JP5048207B2 - 敗血症状態の発症および存在を決定するための装置及び方法 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は、敗血症状態の発症および存在を迅速に決定するための新規かつ有用な装置及び方法に関する。

ヒトのような哺乳動物被験体における感染は、様々な種類の微生物により直接的に、および医療上の外傷を介して間接的に起こり得る。例えば、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、ウイルス、ならびに菌類が、そのような感染を引き起こす可能性がある。ある場合には、「敗血症状態」は、そのような感染から生じている可能性がある。そのような「敗血症状態」には、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、重症敗血症、および敗血性ショックが含まれる。後者の症状では、多臓器不全を被験体に引き起こす。米国内だけでも敗血性ショックが原因で、毎年、数十万人が死亡していると推測されている。

敗血症状態の早期予測は、この疾患を患っている患者を処置するための治療法を開始する上で、極めて重要である。例えば、敗血症状態を処置するための現在の治療法には、抗生物質療法と補液療法を組み合わせて行うことが含まれる。初期の全身性炎症反応症候群(SIRS)は、ヒトでは以下の2項目以上に該当する状態と定義されることが知られている：
1. 体温が36 ℃未満または38 ℃を越えている；
2. 心拍数が90を越えている；
3. 呼吸数が20を越えている；または
4. 白血球カウント数が1 mlあたり4×10⁶個未満もしくは1 mlあたり12×10⁶個を越えている。
「敗血症」は、培養による感染の立証を伴うSIRSの状態である［敗血症患者は、全身性血管抵抗疾患で見られるような心拍出量の増加を伴うが、臓器潅流(血流量)は低い］。「重症敗血症」は、臓器不全、低血圧、または低潅流をさらに伴う敗血症の状態である。「敗血性ショック」は、低潅流異常を伴う低血圧(輸液蘇生にもかかわらず)と定義される。組織低潅流(血流量の低下)による細胞死の結果として、臓器不全が起こる。

上述の敗血症状態の原因物質により、誘導型の酸化窒素合成酵素(iNOS)による一酸化窒素(NO)の過剰産生が指摘されている。グラム陰性細菌の細胞壁由来成分であるリポ多糖体(LPS)およびグラム陽性細菌の細胞壁由来のリポタイコ酸とペプチドグリカンの組み合わせにより、TNFα、IL-1β、およびIL-6のような炎症性サイトカインの放出が引き起こされることが証明された。細菌成分と炎症性サイトカインの相互作用により、次にiNOSの産生が引き起こされ得る。次いで、iNOSにより産生されるNOの生成増加により、血管透過性亢進、血管拡張、低血圧、組織低潅流、および最後には臓器不全に至る。上述のように、これらの状態は、重症敗血症および敗血性ショックの徴候である。従って、全身性血管拡張および血管透過性亢進を引き起こすのは、平滑筋とその血管内皮へのNOの作用によるものであると一般的に考えられている。これが次には、多臓器不全を引き起こす、低血圧および組織低潅流(血流量の低下)の原因となる。

敗血症状態を処置するために用いられている治療法は有用であるが、できる限り早期の介在を可能とするため、有意義な指標が必要とされる。Kregerらによる「Gram-Negative Bacteremia, IV: Reevaluation of Clinical Features in Treatment in 612 Patients」と題する論文に、抗生物質の早期開始により、敗血性ショックと死亡の頻度が50 %縮小されることが示されている。

現在のところ、SIRSおよび敗血症のような敗血症状態に対する確定的な臨床迅速診断は存在していない。現在の手順の中に、Sandsらによる「Epidemiology of Sepsis Syndrome in 8 Academic Medical Centers」と題する文献に記載された手順があるが、これには血液培養手順が含まれている。残念ながら、血液培養技術は緩慢であり、結果が出るまでに24〜48時間がかかる。加えて、血液培養試験は不正確であり、SIRS患者の約28 %が敗血症状態の存在を示す陽性結果となるに過ぎない。

