JPS58205855A - 蛋白質の分析方法および分析用キツト - Google Patents
蛋白質の分析方法および分析用キツトInfo
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- JPS58205855A JPS58205855A JP57088900A JP8890082A JPS58205855A JP S58205855 A JPS58205855 A JP S58205855A JP 57088900 A JP57088900 A JP 57088900A JP 8890082 A JP8890082 A JP 8890082A JP S58205855 A JPS58205855 A JP S58205855A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血清蛋白質をけじめとする体液中の蛋白質の
分析方法ならびに分析用キットに関し特にセルロースア
セテート膜を支持体として用いる蛋白質の分析方法なら
びに分析用キットに関する。
分析方法ならびに分析用キットに関し特にセルロースア
セテート膜を支持体として用いる蛋白質の分析方法なら
びに分析用キットに関する。
ある種の支持体を用いた体液中の蛋白質の分析方法とし
ては電気泳動法、免、疫電気泳動法、免疫沈降反応法等
があり、これらの方法において通常用いられる支持体と
してはゼラチン、寒天、濾紙。
ては電気泳動法、免、疫電気泳動法、免疫沈降反応法等
があり、これらの方法において通常用いられる支持体と
してはゼラチン、寒天、濾紙。
ポリアクリルアミドゲル、セルロースアセテート膜等が
ある。中で本セルロースアセテート嘆は薄くて均質な多
孔質膜であること、試料や色素の吸着が少ないこと、微
量の検体で実施できること、電気泳動の際泳動時のテー
リング現象がほとんどないこと、各分画の分離が明瞭で
あること、透明化剤を用いると・一時に透明になｆ’ｂ
、ポリアクリルアミドゲルの如き用時調製の必要がなく
取シ扱“いが簡便であること等、多くの利点を有するこ
とから、広く生化学分骨において用いられている。
ある。中で本セルロースアセテート嘆は薄くて均質な多
孔質膜であること、試料や色素の吸着が少ないこと、微
量の検体で実施できること、電気泳動の際泳動時のテー
リング現象がほとんどないこと、各分画の分離が明瞭で
あること、透明化剤を用いると・一時に透明になｆ’ｂ
、ポリアクリルアミドゲルの如き用時調製の必要がなく
取シ扱“いが簡便であること等、多くの利点を有するこ
とから、広く生化学分骨において用いられている。
このセルロースアセテートＩ！ｌｋ支持体として用いる
蛋白質の分析方法は微量の試料を迅速に分析できる点で
優れており、特に電気泳動法による血清蛋白質の分析は
臨床診断における重要な検査項目の一つにもなっている
。
蛋白質の分析方法は微量の試料を迅速に分析できる点で
優れており、特に電気泳動法による血清蛋白質の分析は
臨床診断における重要な検査項目の一つにもなっている
。
これらの分析方法によって蛋白質を検出する場合、セル
ロースアセテート膜中の蛋白質を染色する手段として、
有機色素からなる染色試薬←グロシン、ボンソー３Ｒ等
）が一般に用いられているが、当該染色試薬を用いた方
法は検出感度が低いため、通常は蛋白質晴度の比較的高
い試料（血清等）の蛋白質分析に用いられている。なお
、この方法は脳を髄液や塵、あるいはそれらと同様に蛋
白質濃關の極めて低い試料を分析することもできるが、
この場合は、分析過桿において繁雑な濃縮操作によって
、試料中の蛋白質Ｓ度を上げる必要があり、セルロース
アセテ−）Ｉｌｌを支持体として用いることの大きな利
点である迅速性を惰性にして分析を行なわなければなら
なかった。
ロースアセテート膜中の蛋白質を染色する手段として、
有機色素からなる染色試薬←グロシン、ボンソー３Ｒ等
）が一般に用いられているが、当該染色試薬を用いた方
法は検出感度が低いため、通常は蛋白質晴度の比較的高
い試料（血清等）の蛋白質分析に用いられている。なお
、この方法は脳を髄液や塵、あるいはそれらと同様に蛋
白質濃關の極めて低い試料を分析することもできるが、
この場合は、分析過桿において繁雑な濃縮操作によって
、試料中の蛋白質Ｓ度を上げる必要があり、セルロース
