蛋白質を全く染色できなかったので、
使用されていなかった。
【０００３】
【発明が解決しょうとする課題】本発明は、免疫学的な
方法を使わず微量の尿蛋白質を、高感度にかつ簡便に多
数の検体を定量出来る方法である。高価な抗体を使わな
い点で安価な測定法を提供できるようになった。「従来
の技術」で述べたように、５０ｍｇ／Ｌ程度の濃度を定
量するには、高価な抗体を使う免疫学的測定法を利用す
るのが普通である。本発明は抗原抗体反応を使わず微量
の蛋白質を安価に測定できるようにした点が特長であ
る。また、高感度用として従来から使用されていた銀染
色法は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル
を使用しており、言い換えればポリアクリルアミドゲル
またはアガロースゲルのようなゲル状の支持体でないと
目的の蛋白質をうまく染めることが困難あるのみならず
操作が非常に煩雑でかつ長時間を要していた。従来か
ら、支持体の１つであるセルロースアセテート膜電気泳
動用として使われている蛋白質の染色液には、ニグロシ
ンやピロガロールレッドおよびアシッドレットなどがあ
るが、これらは蛋白質の定量のためには感度が悪かっ
た。本発明は、従来困難であった高分子多孔質膜の支持
体の１つであるセルロースアセテート膜に微量蛋白質の
染色固定が出来るようになったばかりか、その支持体自
身へ吸着の無い銀染色液を使用することにより緩衝化し
た高分子多孔質膜を使用して銀染色すると緩衝剤が蛋白
質に干渉することにより銀が蛋白に固着しにくくなり定
量化出来なかった。この銀染色法を定量に用いるために
は、支持体に蛋白質を安定に固定しなければならず、ま
た支持体自体を染めないという条件が必要であった。さ
らに光学的にその濃度を測定するためには、透明化ある
いは半透明化しても染まった銀コロイドが溶け出さず安
定的に固定されていなければならない。
方法を使わず微量の尿蛋白質を、高感度にかつ簡便に多
数の検体を定量出来る方法である。高価な抗体を使わな
い点で安価な測定法を提供できるようになった。「従来
の技術」で述べたように、５０ｍｇ／Ｌ程度の濃度を定
量するには、高価な抗体を使う免疫学的測定法を利用す
るのが普通である。本発明は抗原抗体反応を使わず微量
の蛋白質を安価に測定できるようにした点が特長であ
る。また、高感度用として従来から使用されていた銀染
色法は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル
を使用しており、言い換えればポリアクリルアミドゲル
またはアガロースゲルのようなゲル状の支持体でないと
目的の蛋白質をうまく染めることが困難あるのみならず
操作が非常に煩雑でかつ長時間を要していた。従来か
ら、支持体の１つであるセルロースアセテート膜電気泳
動用として使われている蛋白質の染色液には、ニグロシ
ンやピロガロールレッドおよびアシッドレットなどがあ
るが、これらは蛋白質の定量のためには感度が悪かっ
た。本発明は、従来困難であった高分子多孔質膜の支持
体の１つであるセルロースアセテート膜に微量蛋白質の
染色固定が出来るようになったばかりか、その支持体自
身へ吸着の無い銀染色液を使用することにより緩衝化し
た高分子多孔質膜を使用して銀染色すると緩衝剤が蛋白
質に干渉することにより銀が蛋白に固着しにくくなり定
量化出来なかった。この銀染色法を定量に用いるために
は、支持体に蛋白質を安定に固定しなければならず、ま
た支持体自体を染めないという条件が必要であった。さ
らに光学的にその濃度を測定するためには、透明化ある
いは半透明化しても染まった銀コロイドが溶け出さず安
定的に固定されていなければならない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】従来の技術で述べたよう
な従来の銀染色法を、ポリアクリルアミドゲル等を用い
る場合に比し遙かに安価で操作の簡便な高分子多孔質膜