Rinheartらによる「Assessment of the Safety and Efficacy of the Monoclonal Anti-Tumor Necrosis Factor Antibody-Fragment, MAK 195F, in Patients with Sepsis and Septic Shock: A Multicenter, Randomized, Placebo-Controlled, Dose-Ranging Study」と題する文献、およびFischkoffによる「Interleukin-6 Measurements in Selection of Sepsis Patients for Anti-cytokine Therapy」と題するもう一つの文献により、1,000 pg/mlを越えるインターロイキン-6 (IL-6)の存在は、過剰炎症状態(hyperinflammatory conditions)と関連しており、モノクローナル抗体治療、MAK 195Fを受けている敗血症患者での予後不良の予測となるに過ぎないことが示唆されている。

米国特許第5,639,617号には、患者の生物学的液体中のプロカルシトニンの存在を識別することによる、患者における敗血症の早期検出についての説明がある。しかし、プロカルシトニンの存在によっては、敗血症状態の一原因、すなわちグラム陰性細菌について示されるに過ぎない。

血液中の亜硝酸塩または硝酸塩の濃度増加もまた、敗血症と関連性がある。しかし、血液中の亜硝酸塩/硝酸塩の存在と、SIRSまたは敗血症状態を患う患者の状態とは正の相関関係がなかった。

敗血症患者において、その誘導白血球からのiNOSの検出が達成された。しかし、そのような決定法では、iNOSの量が非常に変化しやすいことが明らかにされており、必ずしも敗血症状態の存在と関連性があるわけではない。

SIRS、敗血症、重症敗血症、および/または敗血症ショックの発症および存在を迅速に決定するための測定法は、医療分野において注目すべき躍進であると思われる。

発明の概要
本発明により、敗血症状態の存在を決定する測定を行うための新規かつ有用な装置及び方法が本明細書中で提供される。

本発明の免疫測定法は、全血、血漿、および血清のような血液の液体部分中におけるiNOSの量を測定するうえで特に有用である。しかし、他の生物学的試料を使用することもできる。細胞内酵素iNOSが、SIRSの初期段階にあたる、重症敗血症の発症の24〜48時間前に、哺乳動物の被験体、例えばヒト患者の循環系に少量放出されることが判明した。従って、本発明の免疫測定法により血液の液体部分中のiNOSを検出および測定することは、SIRS、敗血症、重症敗血症、および敗血性ショックのような敗血症状態の発症に対する有用な指標として役立つ。敗血症状態の経過観察および敗血症状態の治療経過の評価に、血漿、血清、および全血中のiNOSの定量測定を利用できることも判明した。

本発明には、哺乳動物被験体の血液中の誘導性酸化窒素合成酵素(iNOS)の濃度を検出および測定する際に使用する免疫測定法が含まれる。特に、血液の液体部分をその際に使用する。本発明の一つの局面には、二部位を用いる、サンドイッチ型固相免疫測定法の使用が含まれる。第一部位には、抗iNOSモノクローナル抗体を使用する。その抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、1997年4月7日に出願された米国特許出願第08/833,506号中の、21C10-1D10として特定される抗iNOS抗体のクローンでありうる。その抗体は、哺乳動物被験体の血液の液体部分試料中に含まれるどのiNOSにも結合するので、「捕捉用」抗体として知られている。標識二次モノクローナル抗体を、一段階または二段階の反応系で「検出用」抗体として使用することもできる。例えば、上記の特許出願でクローン2A1-F8として特定される抗iNOSモノクローナル抗体をビオチン化したものは、この点を十分に満たす。アッセイ法は、固体支持体または固体担体上で行われる。固体支持体または固体担体は、iNOSまたは抗iNOS抗体を結合できる任意の固体材料とすることができる。そのような固体支持体は、免疫測定法において周知であり、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、ガラス、デキストラン、ナイロン、マグネタイト、セルロース、改変型セルロース、およびアミラーゼを含むが、これらに限定されない。支持体は、ビーズとして球状に、またはシートもしくはテストストリップとして平面状にすることができる。さらに、支持体は、試験管の内部表面のように、円筒型としてもよい。本質的には、固体支持体または固体担体は、捕捉用抗体とiNOSがその上で互いに結合できるならば、実質的にはどのような形状の構造物であってもよい。例えば、マイクロタイタープレートは、この機能をうまく果たすことがよく知られている。

