JPH0570789B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ (a) サンプルを電気泳動ゲルの少なくとも２
つの適用領域に適用し、 (b) 前記ゲルを電気泳動処理し、 (c) テンプレートを電気泳動処理したゲルに位置
合わせし、そのテンプレートは各電気泳動処理
した領域に対応するテンプレートスロツトを有
し、 (d) 少なくとも１つのテンプレートスロツトに蛋
白質をその場で固定することができる組成物を
適用するとともに１つの蛋白質と反応すること
ができる抗血清を残りのテンプレートスロツト
の少なくとも１つに適用し、 (e) 工程(d)の生成物を温置し、 (f) 温置された電気泳動処理ゲルからテンプレー
トを取外し、 (g) 工程(f)の温置された電気泳動処理ゲルを洗浄
し、 (h) 工程(g)の洗浄されたゲルを乾燥し、 (i) 工程(h)の乾燥したゲルを染色し、 (j) 工程(i)の染色したゲルを脱色し、 (k) 工程(j)の脱色したゲルを乾燥し、そして (l) 工程(k)の乾燥したゲルを分析してなる方法。

２ 前記サンプルは少なくとも６つの適用領域に
適用され、異なる抗血清が前記ゲルの少なくとも
５つの別々の電気泳動処理した領域に適用される
請求の範囲第１項の方法。

３ 前記抗血清は抗血清のIgフラクシヨンである
請求の範囲第２項の方法。

４ 前記抗血清は抗血清のIgGフラクシヨンであ
る請求の範囲第２項の方法。

５ 前記抗血清は抗ヒト抗血清である請求の範囲
第２項の方法。

６ 前記サンプルは６つの適用領域に適用され、
前記抗ヒト抗血清はIgG，IgA，IgM、カツパ及
びラムダである請求の範囲第５項の方法。

７ 前記抗血清は抗血清のIgフラクシヨンである
請求の範囲第６項の方法。

８ 前記抗血清は抗血清のIgGフラクシヨンであ
る請求の範囲第６項の方法。

９ 前記組成物は約10乃至約500ｇ／Ｌのスルホ
サリチル酸を含む請求の範囲第１項の方法。

１０ 前記組成物は更に４よりも小さい又は４と
等しいpKaを有する促進量の酸を含む請求の範囲
第９項の方法。

１１ 前記組成物は約10乃至約500ｇ／Ｌのスル
ホサリチル酸及び約100ml／Ｌまでの氷酢酸を含
む請求の範囲第１項の方法。

１２ 前記組成物は約25乃至約75ｇ／Ｌのスルホ
サリチル酸と約25乃至約75ml／Ｌの氷酢酸を含む
請求の範囲第１１項の方法。

１３ 前記サンプルは少なくとも６つの適用領域
に適用され、異なる抗血清が前記ゲルの少なくと
も５つの別々の電気泳動処理領域に適用される請
求の範囲第１２項の方法。

１４ 前記抗血清は抗血清のIgフラクシヨンであ
る請求の範囲第１２項の方法。

１５ 前記抗血清は抗血清のIgGフラクシヨンで
ある請求の範囲第１２項の方法。

１６ 前記抗血清は抗ヒト抗血清である請求の範
囲第１２項の方法。

１７ 前記サンプルは６つの適用領域に適用さ
れ、前記抗ヒト抗血清はIgG，lgA，IgM、カツ
パ及びラムダである請求の範囲第１２項の方法。

１８ 前記抗血清は抗血清のIgフラクシヨンであ
る請求の範囲第１２項の方法。

１９ 前記抗血清は抗血清のIgGフラクシヨンで
ある請求の範囲第１８項の方法。

発明の背景 １ 発明の分野 本発明は、免疫固定電気泳動
（immunofixation electrophoresis）技術に関す
る。

２ 先行技術の説明 免疫固定電気泳動（IFE）は、第１段階におい
てアガロース（agarose）ゲル蛋白質の電気泳動
を、第２段階で免疫沈降
（immunoprecipitation）を使用する２段階法で
ある。被験物は、血清、尿又は脳髄液であつても
よい。IFEは、学術研究、法医学、遺伝研究及び
臨床実験法において数多くの用途がある。免疫固
定電気泳動が単クローン性免疫グロブリン増多症
（monoclonal gammopathies）に関係する免疫
グロブリンの検出及び同定のために主として使用
される場合には、免疫固定電気泳動の最大の要求
は臨床実験にある。

アルフオンソ（Alfonso）が、(1)最初に、1964
年に文献に免疫固定を記載した。アルパー
（Alper）等は、(2)セルロプラスミン及びGC−グ
ロブリンの遺伝的多形の検出と、活性化に際して
のC3の転換の研究に没頭した結果、1969年に一
層実際的な方法を発表した。彼らは、その後、彼
らの研究を、補体成分の遺伝的多形現象とアルフ
ア１抗トリプシン表現型の同定に拡げた（３，
４）。免疫固定は先ず、1976年に免疫グロブリン
の研究のための方法として紹介された（５，６）。
免疫固定方法に関する数多くのその他の参考文献
がある（例えば、７乃至10）。