に使用すると銀が固定されず結果的に使用できなかっ
た。本発明は、高分子多孔質膜に使用する染色液にする
ため、銀イオンを硫酸第一鉄による還元剤とあらかじめ
反応させ銀コロイド状にした後、セルロースアセテート
膜中の蛋白と銀コロイドを結合させ安定化する方法を使
用することにより定量化することが可能となった。本発
明は、緩衝化しない乾燥状態にあるセルロースアセテー
ト膜に直接検体を一定量点着し、この状態のまま蛋白質
をスルホサリチル酸とトリクロル酢酸で固定した後、希
釈した酢酸溶液で良く洗浄する。洗浄後、前述の銀染色
液で蛋白質を染色することで課題を解決した。高分子多
孔質膜に、乾燥したものを使用したものは、緩衝液・水
分その他の液体で湿潤状態にあるものを使用する場合に
比して感度が高くなるばかりでなく均一度・精度を著し
く向上させることが出来た。さらに炭酸水素ナトリウム
と炭酸ナトリウムからなるアルカリ性の固着液で「銀−
蛋白質結合体」をより完全に固定させた。これにより支
持体の透明化に用いるデカリンや流動パラフィンおよび
透明化試薬にも「銀−蛋白質結合体」が溶け出さず安定
になり精度が著しく向上した方法を発明する事が出来
た。
な従来の銀染色法を、ポリアクリルアミドゲル等を用い
る場合に比し遙かに安価で操作の簡便な高分子多孔質膜
に使用すると銀が固定されず結果的に使用できなかっ
た。本発明は、高分子多孔質膜に使用する染色液にする
ため、銀イオンを硫酸第一鉄による還元剤とあらかじめ
反応させ銀コロイド状にした後、セルロースアセテート
膜中の蛋白と銀コロイドを結合させ安定化する方法を使
用することにより定量化することが可能となった。本発
明は、緩衝化しない乾燥状態にあるセルロースアセテー
ト膜に直接検体を一定量点着し、この状態のまま蛋白質
をスルホサリチル酸とトリクロル酢酸で固定した後、希
釈した酢酸溶液で良く洗浄する。洗浄後、前述の銀染色
液で蛋白質を染色することで課題を解決した。高分子多
孔質膜に、乾燥したものを使用したものは、緩衝液・水
分その他の液体で湿潤状態にあるものを使用する場合に
比して感度が高くなるばかりでなく均一度・精度を著し
く向上させることが出来た。さらに炭酸水素ナトリウム
と炭酸ナトリウムからなるアルカリ性の固着液で「銀−
蛋白質結合体」をより完全に固定させた。これにより支
持体の透明化に用いるデカリンや流動パラフィンおよび
透明化試薬にも「銀−蛋白質結合体」が溶け出さず安定
になり精度が著しく向上した方法を発明する事が出来
た。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、銀染色液として硝酸銀
の他、硫酸銀・乳酸銀などを用い事が出来る。さらに還
元剤として硫酸第一鉄の他、亜硫酸ソーダ・ホルマリン
・塩化錫（２価）などを用いる事ができる。アルカリ性
固着剤として炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム溶液
の他、グリシン−水酸化ナトリウム溶液、トリスアミノ
メタン−水酸化ナトリウム溶液等を用いる事が出来る。
の他、硫酸銀・乳酸銀などを用い事が出来る。さらに還
元剤として硫酸第一鉄の他、亜硫酸ソーダ・ホルマリン
・塩化錫（２価）などを用いる事ができる。アルカリ性
固着剤として炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム溶液
の他、グリシン−水酸化ナトリウム溶液、トリスアミノ
メタン−水酸化ナトリウム溶液等を用いる事が出来る。
【実施例１】図１において緩衝化しない乾燥状態のセル
ロースアセテート膜（１）上にボールペン等で等間隔に
区画（２）をつくり、その１つ１つの中心に、検量線用
の標準液と患者の尿検体をマイクロピペットで正確に３
μＬずつ点着塗布（３）する。この検体を塗布したセル
ロースアセテート膜を０．２ｇ／ｄＬのスルホサリチル
酸１容と９．８ｇ／ｄＬのトリクロル酢酸１容からなる