本発明の一つの形態において、検出用標識抗体には、ストレプトアビジン、アビジン、アビジン-ビオチン複合体(ABC)、抗ビオチン抗体などのような「結合パートナー」が結合している。その結合パートナーは、次に、酵素免疫測定法(EIA)または酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)方式において、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素と結合する。

または、検出用の精製抗体またはその結合パートナーを、酵素または蛍光色素、発光化合物、放射性元素、蛍光性金属キレート複合体などのような他の標識と直接結合することができる。例えば、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、およびランタノイド系に見出されるその他のもののような蛍光発光金属を使用してもよい。そのような金属は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、またはテトラアザシクロドデカン四酢酸(DOTA)のような基とキレート化する。励起後に、これらの金属キレート複合体から放出される蛍光を、蛍光測定法または時間分解蛍光測定法のどちらかにより検出する。

同様に、検出用抗体、またはその結合パートナーを蛍光性化合物で標識することができる。この場合も、励起後に、そのような要素から放出される蛍光を、蛍光測定装置により検出または測定することができる。

本発明のEIAまたはELISAで使用可能な蛍光色素には、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フルオレスカミン、およびo-フタルアルデヒド(phthaldehyde)が含まれるが、これらに限定されない。

いかなる場合でも、検出用の精製抗体に結合させる標識として使用できる酵素は、分光光度法、蛍光測定法、発光測定法、視覚または他の手段により検出できる生成物を生成させるために選択される。EIAおよびELISAで有用な標識酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、スタフィロコッカル(ブドウ球菌)ヌクレアーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、およびα-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない。

検出用抗体は、蛍光色素発光化合物などで直接的に標識することができる。間接反応系の場合、検出用標識抗体を適当な結合パートナーと結合させ、未結合原料を洗浄により除去する。化学発光基質を、例えば、結合させておいた酵素がその基質を、ルミノメーター（luminometer）により検出および測定可能な光フォトンを放出する生成物に変換するよう、加えることができる。結果として、一定時間長の間に発生する光量は、試料または標本となる血液の液体部分中に含まれるiNOSの量に正比例する。

EIAまたはELISA方式において有用な発光化合物には、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル(theromatic acridinium ester)、オキサレートエステル、アクリジニウム塩、イミダゾールなどが含まれるが、これらに限定されない。

EIAまたはELISA方式において有用であって、検出用抗体またはその結合パートナーに結合している、触媒反応の間に光フォトンを放出する発光酵素には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれるが、これらに限定されない。

サンドイッチ型EIAまたはサンドイッチ型ELISA方式のほか、本発明の方法及び装置により、血液試料の液体部分中のiNOSの量を単一部位による競合的結合測定方式で、測定することができる。そのような一つの、単一部位による競合的結合測定方式において、試料中のiNOSは、結合の際に、抗iNOSモノクローナル抗体クローン21C10-1D10の抗原決定基を含む、標識ペプチド、標識ペプチド類似体、または標識ペプチドミメティックと競合する。そのような抗原決定基は、上記の特許出願第08/833,506号中では、iNOSの残基39位〜45位(VTQDDLQ)に同定される。ペプチド、ペプチド類似体、またはペプチドミメティックは、上述の酵素、発光化合物、光発生酵素、蛍光色素、または蛍光性金属キレートで標識することができる。この場合も、これらの化合物もしくは生成物からの放出光もしくは蛍光、またはそれらによる吸収光を、光度計により検出することができ、血液の液体試料中に存在するiNOSの量を決定するために定量化することができる。ペプチド、ペプチド類似体、またはペプチドミメティックの放射線標識化では、iNOSの量を放射免疫測定法により測定する必要がある。どの放射性同位元素でも、γ線スペクトロメーター、シンチレーション、写真用フィルム、または血液の液体試料中のiNOSの量を決定するためのその他の周知技術を使用して、検出および定量化することができる。

ディップスティック、側方流動装置(lateral flow device)、自動分析器、ポイントオブケア装置(point-of-care device)などのような、他の試験方式を使用することができる。いかなる場合でも、SIRS、敗血症、重症敗血症、または敗血性ショックの進行を、発生後の治療段階の間だけでなく、そのような敗血症状態の発症前に、またはその発生の間に検出することができる。