アセテ−）Ｉｌｌを支持体として用いることの大きな利
点である迅速性を惰性にして分析を行なわなければなら
なかった。
本発明はセルロースアセテート膜を支持体として用いる
蛋白質の分析方法において、セルロースアセテート膜の
利点を損うことなく、試料中に低濃度に存在する蛋白質
、あるいけ極微量の試料中に存在する蛋白質を簡便、迅
速かつ高感度に検出しつる方法を提供せんとするもので
ある。
蛋白質の分析方法において、セルロースアセテート膜の
利点を損うことなく、試料中に低濃度に存在する蛋白質
、あるいけ極微量の試料中に存在する蛋白質を簡便、迅
速かつ高感度に検出しつる方法を提供せんとするもので
ある。
本発明者は上述の如き目的を達成すべく検討を重ねる中
で、銀コロイドと蛋白質の強い相互作用、つまり銀コロ
イドが蛋白質に吸着する力に着目し、蛋白質染色試薬と
して銀コロイド溶液を用いるという全く新規な方法によ
って前記目的を達成できるとの知ＰＬ’を得て本発明を
完成した。
で、銀コロイドと蛋白質の強い相互作用、つまり銀コロ
イドが蛋白質に吸着する力に着目し、蛋白質染色試薬と
して銀コロイド溶液を用いるという全く新規な方法によ
って前記目的を達成できるとの知ＰＬ’を得て本発明を
完成した。
即ち、本発明は銀コロイド溶液でアセテート膜中及び／
又は膜上（以下便宜上「膜中」という）の蛋白質全染色
することを特徴とする蛋白質の分析方法である。
又は膜上（以下便宜上「膜中」という）の蛋白質全染色
することを特徴とする蛋白質の分析方法である。
本発明はまた、少なくとも蛋白質染色試薬としての銀コ
ロイド溶液とセルロースアセテート膜との組み合わせか
らなること全特徴とする蛋白質分析用キットであり、更
にまた少なくとも蛋白質染色試薬調製用としての銀塩、
還元剤ならびに弱アルカリ性溶液とセルロースアセテー
ト膜との組み合わせからなることを特徴とする蛋白質分
析用キットである。
ロイド溶液とセルロースアセテート膜との組み合わせか
らなること全特徴とする蛋白質分析用キットであり、更
にまた少なくとも蛋白質染色試薬調製用としての銀塩、
還元剤ならびに弱アルカリ性溶液とセルロースアセテー
ト膜との組み合わせからなることを特徴とする蛋白質分
析用キットである。
本発明の分析方法において用いる銀コ四イド溶液は、セ
ルロースアセテート膜中に存在する微量の蛋白質を極め
て高感度に染色することができる。
ルロースアセテート膜中に存在する微量の蛋白質を極め
て高感度に染色することができる。
また染色＃ｆと蛋白質層・との間に一定の関係がみられ
ることから、当該分析方法はセルロースアセテート嘆全
支持体とすることの利点とあいまって、脳を髄液あるい
け尿の如き試料中の蛋白質を、試料の濃縮操作を行うこ
となく高感度に検出並びに定量することができる。更に
本発明の分析方法は内耳液の如き極微量しか採取できな
いような試料中の蛋白質も同様に検出並びに定量するこ
とができる。
ることから、当該分析方法はセルロースアセテート嘆全
支持体とすることの利点とあいまって、脳を髄液あるい
け尿の如き試料中の蛋白質を、試料の濃縮操作を行うこ
となく高感度に検出並びに定量することができる。更に
本発明の分析方法は内耳液の如き極微量しか採取できな
いような試料中の蛋白質も同様に検出並びに定量するこ
とができる。
本発明の分析方法は、例えば電気泳動法におい一’ｆｉ
ｔ■セルロースアセテート嘆に希釈した試料（例えば血
清）を試料塗布器を用いて塗布、■通電して試料を泳動
させる、■セルロースアセテート膜を蛋白同定化液に浸
し、蛋白質を固定する、■このセルロースアセテート膜
を銀コロイド溶液中に浸し、振とうしながら銀コ四イド
による蛋白質染色を行う、の手順で実施される。
ｔ■セルロースアセテート嘆に希釈した試料（例えば血
清）を試料塗布器を用いて塗布、■通電して試料を泳動
させる、■セルロースアセテート膜を蛋白同定化液に浸
し、蛋白質を固定する、■このセルロースアセテート膜
を銀コロイド溶液中に浸し、振とうしながら銀コ四イド
による蛋白質染色を行う、の手順で実施される。
本発明に用いられる銀コロイド溶液は銀塩、および還元
剤を適当量ずつとり、適当な量の蒸留水に添加、６０〜
８０℃で攪拌混合し、この混合物にさらに適当量の弱ア
ルカリ性溶液を加えて攪拌混合した後冷却、室温に戻す
