DE19913940C1 - Generelle Proteindetektion mittels Biotinilierung im Gel - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur generellen Detektion von Proteinen. Nach Auftrennung der Proteine in einem Gel werden die Proteine im Gel biotiniliert. Schließlich werden die Proteine durch Nachweis der Biotingruppe detektiert. Die Erfindung betrifft auch Testkits, die dieses Verfahren verwenden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Proteinen, bei dem Proteine nach Gelelektrophorese im Gel biotiniliert werden.

Eine Routinemethode in den Biowissenschaften ist die Auftrennung von Proteinen in einem Gel und die anschließende Detektion der Proteine. Dabei besteht ein großer Bedarf nach immer sensititiveren Nachweismethoden für die Proteine. Die am weitesten verbreitete Methode ist die Detektion durch Färbung mit dem Farbstoff Coomassie-Blau, die jedoch nur eine mäßige Sensitivität aufweist.

Das sog. "Reverse Staining" beruht auf einem anderen Prinzip, es wird das Gel mit Hilfe von Zinkionen gefärbt, nicht aber die darin enthaltenen Proteine. Diese Methode ist etwas empfindlicher als die Coomassie-Färbung (Ferreras et al. (1993) Anal. Biochem. 213, 206-212).

Eine sensitivere Nachweismethode ist die Silberfärbung von Proteinen im Gel. Durch spezielle Protokolle kann mit dieser Methode 1 ng Protein nachgewiesen werden (Ross und Peters (1990) BioTechniques 9, 532-533; Heukeshoven und Dernick (1988) Electrophoresis 9, 28-32).

Kommerziell erhältliche Kits, die auf Silberfärbung beruhen, und Protokolle für den täglichen Gebrauch haben jedoch ein Detektionslimit von etwa 10 ng Protein. Ein gravierender Nachteil der Silberfärbung ist auch, daß manche Proteine überhaupt nicht angefärbt werden. Ein Beispiel ist das wichtige Protein Calmodulin. Schließlich ist ein weiterer Nachteil, daß silbergefärbte Proteine nur in Ausnahme durch "Western- Blotting" immunologisch detektiert werden können (Exner und Nürnberg (1998) Analytical Biochemistry 260, 108-110).

WO 85/04256 offenbart ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Proteinen, bei dem Proteine elektrophoretisch aufgetrennt werden und anschließend einer Immunfixierung unterworfen werden.

EP 0 514 928 A2 offenbart Verfahren zur Diagnose von Nierenerkrankungen, wobei Fragmente von Albumin im Urin detektiert werden. Die Detektion der Albuminfragmente kann durch Immunblotting unter Verwendung von biotingekoppelten sekundären Antikörpern erfolgen.

Es wurde ebenfalls gezeigt, daß nach Elektroblotting der Proteine auf eine Membran durch Biotinilierung der Proteine auf der Membran und anschließende Detektion mit Hilfe von Streptavidin Proteine detektiert werden können (LaRochelle und Froehner (1986) J. Immunol. Methods 92, 65-71). Nach diesem Verfahren werden Proteine auf einem Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Auf der Membran wird Biotin an die Proteine gekoppelt. Anschließend werden die Proteine durch Streptavidin, einen Kaninchen-anti-Sreptavidin- Antikörper und einen Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Ziege- anti-Kaninchen-Antikörper nachgewiesen. Dieses Verfahren nützt die sehr starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin aus, um Proteine nach Gelelektrophorese generell nachzuweisen. Die maximal erreichbare Sensitivität der Methode wird jedoch mit etwa 5 ng Protein angegeben. Das bedeutet, daß dieses Verfahren keinerlei Verbesserung der Empfindlichkeit gegenüber anderen Verfahren wie z. B. der Silberfärbung bietet.

Zwar ist eine weitaus höhere Sensitivität erreichbar durch immunologische Detektion von Proteinen, dies setzt jedoch voraus, daß spezifische Antikörper gegen definierte Proteine verfügbar sind. Daher ist diese Methode nicht allgemein anwendbar.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur generellen Detektion von Proteinen bereitzustellen, das eine signifikante Verbesserung der Sensitivität ermöglicht. Ein derartiges Verfahren sollte den Nachweis praktisch aller Proteine ermöglichen. Darüber hinaus sollte es möglich sein, nach dem Proteinnachweis einzelne Proteine mit spezifischen Antikörpern nachzuweisen.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst. Dabei werden Proteine in einem Gel aufgetrennt. Anschließend werden die im Gel befindlichen Proteine biotiniliert. Das bedeutet, daß Biotin oder wenigstens ein Fragment von Biotin über eine reaktive Gruppe an die im Gel aufgetrennten Proteine gebunden wird. Schließlich werden die Proteine detektiert, wobei die Detektion auf dem Nachweis der Biotingruppe beruht.