SIRS、敗血症、重症敗血症、または敗血性ショックを検出するための新規の有用な装置及び方法について説明されてきたと理解されうる。

このように、哺乳動物被験体の血液の液体部分を使用して、敗血症状態を検出するための装置及び方法を提供することが本発明の目的である。

本発明のもう一つの目的は、敗血症状態の発症および/または存在を検出するための装置及び方法であって、比較的迅速であり且つ短時間のうちに患者の治療処置を可能とするものを提供することである。

本発明のさらなる目的は、哺乳動物被験体において敗血症状態の発症および/または存在を検出するための装置及び方法であって、精度の高いものを提供することである。

本発明のさらなる目的は、敗血症状態の発症および/または存在を検出するための装置及び方法であって、敗血症状態にあることが検出された患者に適用される治療を監視できるものを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、哺乳動物被験体において敗血症状態の発症および/または存在を検出するための装置及び方法であって、初期段階での患者への治療の適用を可能とし、それにより患者の生存の可能性を高め、集中治療室での処置の長さを縮小するものを提供することである。

本発明は、特に本明細書に示される本発明の特別な特徴および特色に関係する他の目的および利点も備えている。

本発明をより理解するため、以下に好ましい態様の詳細な説明および実施例について申し述べるが、これらは本明細書の後記の図面に関連させて解釈されるべきである。

本発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明のいくつかの局面は、以下の好ましい態様の詳細な説明およびその実施例から生ずるが、これらは後記の図面に関連させて考慮されるべきである。

本発明の装置及び方法により、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、重症敗血症、または敗血性ショックの発症または存在が、ヒト患者のような哺乳動物被験体の血液の液体部分に関して行われる解析に基づいて迅速に決定される。装置には、ヒト患者または哺乳動物被験体の血液の液体部分中の誘導性酸化窒素合成酵素(iNOS)の存在を検出するための手段が含まれるが、eNOSまたはnNOSを検出することも、またはそれらと交差反応することもない。特に、そのような手段には、血漿、血清、または全血中のiNOSの存在またはその量の変化を迅速に検出および定量化することができる免疫測定法を含むことができる。iNOSは、ヒト患者では、SIRSの発症初期ならび重症敗血症および敗血性ショックの発症前に生成されることが判明している。

本発明の測定法では、ヒトiNOSの残基39位〜45位に結合する、モノクローナル抗体、好ましくは抗iNOSモノクローナル抗体のクローン21C10-1D10のIgG分画が使用される。そのクローンは、先に示した特許出願第08/833,506号中で同定される。その抗体を固体支持体または固体担体、好ましくは白色EIAマイクロタイタープレートのウェル上に吸着させる。この抗体は「捕捉用抗体」として知られ、哺乳動物被験体の血液の液体部分試料または標本中に含まれるiNOSを結合させるために使用される。そのような液体試料は、全血、血漿、または血清であることが好ましい。一段階反応でサンドイッチを形成させるため、標識された検出用抗体、抗iNOSモノクローナル抗体を同時に結合させる。そのような検出用標識抗体は、上記の特許出願中にて同定されるクローン2A1-F8のIgG分画のような抗iNOSモノクローナル抗体をビオチン化したものが好ましい。サンドイッチを形成させた後、未結合の検出用標識抗体を洗浄により除去し、次いで過剰量の適当な結合パートナー、例えば酵素結合ストレプトアビジンまたは酵素結合抗ビオチン抗体を結合させる。この場合も、未結合原料を洗浄により除去し、次いで化学発光基質を添加する。結合させておいた酵素がその基質を、光フォトンを放出する特定の生成物に変換する。そのフォトンをルミノメーターにより検出および測定する。一定時間長の間に発生する光量は、哺乳動物被験体の血液の液体部分試料または標本中に含まれるiNOSの量に正比例する。言い換えれば、哺乳動物被験体の血液の液体部分中のiNOSの量が増加するにつれて、本発明の測定法により発生する光量が増加する。