ことによって調製さ籠 れる。この際用いられる銀塩としては硝酸ｔｌｉ、ｉＭ
塩素酸銀、塩素酸銀用酢酸銀ヨウ素酸銀、乳酸銀。
剤を適当量ずつとり、適当な量の蒸留水に添加、６０〜
８０℃で攪拌混合し、この混合物にさらに適当量の弱ア
ルカリ性溶液を加えて攪拌混合した後冷却、室温に戻す
ことによって調製さ籠 れる。この際用いられる銀塩としては硝酸ｔｌｉ、ｉＭ
塩素酸銀、塩素酸銀用酢酸銀ヨウ素酸銀、乳酸銀。
硫酸銀等が、還元剤としてはタンニン酸、ヒドラジン、
レゾルシノール、ヒドロキノン、＠Ｍ［−鉄が、また弱
アルカ°り性溶液としては炭酸ナトリウム、炭酸リチウ
ム、炭酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン噌リチ
ウム、クエン嘴カリウム等の溶液がある。
レゾルシノール、ヒドロキノン、＠Ｍ［−鉄が、また弱
アルカ°り性溶液としては炭酸ナトリウム、炭酸リチウ
ム、炭酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン噌リチ
ウム、クエン嘴カリウム等の溶液がある。
好ましい鋏コロイド溶液の一例としては銀塩として硝酸
銀、錆元剤としてタンニン酸、弱アルカリ性溶液として
炭酸ナトリウム溶液ｔ１ら調製された溶液が拳げられる
。この場合用いる硝酸鋼の量は、当該銀コロイド溶液全
量に対し、０．０２〜０゜３２重量パーセント位が実用
上好ましく、この範囲以下では蛋白質の染色に長時間を
要し、また、この範囲以上ではセルロースアセテート嘆
自体を染色してしまうので好ましくない。また同時に用
いるタンニン酸および炭酸ナトリウムの一曖は、上記濃
度範囲内で用いる硝酸鋼の量に対し、それぞれ１．２５
／１００〜１２．５／１００の濃度比および５／１００
〜２５／Ｚｏｏの濃度比の範囲内で用いることが実用上
好ましい。タンニン酸の量が上記濃度比範囲以下では銀
コロイドが非常に不安定になり、逆に該範囲以上となる
とセルロースアセテート膜自体を染色するので好ましく
ない。また炭酸ナトリウムの量が上記ｍｙ比範囲以下に
なるとセルロースアセテート膜自体を強く染色し、逆に
該濃度比範囲以上になると銀コロイドが不安定になり実
用に適さない。
銀、錆元剤としてタンニン酸、弱アルカリ性溶液として
炭酸ナトリウム溶液ｔ１ら調製された溶液が拳げられる
。この場合用いる硝酸鋼の量は、当該銀コロイド溶液全
量に対し、０．０２〜０゜３２重量パーセント位が実用
上好ましく、この範囲以下では蛋白質の染色に長時間を
要し、また、この範囲以上ではセルロースアセテート嘆
自体を染色してしまうので好ましくない。また同時に用
いるタンニン酸および炭酸ナトリウムの一曖は、上記濃
度範囲内で用いる硝酸鋼の量に対し、それぞれ１．２５
／１００〜１２．５／１００の濃度比および５／１００
〜２５／Ｚｏｏの濃度比の範囲内で用いることが実用上
好ましい。タンニン酸の量が上記濃度比範囲以下では銀
コロイドが非常に不安定になり、逆に該範囲以上となる
とセルロースアセテート膜自体を染色するので好ましく
ない。また炭酸ナトリウムの量が上記ｍｙ比範囲以下に
なるとセルロースアセテート膜自体を強く染色し、逆に
該濃度比範囲以上になると銀コロイドが不安定になり実
用に適さない。
尚、本発明において用いられる銀コロイド溶液は一般に
吸収極大波長が３９０〜ｂ ましくは４００〜４１５ｓｓ（７）範囲にあル、かつ銀
コロイド自体が蛋白質あるいはポリビニルピロリドンの
如きコロイド保護剤で覆われていない状態のものであれ
ば、どのような組成あるいはどのような方法によって調
製されたものでもよい。
吸収極大波長が３９０〜ｂ ましくは４００〜４１５ｓｓ（７）範囲にあル、かつ銀
コロイド自体が蛋白質あるいはポリビニルピロリドンの
如きコロイド保護剤で覆われていない状態のものであれ
ば、どのような組成あるいはどのような方法によって調
製されたものでもよい。
当該銀コロイド溶液を染色試薬として、セルロースアセ
テート膜中に存在する蛋白質を染色する場合、染色は約
３０分根度で完了するので、セルロースアセテート膜を
支持体とする蛋白質の分析の利点、つまり迅速性を損な
うことなく蛋白質分析を可能にする。
テート膜中に存在する蛋白質を染色する場合、染色は約
３０分根度で完了するので、セルロースアセテート膜を
支持体とする蛋白質の分析の利点、つまり迅速性を損な
