JPS61500808A - 免疫固定電気泳動方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は、免疫固定電気泳動（ｉｒｎｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎｅｌｅｅｔｒｏ ｐｈｏｒｅｓｌｓ　）　ｆｉｇに関する。

２、先行技術の説明 免疫固定醒気泳劫（ＩＦＥ　）　ｒｉ、鳩１段階にνいてアガロース（ａｇａｒ ｏｍ＠）ゲル蛋白質の電気泳動を、Ｍ２段階で免疫沈ｋ　（ｉｍｍｕｎｏｐｒ＊ ｅｉｐｌｔａｔｌｏｎ　）を使用する２段階法である。被験達は、血清、振又は 脳髄液であってもよい。ｆＦＥは、学術研究、法医学、遺伝研究及び臨床実検法 において数多くの用途がちる。免疫固定電気泳動が単りロー／性免疫グロブリン 増多症（ｍｏｎｏｅｌｏｎａ１ｇａｍｎｓｏｐａｔｈｉ＊ｓ　）　ＫＦｊ係する 免疫グロブリンの検出及び同定のために主としてｌ用される場合には、免疫固定 電気泳動の波大の要求＃′ｉ臨床実験にある。

アルフオンン（Ａｌｆｏｎｓｏ　）が、（１）最初に、１９６４年に文献に免疫 固定を記、電した。アルバー（Ａ１ｐ＠ｒ　）等は、（２）セルロプラスミン及 びＧＣ−グロブリンの遺伝的多形の噴出と、活性化に際してのＣ３の＠換の研究 に没頭した結果、１９６９年に一層実際的な方法を発表した。彼らは、その後、 彼らの研究を、補体成分の遺伝的多形現象とアルファｌ抗トリプシン表現型の同 定に拡げた（３゜４）。免疫固定は先ず、１９７６年に免疫グロブリンの研究の ための方法として紹介された（５．６）。免疫固定方法に関する数多くのその他 の参考文献がある（例えば、７乃至１０）。

現時点で最も洗練された免疫固定°電気泳動方法は、サンプルを電気泳動ゲルの 幾つかの適用部位に適用し、ゲルｔ−電気原動処理し、蛋白質パターン部をゲル の残シの部分から切断し、蛋白質を電気ネ動ゲルのこの切断された部分において 固定し、ゲルに存在する残シの電気泳動された部分に別の抗血清を適用するとと もに得られたゲルを温置しく　１ｎｃｕｂａｔｅ　）　、温置したゲルを洗浄し 、洗浄したゲルを乾燥し、乾斃したゲルを染色し、・染色したゲルを脱色し、脱 色したゲルを乾燥し、そして乾燥したゲルを分析することを含む。

この方法の１つの欠点は、蛋白質の部分をゲルの残りの部分から最初に切断する 場合忙不便が生ずる以外に、ゲルの分離された固定蛋白質部分の場所を間違えた シ、あるいは紛失するということにある。

従って、蛋白質を固定する前にゲルの蛋白質部分をゲルから分離する必要のな込 免疫固定電気泳動方法を有することが特に有利である。

発明の概要 本発明によれば、ゲルの蛋白質沈降パターン部をその残りの部分から切断するこ とを必要とせずに、蛋白質のパターンを電気泳動ゲル内で染色することができる 、改良された免疫固定電気泳動方法が提供されている。よシ詳細に云うと、本発 明の免疫固定電気泳動方法は、（＆）サンプルを電気泳動ゲルの少なくとも２つ の適用領域に適用し、（ｂ）ゲルを電気泳動処理し、（Ｃ）テンプレートを電気 泳動処理したゲルの上で位置合わせし、テンプレートは各電気泳動処理した領域 に対応したテンプレートス口。

トを有してお！０、（ｄ）その場で蛋白質を固定することができる組成物を少々 ′くとも１つのテンプレートスロットに適用するとともに１つの蛋白質と反応す ることができる抗血清を残りのテンプレートスロットの少なくとも１つに適用し 、（ｅ）工程（ｄ）の結果生成物を温置し、（ｆ）テンプレートを温置した電気 泳動処理ゲルから取外し、（ｇ）工程（ｆ）の培養した電気泳動処理ゲルを洗浄 し、（ｈ）工程０）の洗浄ゲルを乾燥し、（１）工程伽）の乾燥ゲルを染色し、 （ｉ）工程（ｉ）の染色ゲルを脱色し、Ｃ！ｋｃ）工程（ｊ）の脱色したゲルを 乾燥し、そして（４工程（ｋ＞の乾燥ゲルを分析することからなる。