哺乳動物被験体の血液の液体部分中のiNOSの存在およびその量を決定する本発明の方法は、迅速に、すなわち1時間から2時間で実施することができる。本発明の装置を用いて、その方法を実施するのに必要な時間の短縮を補助するため、捕捉用抗体の固体支持体への吸着を予め行っておく。その後、必要になるまで、その捕捉用抗体および固体支持体を保管しておく。

測定法がサンドイッチ型酵素免疫測定法(EIA)の形態をとる場合、2時間またはそれ以上の間、白色96ウェル-EIAマイクロタイタープレートのウェル上に、抗iNOSモノクローナル抗体のクローン21C10-1D10のIgG分画のようなモノクローナル抗体を吸着させる。未結合原料を洗浄の段階で除去し、次いで非吸着部位を過剰量の非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンまたはゼラチンでブロッキングする。次いで、未結合原料を洗浄除去し、その後は必要になるまで、そのプレートを保管しておく。哺乳動物被験体の血液の液体部分中に含まれるiNOSの量を測定する必要がある場合、前記被験体の前記試料とビオチン化抗iNOSモノクローナル抗体(クローン2A1-F8)のIgG分画を各ウェルに添加し、60分間そのままにしておく。この間、一段階反応系では、試料中のiNOSは固定化した捕捉用抗体に結合し、ビオチン-2A1-F8は血液試料中のiNOSに結合する。または、二段階反応系では、試料中に含まれるiNOSを結合させ、次いで未結合原料を洗浄除去した後、ビオチン-2A1-F8複合体を別途加えることができる。一段階または二段階反応系のどちらかで、インキュベーション後、未結合原料を洗浄により除去し、酵素結合ストレプトアビジン、および好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンのような結合パートナーを加えて、20分間結合させる。この場合も、未結合原料を洗浄により除去し、次いで化学発光基質を添加する。化学発光基質は、ルミノールを化学発光増強剤および過酸化水素とともに用いるという形態をとることが好ましい。固定化酵素標識成分と化学発光物質との間の反応により、光が発生し、それをマイクロタイタープレート・ルミノメーターで測定する。さらに光量は、哺乳動物被験体の血液試料中のiNOSの量に正比例する。

化学発光物質について上記に述べたが、結合パートナーとして金属のような蛍光放出物質を使用することができ、励起後、蛍光測定法または時間分解蛍光測定法の処理過程を経て、蛍光を検出することができる。さらに、放射性同位元素のような他の種類の標識を使用することができ、γ線スペクトロメーター、シンチレーションスペクトロメーター、または写真用フィルムを使用して、放射性同位元素の量的活性を定量化することができる。また、光を吸収する比色分析用の基質または生成物を作製することもでき、それらは光度計により検出することができる。

本発明の測定法では、サンドイッチ型EIAまたはサンドイッチ型ELISA方式のほか、単一部位による競合的結合測定方式を利用することができることにも注目すべきである。その免疫測定法において、試料中のiNOSは、結合の際に、抗iNOSモノクローナル抗体クローン21C10-1D10の抗原決定基(前出のiNOSの残基39位〜45位)を含む、標識ペプチド、標識ペプチド類似体、または標識ペプチドミメティックと競合する。ペプチド、ペプチド類似体、またはペプチドミメティックは、この場合も、酵素、発光化合物、光発生酵素、蛍光色素、または蛍光性金属キレートで標識することができる。さらに、上述のように放射性同位元素を使用することもできる。

以下の実施例は本発明を例示するものであると見なされ、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例1
米国特許出願第08/833,506号中で、クローン21C10-1D10および2A1-F8として同定された、2つの抗iNOSモノクローナル抗体産生クローンからマウスIgGを得た。抗体は、培養上清液からプロテインGによるアフィニティー精製により、または腹水液から硫酸アンモニウム沈殿に続くSephadex G 200によるゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。図1は、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。サンドイッチ型ELISAで「捕捉用」抗体として使用するため、精製した21C10-1D10抗体をマイクロタイタープレート上に吸着させた。クローン2A1-F8から精製したIgG 5.0 mgを、Pierce Chemical社(ロックビル、イリノイ)から購入した、10倍モルの過剰スルホスクシンイミジル 6-(ビオチンアミド)ヘキサノエート(sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) hexanoate)と反応させた。炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH 8.5)中にて16時間反応させ、次いで1.0 M トリス緩衝液(pH .5) 0.1 mlを添加して反応を停止させた。0.1 M トリス緩衝液(pH 8.5)に対し4時間透析し、さらにリン酸緩衝生理食塩水に対し、これを3回交換しつつ透析することで、未結合のビオチンを除去した。ビオチン-2A1-F8複合体を、適当な結合パートナーとともにサンドイッチ型EIAで「検出用」抗体として使用した。