うことなく蛋白質分析を可能にする。
また当該銀コロイド溶液は蛋白質の染色能力が極めて優
れていることおよびセルロースアセテート膜自体はほと
んど染色しないことから高感度かつ効率よく微量の蛋白
質成分を染色することができる。
れていることおよびセルロースアセテート膜自体はほと
んど染色しないことから高感度かつ効率よく微量の蛋白
質成分を染色することができる。
また当該銀コロイド溶液を４℃の冷蔵庫内に５力月間保
存した後、蛋白質の染色を行なりたが、染色性に全く影
響けなく、当該銀コロイド溶液は、一定の条件下であれ
ば長期保存が可能である。
存した後、蛋白質の染色を行なりたが、染色性に全く影
響けなく、当該銀コロイド溶液は、一定の条件下であれ
ば長期保存が可能である。
以上の如く本発明の分析方法ならびに分析用キットはセ
ルロースアセテート膜を支持体として用いる蛋白質の分
析において、極めて高感度かう迅速に蛋白質を検出ある
いは定険することができる点において臨床分析分１叶に
画期的な分析方法を提供する本のである。゛ 後述の実験例および実施例において用いた蛋白質染色用
銀コロイド溶液（以下「標準銀コロイド染色液］という
）は以下の如くして調製した。
ルロースアセテート膜を支持体として用いる蛋白質の分
析において、極めて高感度かう迅速に蛋白質を検出ある
いは定険することができる点において臨床分析分１叶に
画期的な分析方法を提供する本のである。゛ 後述の実験例および実施例において用いた蛋白質染色用
銀コロイド溶液（以下「標準銀コロイド染色液］という
）は以下の如くして調製した。
２００＊／ビーカーに再蒸留水９８．２ｄをと９７０℃
に加熱し、これに２０重量パーセント硝酸銀１１ｆｌ
液０．４ ｗｅ ト１．０重量パーセントタンニン酸溶
液０．４−を激しく攪拌上添加して混合した。更に１゜
０重量パーセント炭酸ナトリウム溶液１．０−を添加し
２分間攪拌混合した後、水で冷却し室温にもどした。
に加熱し、これに２０重量パーセント硝酸銀１１ｆｌ
液０．４ ｗｅ ト１．０重量パーセントタンニン酸溶
液０．４−を激しく攪拌上添加して混合した。更に１゜
０重量パーセント炭酸ナトリウム溶液１．０−を添加し
２分間攪拌混合した後、水で冷却し室温にもどした。
以下に実験例並びに実施例によって本発明を更に詳細に
説明する。尚、実験例並びに実施例において用いたセル
ロースアセテート膜は、いづれ吃富士写真フィルム株式
会社製「セパラックス」である。
説明する。尚、実験例並びに実施例において用いたセル
ロースアセテート膜は、いづれ吃富士写真フィルム株式
会社製「セパラックス」である。
〔実験例１〕
縦６ ｃｍ ’ｆＲ６ａｍのセルロースアセテート膜を
３枚用意し、これにそれぞれ７．５，１５．３０．７５
゜１５０．３００．７５０μｆ／ｙｄの濃度の牛血清ア
ルブミン溶液ｔ−０，３６μＬずつ直径約２ａｍの円形
となるように５＋ｗ間隔で直列に２列スポットした０次
いで各セルロースアセテート膜の骸スポットを標準銀コ
ロイド染色液、ボンソー３Ｒ染色液およｒｇニグロシン
染色液を用いて以下の方法によル染色処理した。
３枚用意し、これにそれぞれ７．５，１５．３０．７５
゜１５０．３００．７５０μｆ／ｙｄの濃度の牛血清ア
ルブミン溶液ｔ−０，３６μＬずつ直径約２ａｍの円形
となるように５＋ｗ間隔で直列に２列スポットした０次
いで各セルロースアセテート膜の骸スポットを標準銀コ
ロイド染色液、ボンソー３Ｒ染色液およｒｇニグロシン
染色液を用いて以下の方法によル染色処理した。
（１）銀コ目イドによる染色
牛血清アルブミンがスポットされた上記セルロースアセ
テート膜ｔ−５％トリクロル酢酸溶液に２分間浸し蛋白
質の固定を行なった後、軽く水ですすぎ、濾紙にはさん
で余分な水分を除いた。次いで該膜を標準銀コロイド染
色液に浸し、３０分間撮とうしたのち、該膜全取り出し
、水の中で２分間振とりする洗滌操作′ｆｒ：３回行な
った。
テート膜ｔ−５％トリクロル酢酸溶液に２分間浸し蛋白
質の固定を行なった後、軽く水ですすぎ、濾紙にはさん
で余分な水分を除いた。次いで該膜を標準銀コロイド染
色液に浸し、３０分間撮とうしたのち、該膜全取り出し
、水の中で２分間振とりする洗滌操作′ｆｒ：３回行な
った。
（１）ボンソー３１Ｌによる染色
００１Ｒ１としたボンソー３Ｒ染色液に牛血清アルブミ
ンがスポットされた前記セル四−スアセテート膜′ｆ：