本発明の側に別のｅｆ徴とこれに伴なう利点は、好ましい実施例についての以下 の詳細々記載を読むことから当業者に明白となるものである： 好ましい実施態様の説明 本発明の電気泳動ゲルにおいて好ましく使用することができる多糖類は、寒天及 びアガロースである。アガロースは、低い電気浸透のアガロース、中程度の電気 浸透のアガロースあるいは高い電気浸透のアガロニスとすることができる。より 好ましくは、本発明の電気泳動ゲルにおいて使用される多糖類は、低い電気浸透 のアガロースである。

好ましくは、分析されるべきサンプルは、少なくとも６つの適用領域ＶＣ適用さ れ、少なくとも５つの異なった抗血清のそれぞれが、各対応するテンプレートス ロットを介してゲルの別々の電気泳動処理した積載に別々に適用される。抗血清 は、好ましくは１．抗血清のＩｇ７ラクシオンであり、より好ましくは抗血清の ＩｇＧ７フークシヨンである。抗血清は抗ヒ）　（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　）抗 血清であシ、抗ヒト抗血清は、ＩｇＧ、ｒｇＡ、ｒｇＭ、力、パ及び２ムダであ ることがまた好ましい。

蛋白質をその場で固定することができる組成物は、好ましくは、約１０乃至約５ ００、よシ好ましくは、約２５乃至約７５１７Ｌのスルホサリチル酸を含む。

この組成物は、約４よりも小さい又は約４と等しいｏＫａを有する促進ｔ（ｅｎ ｂａｎｅｉＨｇ　ａｍｏｕｎｔｓ　）の酸を任意に含むことができる。好ましく は、組成物は約１００まで、よシ好ましくは約ｌＯ乃至約１００．ｆｉ適には約 ２５乃至約７５１１１７ｔの氷酢酸を含む。

下記の実施例は、更に例示するためにのみ提供されておシ、開示されている発明 に関し限定となるものではない。

実施例１乃至８ 以下の手段を、第１表に娼げる各蛋白質沈降試薬に関して使用した。

第１表 Ａ、電気泳動手順 Ａ１．電気泳動セルの各サイドＫＯ，０５バルビタール緩衝剤ｐＨ８，６の４５ ミリリツトルを充填する。

Ａ２．免疫固定電気泳動（ＩＦＥ　）ゲルを包装から取出し、一枚のＦ紙で靜か に吸取る。Ｆ紙を捨てる。

Ａ３．サンプルテンプレートをゲルの上で位置合わせする。

Ａ４．　ｔ／１０希釈の試験被験物３乃至５マイクロリツトルを各テンプレート のスロットに適用する。血清蛋白質電気泳動（ＳＰＫ　）対照パターン用に、ス ロッ）　１　ａ　１／２希釈であるべきである。

Ａ５．最後のサンプルを適用してから５分間放置して拡散時間とし、次にテンプ レートを吸取紙で静かに吸取る。

吸取紙を捨てる。テンプレートを取除き、捨てる。

Ｍ、ゲルをゲルブリッジ（ｇｅｔ　ｂｒｉｄｇｅ　）の上及び電気泳動セルの中 に置く。カバーをし、電源に接続する。

Ａ７．１００ボルトで３０分間電気泳動を行なう。

ら取出し、１枚のＦ紙でゲルを静かに吸取る。紙を捨てる。

Ｂ、免疫固定手頃 Ｂ１．　ＩＦＥ抗血清テンプレートをゲルと位置合わせする。

トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）を静かにこすり、テンプレートとゲルの表面との完全な シールを確保する。

Ｋ適用するとともに４１表に掲げた蛋白質沈降試薬８０マイクロリ、トルをＳＰ Ｅ対照トラフに適用する。トラフの上にこぼさないようにする。ピベ、ト又は注 射器の先端でゲルの表面に触れない。

Ｂ３．　ゲルをプラスチ、りのトレイて入れる。カバーをし、４５℃で３０分間 温装する。

の順序で満たす。

生理的食塩水溶液、０．８５％ ８−アミノ−７−（３−ニトロフェニルアゾ）−２−（フェニルアゾ）−１−ナ フトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム塩蛋白質染料、５憾 酢酸水中０６５重量／体積チ 酢酸溶液、５ｔｌＩ水性 酢酸溶液、５係水性 Ｃ２，温置後に、ゲルを＠置トレイから取出し、ＩＦＥ抗血清テンプレートを取 除く。

Ｃ３，ゲルを生理的食塩水浴液に入゛れ、１分間連続して攪拌する。

Ｃ４、ゲルを新鮮な生理的食塩水浴液に１０分分間式る。

Ｃ５，ゲルを生理的食塩水溶液から取出す。

Ｃ６，ゲルを平坦な表面の１枚のＦ紙の上に置き、ゲルの表面を生理的食塩水で 湿潤し、次に２枚の厚い吸取紙に入れる。このアセンブリの上に平坦な約５ポン ドの重シを載せる。１０分間押圧する。