実施例2
臨床研究の患者から得られた血漿および/または血清中のiNOSを、EIA法、免疫細胞化学的染色法、およびウエスタンブロット法により直接的に測定しようとしたところ、血液試料の非液体部分中、すなわち誘導白血球中にiNOSが認められた。血漿部分中の遊離型iNOSは検出されなかった。当初、血漿の遊離型iNOSを検出できなかったのは、iNOSが細胞内タンパク質であるという事実や、iNOSを発現している細胞がアポトーシスにより死ぬことが報告されているという事実が原因であったと考えられる。アポトーシス機構では、細胞の残骸はマクロファージによって貪食される。白血球の細胞内成分が、この過程の下で放出されることはないと理論づけられた。敗血症患者の血漿および/または血清中のiNOSを、より感度の高い他の方法により検出することを試みた。健常ボランティアからの血漿(iNOSを含んでいなかったはずである)および誘発させたDLD-1細胞から精製したiNOSを使用した。後者はヒト結腸直腸上皮腺癌由来であり、その細胞は炎症性サイトカインの併用による誘発後、ヒトiNOSを発現することが報告されていた。精製したヒトiNOSの原液は、抗ペプチドポリクローナル抗体、既知量の非標識の遊離型ペプチド、および¹²⁵I標識ペプチドを用いた、競合結合放射免疫測定法によりキャリブレーションした。iNOSの原液は、高感度EIA法を開発するため、既知量のiNOSを健常人血漿にスパイクするのに使用した。本実施例のEIAによる最初の測定法は、結合パートナーとしてABCを使用し、比色分析による読み取りを行ったが、SIRS患者および敗血症患者の血漿中のiNOSを検出できなかった。しかし、結合パートナーをHRP標識ストレプトアビジンに置き換え、化学発光による読み取りを行ったところ、健常人の血漿試料中にスパイクされたiNOSを検出することができた。この置換によって、感度が80倍に増大したと考えられる。図2は、化学発光による読み取りの結果を示している。

上記の通り開発された免疫測定法を実施するため、以下のようにキットを組み立てた:
1. モノクローナル抗iNOS抗体クローン21C10-1D10(「捕捉用抗体」)のIgG分画でコーティングした、96ウェルの白色EIAマイクロタイタープレート1枚
2. 洗浄用緩衝液
3. 試料添加用緩衝液
4. キャリブレーション用iNOS標準(Calibrated iNOS standard)
5. モノクローナル抗iNOS抗体クローン2A1-F8のビオチン化IgG分画(「検出用抗体」)
6. 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(標識「結合パートナー」)
7. 次の2成分からなる化学発光基質:
増強型の化学発光基質溶液(増強剤入りルミノールまたはイソルミノール)、
安定化過酸化水素溶液
8. iNOSの血漿濃度を決定するためのチャート/グラフ
9. 取扱説明書(操作マニュアル)
取扱説明書(操作マニュアル)、チャート/グラフ、および他のデータは、フロッピーディスク、コンパクトディスク、またはダウンロード可能なインターネットファイルのような、コンピュータ可読形態で提供されてもよい。

実施例3
化学発光による読み取りを目的とし、実施例2記載のサンドイッチ型EIA法を、各インキュベーション時間の長さ、緩衝液の組成、および酵素標識結合パートナーの濃度について標準化した。iNOS血漿試料は、健常ボランティア8人から、およびSIRS/敗血症患者またはSIRS/敗血症が進行している「危険性のある」患者10人から得た。インフォームド・コンセントを、ボランティアおよび患者全員ともこの研究に登録される前に、成人(本人)からおよび患者(本人)または子供の保護者から得た。健常ボランティア8人の年齢は、18歳から50歳に及んでいた。健常ボランティアのうち、3人が女性、5人が男性であった。健常ボランティア8人から得られた血漿中には、iNOSが検出されなかった。健常ボランティア8人の血漿中の遊離型iNOS量は、仮にそれが存在していたとしても、実施例2記載の測定法の通常検出限界、すなわち0.375 fmol/ml未満であるにちがいないと総括された。