２分間浸した後、該膜を取り出し１％酢酸溶液で洗滌し
た。洗滌は２分ずつ５回縁ル返し行なった。
ンがスポットされた前記セル四−スアセテート膜′ｆ：
２分間浸した後、該膜を取り出し１％酢酸溶液で洗滌し
た。洗滌は２分ずつ５回縁ル返し行なった。
（ｉｉｌ）ニグロシンによる染色
ニグロシン（東京化成株式会社製）０．０１？。
酢酸２． Ｏｒｕｇを蒸溜水に溶解し、全量を１００ｍ
Ｊとしたニグロシン染色液に牛血清アルブミンがスポッ
トされた前記セルロースアセテート膜を一晩浸した。該
膜を取シ出し水で２分間ずつ５回洗滌を行表っだ。
Ｊとしたニグロシン染色液に牛血清アルブミンがスポッ
トされた前記セルロースアセテート膜を一晩浸した。該
膜を取シ出し水で２分間ずつ５回洗滌を行表っだ。
以上（１） 、 （ＩＩ） 、 （ｉｌ）で染色処理さ
れた各スポットの染色濃度全デンシトメーター（ヘレナ
社製）で各染色に至適なフィルター（銀コロイド染色は
４２０ｓｔｎカフイルター、ボンソー３Ｒ染色は５２５
爲惧のフィルター、ニグロシン染色は６１０５ｍのフィ
ルター）を用いてスキャンした。各スポットに対応する
ピークの高さを染色濃度の指標として蛋白質量とピーク
の高さの関係をプロットし第１図に示した。
れた各スポットの染色濃度全デンシトメーター（ヘレナ
社製）で各染色に至適なフィルター（銀コロイド染色は
４２０ｓｔｎカフイルター、ボンソー３Ｒ染色は５２５
爲惧のフィルター、ニグロシン染色は６１０５ｍのフィ
ルター）を用いてスキャンした。各スポットに対応する
ピークの高さを染色濃度の指標として蛋白質量とピーク
の高さの関係をプロットし第１図に示した。
この図から明らかな如く銀コロイド溶液を用いる本発明
の方法は従来セルロースアセテート膜中の蛋白質を最も
感度よく検出するといわれているニグロシンに比べ、約
６〜７倍の感度で検出できることか確認された。更に蛋
白質量と染色濃度の関係が一定の範囲でｒｕｇ性を示し
、本発明の方法が蛋白質の定量分析に用いられることが
確認された。
の方法は従来セルロースアセテート膜中の蛋白質を最も
感度よく検出するといわれているニグロシンに比べ、約
６〜７倍の感度で検出できることか確認された。更に蛋
白質量と染色濃度の関係が一定の範囲でｒｕｇ性を示し
、本発明の方法が蛋白質の定量分析に用いられることが
確認された。
〔実験例２〕
縦６ ｃｍ 、 横６ ｃｍのセルロースアナチー）膜
？３枚用意し、それぞれに２５倍希釈したヒト正常血清
’ｉ ０．２μＬずつ試料塗布器（ヘレナ社製）を用い
て塗布し、これら’ｉ ０．０７ Ｍベロナール緩衝液
（ｐＨ−８，６）中で、セルロースアセテート膜の幅１
ｏ１１あた夛１ｍＡを通電し、３０分間泳動した。泳動
後の３枚の該嘆はそれすれ標準銀コロイド染色液。
？３枚用意し、それぞれに２５倍希釈したヒト正常血清
’ｉ ０．２μＬずつ試料塗布器（ヘレナ社製）を用い
て塗布し、これら’ｉ ０．０７ Ｍベロナール緩衝液
（ｐＨ−８，６）中で、セルロースアセテート膜の幅１
ｏ１１あた夛１ｍＡを通電し、３０分間泳動した。泳動
後の３枚の該嘆はそれすれ標準銀コロイド染色液。
ボンソー３几染色液およびニグロシン染色液を用いて、
実験例１に示す染色方法によシ処理した。
実験例１に示す染色方法によシ処理した。
この結果ボンソー３ Ｉｔおよびニグロシンでは、泳動
された蛋白質成分中アルブミン以外の蛋白質はほとんど
検出不能であったが、銀コロイド溶液を用いた本発明の
方法では各血清蛋白質成分が明瞭に検出できた。
された蛋白質成分中アルブミン以外の蛋白質はほとんど
検出不能であったが、銀コロイド溶液を用いた本発明の
方法では各血清蛋白質成分が明瞭に検出できた。
〔実験例３〕
２５倍希釈したヒ）Ｅ常面清０．２１を縦５ ｃｍ 。
横６備のセルロースアセテート膜上に塗布したものを実
験例２と同様の方法で電気泳動し、次いで実験例１に示
す「銀コロイドによる染色」の方法に従って標準鋼コロ
イド染色液を用いて染色処理を施した。後、該膜を透明
化液（ＭＮ−透明化液二半井薬品株式会社製）で透明化
してからデンシトメーター（ヘレナ社製）により４２０
爲惧のフィルターを用いてスキャンし、その結果を第２
図に示した。この図から明らかな如くアルブミンおよび
各グロブリンの分画が確認できた。また実験例１の結果
と合せて蛋白質の各成分の定量分析にも本発明の方法が