固定液で先ず蛋白質を固定する。固定後１％酢酸で十分
洗浄し、表１に示す銀染色液で蛋白質を染色する。染色
後水洗し０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムと０．１Ｍ炭酸ナ
トリウムからなるアルカリ性の固着液（ＰＨ：９．０）
でさらに固着する。乾燥後デカリンで透明化または透明
化試液の泳動用緩衝液で透明化して比色計（濃度計）で
吸光度を測定して、検量線から濃度を求める。図１にお
いて枠で囲んだ（４）は、検量線用の既知濃度の蛋白質
を銀染色したもので、蛋白質が薄いものが一番左で、右
に順次移る度に濃度が濃くなっている。枠（４）で囲ん
でいないドット（５）は５２人の患者尿検体を点着し固
定して銀染色をしたものである。図２は図１の枠（４）
で囲んだ部分いわゆる検量線用のドットを比色計で読み
とり、その吸光度（ＯＤ）を縦軸に、検量線用の既知蛋
白濃度（ｍｇ／Ｌ）を横軸にプロットした検量線であ
る。次に濃度未知の尿検体を銀染色したドット（５）を
比色計で読み取った吸光度（６）を図２の検量線の縦軸
に当てはめて、検量線と交わる点に垂線を立てて横軸と
交わった濃度を読みとり、未知濃度の尿検体の総蛋白質
の濃度が測定できた。この濃度を求める方法は、コンピ
ュータ等を使うことにより瞬時に求めることが出来た。
これにより求められた微量尿蛋白質の濃度は、わずか
２．５ｍｇ／Ｌの濃度から測定できた。
ロースアセテート膜（１）上にボールペン等で等間隔に
区画（２）をつくり、その１つ１つの中心に、検量線用
の標準液と患者の尿検体をマイクロピペットで正確に３
μＬずつ点着塗布（３）する。この検体を塗布したセル
ロースアセテート膜を０．２ｇ／ｄＬのスルホサリチル
酸１容と９．８ｇ／ｄＬのトリクロル酢酸１容からなる
固定液で先ず蛋白質を固定する。固定後１％酢酸で十分
洗浄し、表１に示す銀染色液で蛋白質を染色する。染色
後水洗し０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムと０．１Ｍ炭酸ナ
トリウムからなるアルカリ性の固着液（ＰＨ：９．０）
でさらに固着する。乾燥後デカリンで透明化または透明
化試液の泳動用緩衝液で透明化して比色計（濃度計）で
吸光度を測定して、検量線から濃度を求める。図１にお
いて枠で囲んだ（４）は、検量線用の既知濃度の蛋白質
を銀染色したもので、蛋白質が薄いものが一番左で、右
に順次移る度に濃度が濃くなっている。枠（４）で囲ん
でいないドット（５）は５２人の患者尿検体を点着し固
定して銀染色をしたものである。図２は図１の枠（４）
で囲んだ部分いわゆる検量線用のドットを比色計で読み
とり、その吸光度（ＯＤ）を縦軸に、検量線用の既知蛋
白濃度（ｍｇ／Ｌ）を横軸にプロットした検量線であ
る。次に濃度未知の尿検体を銀染色したドット（５）を
比色計で読み取った吸光度（６）を図２の検量線の縦軸
に当てはめて、検量線と交わる点に垂線を立てて横軸と
交わった濃度を読みとり、未知濃度の尿検体の総蛋白質
の濃度が測定できた。この濃度を求める方法は、コンピ
ュータ等を使うことにより瞬時に求めることが出来た。
これにより求められた微量尿蛋白質の濃度は、わずか
２．５ｍｇ／Ｌの濃度から測定できた。
【実施例２】緩衝化しない乾燥状態のセルロースアセテ
ート膜上に、一定間隔に検量線線用の標準液と患者の脳
脊髄液を多数点着出来る自動式マイクロピペットで正確
に３μＬずつ図１のように点着塗布する。その後実施例
１と同様に、この検体を塗布したセルロースアセテート
膜を０．２ｇ／ｄＬのスルホサリチル酸１容と９．８ｇ
／ｄＬのトリクロル酢酸１容からなる固定液で先ず蛋白
質を固定し、１％酢酸で十分洗浄し、銀染色液で蛋白質
を染色する。そしてアルカリ性の固着液（ＰＨ：９．
０）でさらに固着する。乾燥後デカリンで透明化または
透明化試液の泳動用緩衝液で透明化して比色計（濃度
計）で吸光度を測定して、検量線から濃度を求めた。こ
の濃度を求める方法は、コンピュータ等を使うことによ