次いで、SIRS患者および敗血症患者、またはそのような病態を伴う機能上の変化が進行している「危険性のある」患者10人について、承認済みの手段に従って調査を行った。次の異なる3種類の試料をその患者から得た:血漿(凝固していない血液の液体成分)、血清(凝固した血液の液体成分)、ガラススライド上に固定した末梢血単核細胞(PBMC)、これはリン酸緩衝生理食塩水中に入れておいた。SIRS患者、敗血症患者、またはSIRSもしくは敗血症が進行している「危険性のある」患者の血漿中に、遊離型iNOSが認められた。図3Aおよび図3Bは、この群の特定の患者に関するこの所見を示している。iNOSは、SIRS患者、敗血症患者、およびSIRSもしくは敗血症が進行している危険性のある患者の血漿中に存在し、且つ健常人の血漿中には存在していないという事実を、ヒトiNOSに特異的なモノクローナル抗体を用いて、血漿試料にiNOSが存在しているかについて解析するウエスタンブロット法により確認した。図4は、この結果を示している。

図3Aに関して、SIRSまたは敗血症が進行している危険性のある特定患者の血漿iNOSは、SIRS/敗血症の臨床症状の発症の24〜48時間前に検出された。図3Aを見ても分かるように、この「危険性のある」患者は、第1日にSIRS陽性となる24時間前に、および第2日に敗血症陽性となる48時間前に、血漿のiNOS量が上昇していた。合計10人のICU患者について試験した。その他の患者1人が、図3Aに示されている通り、SIRSおよび敗血症の臨床症状の発症の24〜48時間前に、血漿中のiNOSが上昇するという同一傾向を示した。さらに、SIRSおよび/または敗血症患者3人は、効果的な治療が施されたため、血漿中のiNOS量の減少が見られ、患者の症状も改善された。図3Bは、これらの患者のうち1人の例を示している。ICU患者10人のうち敗血症であることが確認されたその他の患者2人もまた、効果的な治療が施されたため、血漿iNOSの量の減少が見られ、患者の症状も改善された。

実施例4
実施例3の、SIRSおよび/もしくは敗血症患者、またはSIRSもしくは敗血症が進行している「危険性のある」患者のiNOSの血漿濃度に関して得られたデータを、亜硝酸塩(NO₂)および硝酸塩(NO₃)の血漿濃度と比較した。図5から、これらの患者から得られた血漿中に存在する亜硝酸塩または硝酸塩との間には、統計的に有意な相関が認められなかったことが示される。このデータに関して、回帰直線はy = 0.014x + 60.27、相関係数はr = 0.1038と定義される。

実施例5
治療前のSIRSおよび/または敗血症患者10人から得られた14の試料について、実施例2の化学発光EIA法により決定された血漿中のiNOS濃度を、健常ボランティア8人の血漿中で確認された濃度と比較した。図6は、その結果を示している。スチューデントのt検定により、そのデータを統計的に解析した。SIRSおよび敗血症患者から得られた14の試料の平均濃度は、404 ± 212 fmol/ml(平均 ± 標準偏差)であった。そして対照の健常ボランティア8人についての平均濃度は、ゼロであった。スチューデントのt検定により、これらの2つの集団が同一である確率は、0.001未満(p < 0.001)である。従って、血漿中で測定された、健常ボランティアと治療前のSIRSおよび/または敗血症患者との間のiNOSの相違は、統計的に極めて有意である。

上記には、本発明を十分に開示することを目的として、本発明の態様および実施例についてかなり詳細に示したが、本発明の趣旨および原理から逸脱することなく、その詳細において多数の変更が可能であることは当業者にとって明らかである。