応用できることが確認された。
験例２と同様の方法で電気泳動し、次いで実験例１に示
す「銀コロイドによる染色」の方法に従って標準鋼コロ
イド染色液を用いて染色処理を施した。後、該膜を透明
化液（ＭＮ−透明化液二半井薬品株式会社製）で透明化
してからデンシトメーター（ヘレナ社製）により４２０
爲惧のフィルターを用いてスキャンし、その結果を第２
図に示した。この図から明らかな如くアルブミンおよび
各グロブリンの分画が確認できた。また実験例１の結果
と合せて蛋白質の各成分の定量分析にも本発明の方法が
応用できることが確認された。
実施例１゜
セルロースアセテート膜電気泳動法による脳を嘲液中の
蛋白質成分の分析 脳を髄液６検体及び２５０倍希釈血清２検体を約１μｉ
ずつ試料塗布器（ヘレナ社製）によって縦６ ｃｍ 、
横６ ｏｎのセルロースアセテート膜上に塗布し、次
いで０．０７ Ｍベロナール緩衝液（…−８，６）中で
セルロースアセテート膜の幅１ ｔｔｓｒ アタり １
情Ａを通電し３０分ｉｌｌ泳勲し丸、泳動後、該膜′ｆ
ｒ５Ｘトリクロル酢酸溶液に２分間浸して蛋白質を固定
化した後、膜上の水分をふきとってから標準銀コロイド
染色液に浸し、振とうしながら３０分間染色処理を施し
た。次いで該膜を水中で２分間振とりする洗滌操作を３
回縁シ返し行なった。
蛋白質成分の分析 脳を髄液６検体及び２５０倍希釈血清２検体を約１μｉ
ずつ試料塗布器（ヘレナ社製）によって縦６ ｃｍ 、
横６ ｏｎのセルロースアセテート膜上に塗布し、次
いで０．０７ Ｍベロナール緩衝液（…−８，６）中で
セルロースアセテート膜の幅１ ｔｔｓｒ アタり １
情Ａを通電し３０分ｉｌｌ泳勲し丸、泳動後、該膜′ｆ
ｒ５Ｘトリクロル酢酸溶液に２分間浸して蛋白質を固定
化した後、膜上の水分をふきとってから標準銀コロイド
染色液に浸し、振とうしながら３０分間染色処理を施し
た。次いで該膜を水中で２分間振とりする洗滌操作を３
回縁シ返し行なった。
この結果、アルブミン以外の比較的含量の少ない蛋白質
成分も明瞭に染色されその存在が確認でき、従来のセル
ロースアセテート膜電気泳動法では濃縮操作を必要とし
た脳を１液中の蛋白質分析も、本発明の方法で紘濃縮操
作を行なわずして簡便迅速に実施できた。
成分も明瞭に染色されその存在が確認でき、従来のセル
ロースアセテート膜電気泳動法では濃縮操作を必要とし
た脳を１液中の蛋白質分析も、本発明の方法で紘濃縮操
作を行なわずして簡便迅速に実施できた。
実施例２
セルロースアセテート膜電気泳動法による尿中の蛋白質
成分分析 健常人で市販の蛋白検査用試験紙で凝陽性となった尿試
料２検体をそれぞれ約１μλずつ縦６備。
成分分析 健常人で市販の蛋白検査用試験紙で凝陽性となった尿試
料２検体をそれぞれ約１μλずつ縦６備。
横６ ｃａｒのセルロースアセテート膜に塗布し実施例
１と同様の方法により泳動ならびに銀コロイド染色を施
した。次いで該嘆を透明化液（ＭＮ−透明化液：半井薬
品株式会社製）により透明化した後、デンシトメーター
（ヘレナ社型）により４２０％惰のフィルターを用いて
スキャンし、第３図に示す染色像を得た。この図から明
らかな９口く、尿中の蛋白質成分が明瞭に確認でき、試
料の濃縮操作等を行なわずして分析することができた。
１と同様の方法により泳動ならびに銀コロイド染色を施
した。次いで該嘆を透明化液（ＭＮ−透明化液：半井薬
品株式会社製）により透明化した後、デンシトメーター
（ヘレナ社型）により４２０％惰のフィルターを用いて
スキャンし、第３図に示す染色像を得た。この図から明
らかな９口く、尿中の蛋白質成分が明瞭に確認でき、試
料の濃縮操作等を行なわずして分析することができた。
実施例３゜
セルロースアセテート膜電気泳動法による内耳液の分析
内耳内リンパ液をマイクロシリンジを用いて、０．１８
４ずつ縦６ ｒｙｎ 、横６傷のセルロースアセテート
膜上にマイクロシリンジにてスポットし、実施例１と同
様の方法で体動、銀コロイド染色を行□なった。
４ずつ縦６ ｒｙｎ 、横６傷のセルロースアセテート
膜上にマイクロシリンジにてスポットし、実施例１と同
様の方法で体動、銀コロイド染色を行□なった。
この結果、アルブミンおよびグロブリンの各分画が明瞭
に検出された。
に検出された。
実施例４゜
セルｏ −スアセテート膜を支持体としたオフタロニー