Ｃ７、ゲルを押圧体から取出し、新鮮な生理的食塩水での生理的食塩水洗浄及び 押圧（Ｃ４、Ｃ５及びＣ６）を繰返す。

Ｃ８，２回目の押圧後、ゲルを乾燥機の中へ３分間、即ち、完全に乾燥するまで 入れる。

Ｃ９，ゲルを８−アミノ−７−（３−ニトロフェニルアゾ）−２−（フェニルア ゾ）−１−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム塩蛋白質染料に３乃 至５分間式れる。

Ｃ１０，ゲルを染料溶液から取出し、酢酸溶液に２分間式れる。

Ｃ１１，ゲルを第１の酢酸溶液から取出し、第２の酢酸溶液の中に２分間、即ち 、背景が清澄になるまで入れる。

Ｃ１２，ゲルを最後の酢酸溶液から取出し、脱イオン水ですすぎ、乾燥機の中に ５分間、即ち、ｗＬｓするまで入れる。

第１表の各蛋白質沈降試薬をテンプレート法によシゲルの局部領域１ｃ適用する ことによシ、ゲルの小さな領域に位置している蛋白質だけを沈降させ、このよう にして、ゲルの領域の残シを免疫固定技術によシ処理する。こうして、この発明 は、免疫固定パターンと比較するために、同じゲルに対照パターンを得ることが できる。

これ九対し、先行技術の技法は、メチルアルコール中の酢酸のような、蛋白質沈 降試薬の中くゲル全体を完全に浸漬すること和より、蛋白質をゲルの中に固定す る。

このような先行技術の技法は、残シの電気振動領域を固定することも避けるた・ め、このような浸漬前に蛋白質の４気泳動されたパターンを切断することが必要 となる。

この開示に基づき、数多くのその他の修正と変更が当然に当業者に思いつくもの である。これらは、本発明の範囲内のものとなるように意図される。

参考文献 １１．アルフオンソ（Ａｌｆｏｎｓｏ　）　＊クリニカル・ケミストリー・アク タ（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｂｅｒｎ−Ａｃｔａ　）−第１０巻！第１１４乃至１２２頁 （１９６４年）　 ２、アルパー（Ａ１ｐ＠ｒ　）等、ボ、・サンプ（ｖＯ８＆ｎｇ）、第１７巻、 第４４５乃至４５２頁（１９６９年）３、アルバー（Ａｌｐ＠ｒ　）　ｒプログ レス・イン・インミ、ノロシー、ファースト・インターナシ、ナル・コンブレス ・モス（ｋｎｏｗ　）　、発行所アカデミ、り・プレス、二、−ヨーク、二、− ヨーク（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ＠ｓｓ＋ＮＹ、ＮＹ　）　Ｋ２Ｏ２乃至６２４ （１９７１年） ４、　ジ、ンンン（Ｊｏｈｎｍｏｎ　）　＋ジャーナル・オｆ”ラボラトリ−・ アンド・クリニカル・メデイシン（Ｊ、Ｌａｂ−＆　ＣＩｉｎ、Ｍｅｄ−）　、 Ｈ８７巻、第１５２乃至１６３頁（１９７６年） ５、　コーリー（Ｃａｖｉｔｙ）等、クリニカル・ケミストリー（ＣＩ　ｉｎ、 　Ｃｂｅｍ、　）第２２巻、第１２６２乃至１２６８頁（１９７６年） ６、　リッチ−（Ｒｉｔｅｈｉｅ　）等、クリニカル・ケミストリー、（Ｃ１１ ｎ、　Ｃｈｅｒ！＆、）第２２巻、第１９８２乃至１９８４頁（１９７６年） ７、　ニー＋）　−（Ｃａｖｌｅｙ　）−エレクトロホレシス・アンド・インミ ュノエレクトロホレシス（Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈ６ｒｅａｊｓａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ ｏｅｌｅｃ’ｔｙｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）　ｒ第１版・リトル中ブラウン・アン ド・カンパニー（Ｌｉｔｔｌｅ＋Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ　）＋ボストン、マ サチューセッツ（１９６９年）８、カバラロ（Ｃａマａｌｌａｒｏ　）等、イン ミュノフイクセイシ、ン・エレクトロホレシス（Ｉｒｎｍｏｎｏｆｉｘａｔｉｏ ｎＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）　ａニー・ニス・デパートメント・オプ 拳ヘルス自アンド・ヒユーマン・サービシズ（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｈ＠ ａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓ＠ｒｖＩｅ＊ｍ　）アトクリニカル・バンロ ンー（Ａ、＋ｙ、ｃｉｐ、　）第７２巻（１）、第５乃至１１頁（１９７９年） １０、リ、デー（Ｒｉｔｊｈｉ＊　）等、クリニカル・ケミストリー　（Ｃｌ１ ｎ、　Ｃｂ＠ｍ−）　ＷＥ　２２巻（４）、第４９７乃至４９９頁（１９７６年 ） 排他的所有権又は権利が主張される発明の実施例は、次のように規定される。