実施例1に記載の、抗ヒトiNOSモノクローナル抗体のIgG分画の精製を示すグラフである。 実施例2で検出された、化学発光とiNOSとの間の相関を示すグラフである。 図3Aは、実施例3に記載のように、SIRS/敗血症の発症段階における患者のiNOS量をグラフ表示したものである。図3Bは、実施例3に記載のように、敗血症の治療後の患者のiNOS量をグラフ表示したものである。 実施例3に記載の、iNOSの存在を確認する、SIRSおよび/または敗血症患者の血漿試料のウエスタンブロット解析の複写である。 実施例4に記載のように、SIRSおよび/または敗血症患者の血漿中のiNOSの存在と、血漿中の亜硝酸塩または硝酸塩濃度とが相関していないことを示すグラフである。 実施例5に記載のように、健常ボランティアと比較した、SIRSまたは敗血症患者群中の血漿iNOS濃度を示すグラフである。

Claims (14)

1. 全身性炎症反応症候群、敗血症、重症敗血症、または敗血性ショックの発症を、哺乳動物被験体における内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）又は神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の存在とは別に、前記哺乳動物被験体の血液の液体部分の試料を用いて誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の存在を検出することによって迅速に決定するための高感度アッセイ装置であって：
   ａ．前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合し、ヒトｉＮＯＳの残基３９位ないし４５位に特異的に結合する捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体であって、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）又は神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）と交差反応しない捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体と；
   ｂ．前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合する検出標識抗体と；
   を含み、更に：
   ｃ．前記捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体と前記検出標識抗体とを用いた、化学発光性のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡと化学発光性のサンドイッチ型ＥＩＡとからなる群から選択されるアッセイ型式；
   を具えることを特徴とするアッセイ装置。
2. 請求項１に記載のアッセイ装置において、前記捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体が前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の第１の部位に結合し、前記検出標識抗体が前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の第２の部位に結合することを特徴とするアッセイ装置。
3. 請求項１に記載のアッセイ装置において、前記検出標識抗体が、抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とするアッセイ装置。
4. 請求項３に記載のアッセイ装置において、検出標識型の前記抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体がビオチンで標識されるか、あるいは直接的に発光化合物又は光発生酵素に直接的に接合されることを特徴とするアッセイ装置。
5. 請求項１に記載のアッセイ装置において、前記誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合する前記捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体が、第１の抗ヒト誘導性酸化窒素合成酵素（ｈｉＮＯＳ）を含み、前記誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合する前記検出標識抗体が第２の抗ヒト誘導性酸化窒素合成酵素（ｈｉＮＯＳ）を含むことを特徴とするアッセイ装置。
6. 請求項３に記載のアッセイ装置において、前記検出標識型のモノクローナル抗体が第１の結合パートナーで標識され、更に：
   ａ．前記第１の結合パートナーに結合する第２の結合パートナーと；
   ｂ．当該第２の結合パートナーに結合する更なる標識と；
   を具えることを特徴とするアッセイ装置。
7. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記更なる標識が発光化合物又は光発生酵素を具えることを特徴とするアッセイ装置。
8. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記第１の結合パートナーがビオチン、ペプチド、ハプテン、タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び多糖類からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ装置。
9. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記第２の結合パートナーがストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン抗体、およびアビジン−ビオチン複合体からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ装置。
10. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記第２の結合パートナーが光発生酵素に接合されることを特徴とするアッセイ装置。
11. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記第１の結合パートナーに結合可能な前記第２の結合パートナーがビオチン、ペプチド、ハプテン、タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び多糖類からなる群から選択される任意の群の要素に特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ装置。
12. 請求項６に記載のアッセイ装置において、前記第２の結合パートナーに接合した前記更なる標識が、酵素、発光化合物、光発生酵素、蛍光色素、蛍光性金属キレート、着色化合物、色生成化合物、および放射性同位元素からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ装置。
13. 請求項１に記載のアッセイ装置において、前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の前記誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合する前記捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体が、捕捉用の固定化抗ｉＮＯＳ抗体を含むことを特徴とするアッセイ装置。
14. 請求項１に記載のアッセイ装置において、前記哺乳動物被験体の血液の液体部分中の前記誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）に結合する前記捕捉用抗ｉＮＯＳモノクローナル抗体が、捕捉用の固定化抗ｈｉＮＯＳ抗体を含むことを特徴とするアッセイ装置。

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