Die Proteine können durch alle Gelelektrophoreseverfahren aufgetrennt werden. Bevorzugtes Gelmaterial ist Polyacrylamid. Bevorzugte Elektrophoreseverfahren sind diskontinuierliche Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung und zweidimensionale Gelelektrophorese. Die Elektrophoresebedingungen können nativ und nichtreduzierend sein, bevorzugt sind sie jedoch denaturierend und/oder reduzierend. Das am meisten bevorzugte Elektrophoreseverfahren ist Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE).

Es ist wesentlich für den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß nach dem Auftrennen der Proteine in einem Gel eine biotinhaltige Verbindung an die Proteine im Gel gekoppelt wird. Das heißt, die Biotinilierung erfolgt nicht vor der Auftrennung der Proteine im Gel und nicht nach einem Transfer der Proteine auf eine Membran, sondern im Gel.

Zur Koppelung der biotinhaltigen Verbindung an die Proteine im Gel können zahlreiche Verbindungen verwendet werden. Eine biotinhaltige Verbindung bedeutet hierbei eine Verbindung, die Biotin, eine Biotin-ähnliche Gruppe oder ein Fragment von Biotin enthält. Der Begriff "biotinhaltige Verbindung" umfaßt die in der Literatur beschriebenen biotinanalogen Verbindungen. Eine Modifikation des Biotin kann eine Variation der Länge der Alkylkette zwischen der Carboxylgruppe und dem Rest des Biotins sein, was als "Spacer" wirken kann. Beispielsweise kann auch Biocytin, bestehend aus Biotin und Lysin, eingesetzt werden.

Auch die reaktive Gruppe der biotinhaltigen Verbindung, über die die Bindung an die Proteine erfolgt, kann variieren. Vorzugsweise entsteht bei der Koppelung eine kovalente Verbindung zwischen der biotinhaltigen Verbindung und den Proteinen im Gel. Dazu können Verbindungen eingesetzt werden, die mit Aminogruppen in Proteinen reagieren. Dadurch wird garantiert, daß nahezu alle Proteine detektiert werden können, dies stellt einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.

Mögliche Verbindungen sind Isothiocyanat-, Succinimidylester-, Sulfonylhalid-, Glyoxal- und Aldehyd-gekoppelte Biotine. Bevorzugt eingesetzt werden N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester oder sulfo-NHS-Ester wie zum Beispiel Sulfo-NHS-LC-Biotin oder NHS-Imino-Biotin, oder Dinitrophenyl-biocytin-succinimidyl­ ester. Zu einer verbesserten Biotinilierungseffizienz kann die Verwendung von längerkettigen Biotinkonjugaten führen, wie zum Beispiel Sulfosuccinimidyl-6-(Biotinamido)Hexanoat. (NHS(Biotin)₆) (Hofmann et al. (1982) Biochemistry 21, 978- 984).

Gegebenenfalls muß - abhängig von der Natur des Koppelungsreagens - vor der Koppelung das Gel dialysiert werden, um störende Substanzen zu entfernen. Schließlich können zur Koppelung auch Biotin gekoppelte Pyridyldithiole, z. B. Biotin-HPDP eingesetzt werden, oder Biocytinamide oder EZ-Link- Biotin.

Es können auch photoaktivierbare Substanzen wie Azido-, Diazo- oder Arylgruppen enthaltende Biotine eingesetzt werden, um eine höhere Biotinilierungseffizienz zu erreichen. Dazu sind auch Benzoylgruppen oder Benzophenongruppen enthaltende Biotine geeignet, vorzugsweise Aminobenzoyl- und p-Diazobenzoyl­ gekoppelte Biotine, besonders bevorzugt p-Aminobenzoyl-Biocytin und p-Diazobenzoyl-Biocytin.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist es möglich, selektiv Proteine mit bestimmten Eigenschaften zu detektieren. Das geschieht durch Auswahl des Koppelungsreagens. Hydrazide reagieren zum Beispiel mit Kohlenhydraten, die durch Periodsäure oxidiert worden sind. Deshalb können Biotin- Hydrazide oder Biocytin-Hydrazide zum selektiven Nachweis von glykosylierten Proteinen eingesetzt werden. Dazu sind auch Biotin- oder Biocytin-Amine geeignet, beispielsweise 5- (Biotinamido)pentylamine oder Biotin-X-ethylendiamine.