手続補正書 昭和６０年１１月２６日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 国際特許出御番号ＰＣＴ／ＵＳ８５１００４０９２、発明の名称 免疫固定電気様動力法 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 別紙のとおり浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文を補充する。（但し、内容 に変更なし）８、添付書類の目録 浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通国際調査報告 １＊＋自−１−ｓ電Ｉｅｍ−＾＊１−−−に５１５ｇ１−・ＰＣＴ／１Ｊｓ８５ １００４０９−２−Ａｊ−ＮＥＸＴｏ、？！＃−ＩＮＴＥＩＩＡＴＺＯＮＡＬＳ ＥＡＲＣ！’、ＲＥ？ＯＲτＩ＞＋

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）サンプルを電気泳動ゲルの少なくとも２つの適用領域に適用し、 （ｂ）前記ゲルを電気泳動処理し、 （ｃ）テンブレートを電気泳動処理したゲルに位置合わせし、そのテンプレート は各電気泳動処理した領域に対応するテンプレートスロットを有し、（ｄ）少な くとも１つのテンプレートスロットに蛋白質をその場で固定することができる組 成物を適用するとともに１つの蛋白質と反応することができる抗血清を残りのテ ンプレートスロットの少なくとも１つに適用し、 （ｅ）工程（ｄ）の生成物を温置し、 （ｆ）温置された電気泳動処理ゲルからテンプレートを取外し、 （ｇ）工程（ｆ）の温置された電気泳動処理ゲルを洗浄し、（ｈ）工程（ｇ）の 洗浄されたゲルを乾燥し、（ｉ）工程（ｈ）の乾燥したゲルを染色し、（ｊ）工 程（ｉ）の染色したゲルを脱色し、（ｋ）工程（ｊ）の脱色したゲルを乾燥し、 そして（ｌ）工程（ｋ）の乾燥したゲルを分析してなる方法。
2. ２．前記サンプルは少なくとも６つの適用領域に適用され、異なる抗血清が前記 グルの少なくとも５つの別々の電気泳動処理した領域に適用される請求の範囲第 １項の方法。
3. ３．前記抗血清は抗血清のＩｇフラクションである請求の範囲第２項の方法。
4. ４．前記抗血清は抗血清のＩｇＧフラクションである請求の範囲第２項の方法。
5. ５．前記抗血清は抗ヒト抗血清である請求の範囲第２項の方法。
6. ６．前記サンプルは６つの適用領域に適用され、前記抗ヒト抗血清はＩｇＧ，Ｉ ｇＡ，ＩｇＭ，カッパ及びラムダである請求の範囲第５項の方法。
7. ７．前記抗血清は抗血清のＩｇフラクションである請求の範囲第６項の方法。
8. ８．前記抗血清は抗血清のＩｇＧフラクションである請求の範囲第６項の方法。
9. ９．前記組成物は約１０乃至約５００ｇ／Ｌのスルホサリチル酸を含む請求の範 囲第１項の方法。
10. １０．前記組成物は更に４よりも小さい又は４と等しいｐＫａを有する促進量の 酸を含む請求の範囲第９項の方法。
11. １１．前記組成物は約１０乃至約５００ｇ／Ｌのスルホサリチル酸及び約１００ ｍｌ／Ｌまでの氷酢酸を含む請求の範囲第１項の方法。
12. １２．前記組成物は約２５乃至約７５ｇ／Ｌのスルホサリチル酸と約２５乃至約 ７５ｍｌ／Ｌの氷酢酸を含む請求の範囲第１１項の方法。
13. １３．前記サンプルは少なくとも６つの適用領域に適用され、異なる抗血清が前 記ゲルの少なくとも５つの別々の電気泳動処理領域に適用される請求の範囲第１ ２項の方法。
14. １４．前記抗血清は抗血清のＩｇフラクションである請求の範囲第１２項の方法 。
15. １５．前記抗血清は抗血清のＩｇＧフラクションである請求の範囲第１２項の方 法。
16. １６．前記抗血清は抗ヒト抗血清である請求の範囲第１２項の方法。
17. １７．前記サンプルは６つの適用領域に適用され、前記抗ヒト抗血清はＩｇＧ， ＩｇＡ，ＩｇＭ，カッパ及びラムダである請求の範囲第１２項の方法。
18. １８．前記抗血清は抗血清のＩｇフラクションである請求の範囲第１２項の方法 。
19. １９．前記抗血清は抗血清のＩｇＧフラクションである請求の範囲第１８項の方 法。