り瞬時に求めることが出来た。これにより求められた微
量脳脊髄液中の蛋白質の濃度は、わずか２．５ｍｇ／Ｌ
の濃度から測定できた。実施例２では脳脊髄液の定量が
出来ることを示したが、蛋白質濃度の低い例えば、涙・
唾液・血漿蛋白質の希釈検体および他の動植物の微量蛋
白質などを同様に操作することでそれぞれ定量する事が
出来る。
ート膜上に、一定間隔に検量線線用の標準液と患者の脳
脊髄液を多数点着出来る自動式マイクロピペットで正確
に３μＬずつ図１のように点着塗布する。その後実施例
１と同様に、この検体を塗布したセルロースアセテート
膜を０．２ｇ／ｄＬのスルホサリチル酸１容と９．８ｇ
／ｄＬのトリクロル酢酸１容からなる固定液で先ず蛋白
質を固定し、１％酢酸で十分洗浄し、銀染色液で蛋白質
を染色する。そしてアルカリ性の固着液（ＰＨ：９．
０）でさらに固着する。乾燥後デカリンで透明化または
透明化試液の泳動用緩衝液で透明化して比色計（濃度
計）で吸光度を測定して、検量線から濃度を求めた。こ
の濃度を求める方法は、コンピュータ等を使うことによ
り瞬時に求めることが出来た。これにより求められた微
量脳脊髄液中の蛋白質の濃度は、わずか２．５ｍｇ／Ｌ
の濃度から測定できた。実施例２では脳脊髄液の定量が
出来ることを示したが、蛋白質濃度の低い例えば、涙・
唾液・血漿蛋白質の希釈検体および他の動植物の微量蛋
白質などを同様に操作することでそれぞれ定量する事が
出来る。
【実施例３】実施例１において、高分子多孔質膜として
緩衝化しない乾燥状態のセルロースアセテート膜を使用
したが、その他の高分子多孔質膜としてろ紙・ナイロン
膜・ニトロセルロース膜・ポリスルホン膜等も支持体と
して用いて同様の操作法で定量する事が出来た。
緩衝化しない乾燥状態のセルロースアセテート膜を使用
したが、その他の高分子多孔質膜としてろ紙・ナイロン
膜・ニトロセルロース膜・ポリスルホン膜等も支持体と
して用いて同様の操作法で定量する事が出来た。
【０００６】
【発明の効果】本発明により、高価な抗原抗体反応を使
用することなく微量蛋白質を２．５ｍｇ／Ｌから簡便か
つ安価に定量出来るようになった。従来の技術で述べた
ように抗原抗体測定法で定量できるのはアルブミン等個
々の特異的蛋白質であって、総蛋白質を２．５ｍｇ／Ｌ
から測定できる測定法は本発明が最初の測定法である。
この発明を活用することで、腎症患者特に腎障害の初期
において正確に的確に診断出来るようになり、治療効果
の把握にも活用出来る。また医薬品（例えば制癌剤や抗
生物質）等の投与による副作用としての腎障害を早期に
見つける事が出来る。また学童検診や住民検診及び人間
ドック等における検診分野においても、異常をより早期
発見することが出来るようになる。早期発見で疾病の発
病を遅らせたり、早期に治療できることにより、本人の
健康維持に役立つとともに、結果的に医療費を減少させ
ることが出来るので社会に大きく貢献できることにな
る。一般的には、検診や病院での初期検査において、最
初の総蛋白質の検出感度が悪ければ、正常として見逃さ
れ結果的に、次のステップの検査を実施する事は事実上
不可能である。本発明により、微量の尿蛋白質の出現を
検知出来ることは、出現した蛋白質が異常なのか正常な
のか、次の検査をするかどうかの判断材料を与える事に
なる。（次の検査とは、電気泳動法または免疫電気泳動
またはその他の免疫学的定量法を意味する。）
用することなく微量蛋白質を２．５ｍｇ／Ｌから簡便か
つ安価に定量出来るようになった。従来の技術で述べた
ように抗原抗体測定法で定量できるのはアルブミン等個
々の特異的蛋白質であって、総蛋白質を２．５ｍｇ／Ｌ
から測定できる測定法は本発明が最初の測定法である。
この発明を活用することで、腎症患者特に腎障害の初期
において正確に的確に診断出来るようになり、治療効果
の把握にも活用出来る。また医薬品（例えば制癌剤や抗
生物質）等の投与による副作用としての腎障害を早期に