法における免疫沈降反応物の検出リン酸緩衝液で平衡化
したセルロースアセテート膜の中心部に１＃ｖ／−の牛
血清アルブミン０．４鱈を１点スポットし、その同位に
５＋ｍ間隔に倍々希釈した抗生血清アルブミン（生化学
工業株式会社製） ｔ＝ ０．４μＬずつ６点スポット
した。
法における免疫沈降反応物の検出リン酸緩衝液で平衡化
したセルロースアセテート膜の中心部に１＃ｖ／−の牛
血清アルブミン０．４鱈を１点スポットし、その同位に
５＋ｍ間隔に倍々希釈した抗生血清アルブミン（生化学
工業株式会社製） ｔ＝ ０．４μＬずつ６点スポット
した。
これを流動パラツイン中で２０時間放置し、その後水流
で流動パラフィンを洗滌除去した。以後、実施例１と同
様の方法により免疫沈降物を銀コロイド染色し丸、この
結果、明瞭な沈降線が得られた。
で流動パラフィンを洗滌除去した。以後、実施例１と同
様の方法により免疫沈降物を銀コロイド染色し丸、この
結果、明瞭な沈降線が得られた。
実施例５゜
セルロースアセテート暎免疫電気泳動分析における免疫
沈降反応物の検出 Ｒ６ｎＲ，横６ ｃｍのセルロースアセテ−）１１ＪＩ
Ｋヒト血清０．４μ盃をマイクロシリンジを用いてスポ
ットした後、実施例１と同様の条件下で泳動を行なった
。泳動後、抗ヒト血清ヤギ血清（生化学工業株式会社型
）を泳動方向にそってスポット位置から５■離し直線的
に塗布したのち流動パラフィン中で２０時間放置した。
沈降反応物の検出 Ｒ６ｎＲ，横６ ｃｍのセルロースアセテ−）１１ＪＩ
Ｋヒト血清０．４μ盃をマイクロシリンジを用いてスポ
ットした後、実施例１と同様の条件下で泳動を行なった
。泳動後、抗ヒト血清ヤギ血清（生化学工業株式会社型
）を泳動方向にそってスポット位置から５■離し直線的
に塗布したのち流動パラフィン中で２０時間放置した。
後、該膜上の流動パラフィンを流水で水洗除去してから
、実施例１と同様の方法で銀コロイド染色を行なった。
、実施例１と同様の方法で銀コロイド染色を行なった。
この結果、血清成分に対応する明瞭な沈降線が確認され
た。
た。
第１図は、各染色試薬によって染色された各スポットの
染色濃度と蛋白質量との関係を表すグラフである。−・
−は本発明の銀コロイド溶液を、−ｏ−１ｄニグロシン
を、 −ムーバホンソー３Ｒを用いて染色したものであ
る。 第２図は、血清成分のセルロースアセテート膜電気泳動
分析において本発明で用いる銀コロイド溶液によって蛋
白質を染色した際の染色状態をデンシトメトリーによ）
表わした染色像である。↓印は試料塗布位置を示す。 第３図は尿成分のセルロースアセテート膜電気泳動分析
において２種類の検体を電気泳動にかけた後、本発明で
用いる銀コロイド溶液によって蛋白質を染色し、その染
色状態全デンシトメトリーで表わした染色像である。↓
は試料塗布位置を示す。 特許出願人 財団法人 東京生化学研究会 （ほか１名）
染色濃度と蛋白質量との関係を表すグラフである。−・
−は本発明の銀コロイド溶液を、−ｏ−１ｄニグロシン
を、 −ムーバホンソー３Ｒを用いて染色したものであ
る。 第２図は、血清成分のセルロースアセテート膜電気泳動
分析において本発明で用いる銀コロイド溶液によって蛋
白質を染色した際の染色状態をデンシトメトリーによ）
表わした染色像である。↓印は試料塗布位置を示す。 第３図は尿成分のセルロースアセテート膜電気泳動分析
において２種類の検体を電気泳動にかけた後、本発明で
用いる銀コロイド溶液によって蛋白質を染色し、その染
色状態全デンシトメトリーで表わした染色像である。↓
は試料塗布位置を示す。 特許出願人 財団法人 東京生化学研究会 （ほか１名）
Claims (3)
- （１）銀コロイド溶液でセルロースアセテート膜中及び
／又は幌上の蛋白質を染色することを特徴とする蛋白質
の分析方法。 - （２）少なくとも蛋白質染色試薬としての銀コロイド溶
液とセルロースアセテート膜との組み合せからなること
を特徴とする蛋白質分析用キット。 - （３）少なくとも蛋白質染色試薬調製用としての銀基、
覆光剤ならびに弱アルカリ性溶液とセルロースアセテー
ト膜との組み合せからなることを特徴とする蛋白質分析