Auch freie Sulfhydrylgruppen in Proteinen können nachgewiesen werden. Dazu werden Maleimide oder Iodoacetylverbindungen verwendet, vorzugsweise Biotin-BMCC, Maleimido-propionyl- Biocytin, Biotin-Iodoacetamid und Iodoacetyl-LC-Biotin. Zum Nachweis freier Sulfhydrylgruppen eignen sich außerdem alkylierende Biotine, an Biotin gekoppelte Derivate von Acrylsäuren, an Biotin gekoppelte Haloacetylderivate oder Biotin gekoppelte Dansylcystine. Zusätzlich können auch Disulfidbrücken markiert werden, ohne die Cysteine zu reduzieren, nämlich mit Biotinverbindungen, die selbst eine Disulfidbindung besitzen.

Die Detektion der biotinilierten Proteine kann direkt im Gel erfolgen. Dazu wird bevorzugt eine Avidin- oder Streptavidin­ haltige Verbindung eingesetzt. Diese Verbindung enthält zudem eine detektierbare Komponente, vorzugsweise einen fluoreszierenden Teil. Der fluoreszierende Teil kann aus einem niedermolekularen Fluorophor bestehen, wie Fluorescein, Texas- Red, Rhodamin, etc. oder aus einem fluoreszierenden Protein wie dem "Green fluorescent protein" (GFP). Nach Inkubation des Gels mit dieser Detektionskomponente kann das Gel mit einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt und die emittierten Signale aufgezeichnet werden. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von radioaktiv markiertem Avidin oder Streptavidin. Nach Inkubation mit der radioaktiven Verbindung wird das Gel getrocknet und exponiert. Neben Avidin oder Streptavidin enthaltenden Verbindungen können auch anti-Biotin-Antikörper oder deren F(ab')₂- oder Fab-Fragmente zur Detektion verwendet werden. Dabei können diese Antikörper oder die Fragmente selbst mit einer detektierbaren Komponente markiert sein oder nachgewiesen werden durch einen sekundären Antikörper, der detektiert werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Proteine jedoch nicht im Gel detektiert, sondern zuvor, vorzugsweise elektrophoretisch auf eine Membran transferiert. Auch auf der Membran erfolgt die Detektion vorzugsweise mit Hilfe von Avidin oder Streptavidin enthaltenden Verbindungen, es können aber auch anti-Biotin-Antikörper oder deren F(ab')₂- oder Fab-Fragmente eingesetzt werden. Diese Verbindungen können wie bei der Detektion im Gel Fluorophore oder radioaktive Markierungen enthalten. Bevorzugt ist jedoch Avidin oder Streptavidin, das mit einem Enzym gekoppelt ist. Es kann zum Beispiel Streptavidin verwendet werden, das mit einer Peroxidase oder mit alkalischer Phosphatase gekoppelt ist. Alternativ können Avidin oder Streptavidin auch mit anti- Avidin-, anti-Streptavidin-Antikörpern oder deren F(ab')₂- oder Fab-Fragmenten nachgewiesen werden. Im Fall von Peroxidase kann die Detektion beispielsweise durch Chemolumineszenz erfolgen. Hierzu eignet sich das "Enhanced Chemoluminescence" (ECL) Kit der Firmen Amersham, PIERCE, BIORAD und anderen. Es können aber auch Substrate eingesetzt werden, die die Membran selbst färben wie DAB und TMB (Peroxidase) oder NBT (Alkalische Phosphatase).

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nach der generellen Proteindetektion ein immunologischer Nachweis einzelner Proteine durch spezifische Antikörper möglich ist. Diese Möglichkeit besteht bei herkömmlichen Färbeverfahren wie der Silberfärbung in der Regel nicht.

Ein bedeutender Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt in der stark verbesserten Sensitivität des Proteinnachweises. Die Verbesserung gegenüber kommerziell erhältlichen Silberfärbungs-Kits und gängigen Laborprotokollen ist bis zu 200fach.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Testkits für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein Testkit kann eine Substanz enthalten, die vor der Gelelektrophorese den Proben zugesetzt wird, um Thiolgruppen zu blockieren, vorzugsweise Iodacetamid. Weiterhin kann das Kit mindestens eine Biotin enthaltende Verbindung enthalten, die an Proteine im Gel gekoppelt werden kann, bevorzugt N- Hydroxysuccinimidester. Die Biotin enthaltende Verbindung kann auch nur ein Fragment von Biotin oder ein modifiziertes Biotin enthalten. Das Kit kann auch Substanzen oder Lösungen enthalten zur Blockierung unspezifischer Bindestellen, falls die Proteine nach der Biotinilierung auf eine Membran übertragen werden. Schließlich kann das Kit Substanzen zur Detektion der Biotingruppe enthalten. Das kann Fluorophor-konjugiertes Streptavidin sein, bevorzugt ist es jedoch Enzym-konjugiertes Streptavidin zusammen mit Substratlösungen, die für den Nachweis nötig sind.

Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Verschiedene Mengen Rinderserumalbumin (BSA) und Ovalbumin (jeweils 20 pg bis 160 ng) wurden durch Natriumdodecysulfat- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Die Proben waren vor dem Auftrag auf das Gel mit Iodacetamid versetzt worden, um enthaltenes DTT zu blockieren. Anschließend wurde das Gel für 30 Minuten in 50 ml PBS dialysiert und kurz mit Wasser gewaschen. Dieser Dialyse- und Waschschritt wurde fünfmal wiederholt. Anschließend wurde das Gel in 4 ml 1 mg/ml N- Hydroxysuccinimid-Biotin (NHS-Biotin) in PBS für 1 Stunde inkubiert. Nach der Biotinilierung wurden die Proteine elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert (Blot Puffer: 20 mM Tris HCl, 150 mM Glycin, 20% Methanol). Die Membran wurde mit 1x "Rotiblock", das von der Firma Roth erhältlich ist, inkubiert, um unspezifische Bindestellen zu sättigen. Zur Detektion des gebundenen Biotin wurde das "ABC- Kit" der Firma Pierce verwendet. Es enthält eine Mischung aus biotinilierter Meerrettichperoxidase und vierwertigem Avidin, dadurch entstehen große Komplexe, die an ein einzelnes Biotinmolekül gebunden werden können. Die Membran wurde in "ABC"-Lösung (1 : 10 verdünnt in PBS, 0,1% Tween-20) für 30 Minuten inkubiert, dann wurde sie dreimal fünf Minuten in PBS/Tween gewaschen. Schließlich wurde die Membran mit dem "ECL"-System der Firma Amersham entwickelt. Die Signale wurden sichtbar gemacht durch Exposition eines Chemolumineszenzfilms. Die Silberfärbung eines identischen Gels wurde durchgeführt mit dem "Silver-stain-plus-kit" der Firma Bio-Rad. Die Signale der aus dem Proteinnachweis mittels Biotinilierung und aus dem Proteinnachweis durch Silberfärbung wurden densitometrisch analysiert und verglichen.

Abb. 1 zeigt die Intensitäten in Abhängigkeit von der Menge aufgetragenen Proteins.

Beispiel 2

Proteine wurden durch SDS-PAGE wie in Beispiel 1 beschrieben aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel für 30 Minuten in 50 ml PBS dialysiert und kurz mit Wasser gewaschen. Dieser Dialyse- und Waschschritt wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurde das Gel in 20 ml 1,5 mg/ml NHS-LC-Biotin in PBS für eine Stunde inkubiert. Nach erfolgter Biotinilierung wurden die Proteine elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Zur Sättigung unspezifischer Bindestellen wurde die Membran für 50 Minuten mit 5% BSA inkubiert. Zur Detektion wurde die Membran für 30 Minuten in Meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin (1 : 5000 in PBS, 0,1% Tween-20) inkubiert. Anschließend wurde die Membran für 5 Minuten in 10 ml PBS/Tween gewaschen und kurz in PBS/Tween gespült. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde die Membran mit dem "Enhanced ECL ultra"-System von PIERCE entwickelt. Die Signale wurden durch Exposition eines Chemolumineszenzfilms sichtbar gemacht.

Claims (16)

1. Verfahren zur Detektion von Proteinen, das folgende Schritte umfaßt:

• a) Auftrennung von Proteinen in einem Gel,
• b) Koppelung einer wenigstens ein Fragment von Biotin umfassenden Verbindung an Proteine im Gel,
• c) Detektion der an die Proteine gekoppelten, wenigstens ein Fragment von Biotin umfassenden Verbindung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Proteine durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Proteine durch Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Proteine durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Koppelung gemäß Schritt b) eine Verbindung eingesetzt wird, die mit Aminogruppen in Proteinen reagiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Koppelung gemäß Schritt b) eine Verbindung eingesetzt wird, die geeignet ist, um Kohlenhydrate nachzuweisen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Koppelung gemäß Schritt b) eine Verbindung eingesetzt wird, die geeignet ist, mit freien Sulfhydrylgruppen oder mit Disulfidbrücken in Proteinen zu reagieren.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Koppelung gemäß Schritt b) eine photoaktivierbare Verbindung eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Detektion gemäß Schritt c) die Proteine elektrophoretisch auf eine Membran transferiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion gemäß Schritt c) ein anti- Biotin-Antikörper, oder F(ab')₂- oder Fab-Fragmente davon eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion gemäß Schritt c) mit Hilfe von Streptavidin oder Avidin erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion gemäß Schritt c) eine enzymgekoppelte Verbindung eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion gemäß Schritt c) mit Hilfe einer fluoreszierenden Verbindung erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion gemäß Schritt c) mit Hilfe einer radioaktiven Verbindung erfolgt.

15. Testkit für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens eine wenigstens ein Fragment von Biotin umfassende Verbindung enthält.

16. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin ein Blockierungsmittel für die Membran enthält.