見つける事が出来る。また学童検診や住民検診及び人間
ドック等における検診分野においても、異常をより早期
発見することが出来るようになる。早期発見で疾病の発
病を遅らせたり、早期に治療できることにより、本人の
健康維持に役立つとともに、結果的に医療費を減少させ
ることが出来るので社会に大きく貢献できることにな
る。一般的には、検診や病院での初期検査において、最
初の総蛋白質の検出感度が悪ければ、正常として見逃さ
れ結果的に、次のステップの検査を実施する事は事実上
不可能である。本発明により、微量の尿蛋白質の出現を
検知出来ることは、出現した蛋白質が異常なのか正常な
のか、次の検査をするかどうかの判断材料を与える事に
なる。（次の検査とは、電気泳動法または免疫電気泳動
またはその他の免疫学的定量法を意味する。）
【図１】本発明により染色されたドットブロット
【図２】検量線の図
（１） 支持体 （２） 枠 （３） 点着した検体を染色したドット （４） 検量線の範囲 （５） 患者検体を染色したドット （６） 濃度未知検体の吸光度 （７） 濃度未知検体の測定値
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA16 BB14 BB21 BB22 BB24 BB51 CB03 DA36 DA38 FB15 GC10 JA01 4H045 AA30 CA44 EA50 FA80
Claims (3)
- 【請求項１】乾燥状態にある高分子多孔質膜上に一定量
の検体を多数点着し、その中の微量蛋白質を固定化した
上で、銀を特異的に結合させ可視状態にすることによ
り、微量蛋白質を定量できることを特長とした銀染色高
感度微量蛋白定量法。 - 【請求項２】乾燥状態にある高分子多孔質膜上に固定し
た微量蛋白を染色する銀染色液は、銀イオンを還元剤と
あらかじめ反応させコロイド状にした後、高分子多高孔
質膜上の蛋白と結合させることで安定化し、かつ支持体
の高分子多孔質膜自体を染めないことを特長とする銀染
色による高感度微量蛋白定量法。 - 【請求項３】高分子多孔質膜上に固定された「銀−蛋白
質結合体」を、アルカリ性の固着液でさらに安定なコロ
イド状態にすることを特長とする銀染色による高感度微
量蛋白定量法。
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|---|---|---|---|
| JP2001073092A JP3518746B2 (ja) | 2001-02-08 | 2001-02-08 | 銀染色による高感度微量蛋白定量法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2005070969A1 (ja) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 蛋白質の固定化方法及び定量方法 |
| JP2009098139A (ja) * | 2007-09-28 | 2009-05-07 | Fujifilm Corp | イムノクロマトグラフ方法 |
| KR100915584B1 (ko) * | 2007-09-27 | 2009-09-03 | 주식회사 베네비오 | 단백질 염색용 조성물 |
| JP2009287952A (ja) * | 2008-05-27 | 2009-12-10 | Fujifilm Corp | イムノクロマトグラフ方法 |
| JP2010217064A (ja) * | 2009-03-18 | 2010-09-30 | Fujifilm Corp | クロマトグラフ方法 |
-
2001
- 2001-02-08 JP JP2001073092A patent/JP3518746B2/ja not_active Expired - Fee Related
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