用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57088900A JPS58205855A (ja) | 1982-05-27 | 1982-05-27 | 蛋白質の分析方法および分析用キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57088900A JPS58205855A (ja) | 1982-05-27 | 1982-05-27 | 蛋白質の分析方法および分析用キツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58205855A true JPS58205855A (ja) | 1983-11-30 |
Family
ID=13955827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57088900A Pending JPS58205855A (ja) | 1982-05-27 | 1982-05-27 | 蛋白質の分析方法および分析用キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58205855A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6117958A (ja) * | 1984-06-22 | 1986-01-25 | ジヤンセン・フア−マシユ−チカ・ナ−ムロ−ゼ・フエンノ−トシヤツプ | 蛋白質及び核酸の染色法 |
| US5279792A (en) * | 1984-06-22 | 1994-01-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Staining kit for proteins and nucleic acids |
| WO1998003875A1 (en) * | 1996-07-24 | 1998-01-29 | Helena Laboratories Corporation | Reagents and methods for fluorescent analysis of serum proteins |
| WO2005070968A1 (ja) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 蛋白質の固定化方法及び定量方法 |
-
1982
- 1982-05-27 JP JP57088900A patent/JPS58205855A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6117958A (ja) * | 1984-06-22 | 1986-01-25 | ジヤンセン・フア−マシユ−チカ・ナ−ムロ−ゼ・フエンノ−トシヤツプ | 蛋白質及び核酸の染色法 |
| US4920059A (en) * | 1984-06-22 | 1990-04-24 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Staining method for proteins and nucleic acids |
| US5279792A (en) * | 1984-06-22 | 1994-01-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Staining kit for proteins and nucleic acids |
| WO1998003875A1 (en) * | 1996-07-24 | 1998-01-29 | Helena Laboratories Corporation | Reagents and methods for fluorescent analysis of serum proteins |
| WO2005070968A1 (ja) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 蛋白質の固定化方法及び定量方法 |
| WO2005070969A1 (ja) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 蛋白質の固定化方法及び定量方法 |
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