現時点で最も洗練された免疫固定電気泳動方法
は、サンプルを電気泳動ゲルの幾つかの適用部位
に適用し、ゲルを電気泳動処理し、蛋白質パター
ン部をゲルの残りの部分から切断し、蛋白質を電
気泳動ゲルのこの切断された部分において固定
し、ゲルに存在する残りの電気泳動された部分に
別の抗血清を適用するとともに得られたゲルを温
置し（incubate）、温置したゲルを洗浄し、洗浄
したゲルを乾燥し、乾燥したゲルを染色し、染色
したゲルを脱色し、脱色したゲルを乾燥し、そし
て乾燥したゲルを分析することを含む。

この方法の１つの欠点は、蛋白質の部分をゲル
の残りの部分から最初に切断する場合に不便が生
ずる以外に、ゲルの分離された固定蛋白質部分の
場所を間違えたり、あるいは紛失するということ
にある。

従つて、蛋白質を固定する前にゲルの蛋白質部
分をゲルから分離する必要のない免疫固定電気泳
動方法を有することが特に有利である。

発明の概要 本発明によれば、ゲルの蛋白質沈降パターン部
をその残りの部分から切断することを必要とせず
に、蛋白質のパターンを電気泳動ゲル内で染色す
ることができる、改良された免疫固定電気泳動方
法が提供されている。より詳細に云うと、本発明
の免疫固定電気泳動方法は、(a)サンプルを電気泳
動ゲルの少なくとも２つの適用領域に適用し、(b)
ゲルを電気泳動処理し、(c)テンプレートを電気泳
動処理したゲルの上で位置合わせし、テンプレー
トは各電気泳動処理した領域に対応したテンプレ
ートスロツトを有しており、(d)その場で蛋白質を
固定することができる組成物を少なくとも１つの
テンプレートスロツトに適用するとともに１つの
蛋白質と反応することができる抗血清を残りのテ
ンプレートスロツトの少なくとも１つに適用し、
(e)工程(d)の結果生成物を温置し、(f)テンプレート
を温置した電気泳動処理ゲルから取外し、(g)工程
(f)の培養した電気泳動処理ゲルを洗浄し、(h)工程
(g)の洗浄ゲルを乾燥し、(i)工程(h)の乾燥ゲルを染
色し、(i)工程(i)の染色ゲルを脱色し、(k)工程(j)の
脱色したゲルを乾燥し、そして(l)工程(k)の乾燥ゲ
ルを分析することからなる。

本発明の更に別の特徴とこれに伴なう利点は、
好ましい実施例についての以下の詳細な記載を読
むことから当業者に明白となるものである。

好ましい実施態様の説明 本発明の電気泳動ゲルにおいて好ましく使用す
ることができる多糖類は、寒天及びアガロースで
ある。アガロースは、低い電気浸透のアガロー
ス、中程度の電気浸透のアガロースあるいは高い
電気浸透のアガロースとすることができる。より
好ましくは、本発明の電気泳動ゲルにおいて使用
される多糖類は、低い電気浸透のアガロースであ
る。

好ましくは、分析されるべきサンプルは、少な
くとも６つの適用領域に適用され、少なくとも５
つの異なつた抗血清のそれぞれが、各対応するテ
ンプレートスロツトを介してゲルの別々の電気泳
動処理した領域に別々に適用される。抗血清は、
好ましくは、抗血清のIgフラクシヨンであり、よ
り好ましくは抗血清のIgGフラクシヨンである。
抗血清は抗ヒト（anti−human）抗血清であり、
抗ヒト抗血清は、IgG，IgA，IgM、カツパ及び
ラムダであることがまた好ましい。

蛋白質をその場で固定することができる組成物
は、好ましくは、約10乃至約500、より好ましく
は、約25乃至約75ｇ／Ｌのスルホサリチル酸を含
む。

この組成物は、約４よりも小さい又は約４と等
しいpKaを有する促進量（enhancing amounts）
の酸を任意に含むことができる。好ましくは、組
成物は約100まで、より好ましくは約10乃至約
100、最適には約25乃至約75ml／ｌの氷酢酸を含
む。

下記の実施例は、更に例示するためにのみ提供
されており、開示されている発明に関し限定とな
るものではない。

実施例 １乃至８ 以下の手段を、第表に掲げる各蛋白質沈降試
薬に関して使用した。

【表】 Ａ 電気泳動手順 A1 抗血清セルの各サイドに0.05バルビター
ル緩衝剤PH8.6の45ミリリツトルを充填する。

A2 免疫固定電気泳動（IFE）ゲルを包装か
ら取出し、一枚の紙で静かに吸取る。紙
を捨てる。

A3 サンプルテンプレートをゲルの上で位置
合わせする。

A4 1/10希釈の試験被験物３乃至５マイクロ
リツトルを各テンプレートのスロツトに適用
する。血清蛋白質電気泳動（SPE）対照パタ
ーン用に、スロツト１は1/2希釈であるべき
である。

A5 最後のサンプルを適用してから５分間放
置して拡散時間とし、次にテンプレートを吸
取紙で静かに吸取る。吸取紙を捨てる。テン
プレートを取除き、捨てる。

A6 ゲルをゲルブリツジ（gel bridge）の上
及び電気泳動セルの中に置く。カバーをし、
電源に接続する。

A7 100ボルトで30分間電気泳動を行なう。

A8 電気泳動の終了後直ちに、ゲルを電気泳
動セルから取出し、１枚の紙でゲルを静か
に吸取る。紙を捨てる。

Ｂ 免疫固定手順 B1 IFE抗血清テンプレートをゲルと位置合わ
せする。トラフ（trough）を静かにこすり、
テンプレートとゲルの表面との完全なシール
を確保する。

B2 80マイクロリツトルの抗血清を各抗血清
トラフに適用するとともに第表に掲げた蛋
白質沈降試薬80マイクロリツトルをSPE対照
トラフに適用する。トラフの上にこぼさない
ようにする。ピペツト又は注射器の先端でゲ
ルの表面に触れない。

B3 ゲルをプラスチツクのトレイに入れる。
カバーをし、45℃で30分間温置する。

Ｃ 染色及び乾燥手順 C1 ４つのプラスチツクトレイに下記の溶液
を、指示の順序で満たす。

生理的食塩水溶液、0.85％ ８−アミノ−７−（３−ニトロフエニルア
ゾ）−２−（フエニルアゾ）−１−ナフトール
−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム塩蛋白
質染料、５％ 酢酸水中0.5重量／体積％ 酢酸溶液、５％水性 酢酸溶液、５％水性 C2 温置後に、ゲルを温置トレイから取出し、
IFE抗血清テンプレートを取除く。

C3 ゲルを生理的食塩水溶液に入れ、１分間
連続して撹拌する。

C4 ゲルを新鮮な生理的食塩水溶液に10分間
入れる。

C5 ゲルを生理的食塩水溶液から取出す。

C6 ゲルを平坦な表面の１枚の紙の上に置
き、ゲルの表面を生理的食塩水溶液で湿潤
し、次に２枚の厚い吸取紙に入れる。このア
センブリの上に平坦な約５ポンドの重りを載
せる。10分間押圧する。

C7 ゲルを押圧体から取出し、新鮮な生理的
食塩水での生理的食塩水洗浄及び押圧（C4、
C5及びC6）を繰返す。

C8 ２回目の押圧後、ゲルを乾燥機の中へ３
分間、即ち、完全に乾燥するまで入れる。

C9 ゲルを８−アミノ−７−（３−ニトロフエ
ニルアゾ）−２−（フエニルアゾ）−１−ナフ
トール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム
塩蛋白質染料に３乃至５分間入れる。

C10 ゲルを染料溶液から取出し、酢酸溶液に
２分間入れる。

C11 ゲルを第１の酢酸溶液から取出し、第２
の酢酸溶液の中に２分間、即ち、背景が清澄
になるまで入れる。

C12 ゲルを最後の酢酸溶液から取出し、脱イ
オン水ですすぎ、乾燥機の中に５分間、即
ち、乾燥するまで入れる。

第表の各蛋白質沈降試薬をテンプレート法に
よりゲルの局部領域に適用することにより、ゲル
の小さな領域に位置している蛋白質だけを沈降さ
せ、このようにして、ゲルの領域の残りを免疫固
定技術により処理する。こうして、この発明は、
免疫固定パターンと比較するために、同じゲルに
対照パターンを得ることができる。

これに対し、先行技術の技法は、メチルアルコ
ール中の酢酸のような、蛋白質沈降試薬の中にゲ
ル全体を完全に浸漬することにより、蛋白質をゲ
ルの中に固定する。このような先行技術の技法
は、残りの電気泳動領域を固定することも避ける
ため、このような浸漬前に蛋白質の電気泳動され
たパターンを切断することが必要となる。

この開示に基づき、数多くのその他の修正と変
更が当然に当業者に思いつくものである。これら
は、本発明の範囲内のものとなるように意図され
る。

参考文献 １ アルフオンソ（Alfonso）、クリニカル・ケ
ミストリー・アクタ（Clin.Chem.Acta）、第10
巻、第114乃至122頁（1964年） ２ アルパー（Alper）等、ボ・サング（Vo
Sang）、第17巻、第445乃至452頁（1969年） ３ アルパー（Alper）、プログレス・イン・イ
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ル・コングレス・オブ・インミユノロジー
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アンド・インミユノエレクトロホレシス
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Brown and Co）、ボストン、マサチユーセツ
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クセイシヨン・エレクトロホレシス
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エス・デパートメント・オブ・ヘルス・アン
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