DE69931467T2

DE69931467T2 - Neue komplexe, die vernetztes avidin enthalten, verfahren zur herstellung und analyseverfahren, das diese verwendet

Info

Publication number: DE69931467T2
Application number: DE69931467T
Authority: DE
Inventors: c/o Mitsubishi Kagaku Iatron Kazuyuki SUGIYAMA; c/o Mitsubishi Kagaku Iatron Nobuhiro HOSHINO; c/o Mitsubishi Kagaku Iatron Hiroki TATSUMI; Satoshi c/o Mitsubishi Kagaku Iatron FUKUDA
Original assignee: Kikkoman Corp; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Kikkoman Corp; LSI Medience Corp
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2019-11-06
Also published as: EP1052510B1; ES2264271T3; US6787325B1; EP1052510A4; JP4004230B2; DE69931467D1; EP1052510A1; EP1052510B2; DE69931467T3; ATE327508T1; WO2000028326A1; DE69931467T8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Komplex, der ein vernetztes Avidin enthält, ein Verfahren zur Herstellung des neuen Komplexes und ein Analyseverfahren, das den neuen Komplex verwendet. Der hier verwendete Begriff „analysieren" oder „Analyse" schließt einen Nachweis, der verwendet wird, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer zu analysierenden Verbindung zu bestimmen, und eine quantitative Bestimmung einer Menge einer zu analysierenden Verbindung ein.
Ein Enzym-Immunoassay ist ein hochempfindliches Assay, das sich eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu Nutze macht. Ein typisches Enzym-Immunoassay ist ein heterogenes Enzym-Immunoassay, wie ein Sandwich-Verfahren, wobei ein an einer festen Phase immobilisierter Antikörper und ein markierter Antikörper verwendet werden, oder ein kompetitives Verfahren, wobei der an einer festen Phase immobilisierte Antikörper und ein markiertes Antigen verwendet werden.
Ein in den vorstehenden Assays verwendetes mit Enzym markiertes Antigen oder ein mit Enzym markierter Antikörper wird mittels verschiedener Verfahren hergestellt. In einem frühen Stadium wurde zum Beispiel ein Verfahren entwickelt, um durch Zugabe von Glutaraldehyd mit bivalenter Reaktivität zu einem Gemisch aus den Enzymen und den Antigenen oder Antikörpern ein statistisches Polymer aus Enzymen und Antigenen oder Antikörpern herzustellen (Immunochemistry, 1969, Bd. 6, S. 43–52). Danach wurde eine Verbesserung angestrebt, um sich die Tatsache, dass Peroxidase eine geringe Zahl von Aminogruppen auf seiner Oberfläche aufweist und eine hohe Beständigkeit gegenüber einem chemisch aktiven Reagenz zeigt, zu Nutze zu machen. Es wurde insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Synthese nur der gewünschten mit Enzym markierten Antikörper durch Umsetzen von Glutaraldehyd mit Peroxidase, Entfernen überschüssiger Aldehydgruppen und Mischen der enthaltenen Peroxidase mit eingeführtem Aldehyd mit Antikörpern entwickelt (J. Immunol. Methods, 1979, Bd. 30, S. 245–255). Weiterhin wurde im Hinblick auf die Tatsache, dass Peroxidase Zuckerketten aufweist, ein Verfahren zur Herstellung mit Enzym markierter Antikörper mit einer hohen Ausbeute entwickelt (J. Histochem. Cytochem., 1974, Bd. 22, S. 1084–1091). Insbesondere umfasst dieses Verfahren das Oxidieren von Zuckerketten mit Periodsäure, wobei Aldehydgruppen gebildet werden, und das Binden von Aminogruppen von Antikörpern daran, um mit Enzym markierte Antikörper herzustellen.
Verschiedene Vernetzungsmittel wurden entwickelt und in Umsetzungen, die Antikörper und Enzyme verbinden, verwendet. Von diesen Vernetzungsmitteln wurde ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel mit einer Succinimidgruppe und einer Maleimidgruppe an beiden Enden entwickelt (Eur. J. Biochem., 1979, Bd. 101, S. 395–399). Dieses Mittel kann eine Aminogruppe eines Enzyms spezifisch an eine SH-Gruppe in einer Gelenkregion eines Antikörpers binden, wobei ein mit Enzym markierter Antikörper in einer hohen Ausbeute hergestellt wird.
Neben dem vorstehenden Verfahren, in denen ein Antigen oder ein Antikörper mit einem Vernetzungsmittel an ein Enzym gebunden wird, wurden Kopplungsverfahren unter Verwendung einer Avidin-Biotin-Reaktion zum Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ein Enzym entwickelt (J. Histochem. Cytochem., 1979, Bd. 27, S. 1131–1139). In diesen Verfahren wird im allgemeinen eine Kombination aus zwei Reagenzien verwendet. Insbesondere wird einerseits ein biotinylierendes Mittel verwendet, um ein Antigen oder einen Antikörper herzustellen, in das/den ein Biotin eingeführt ist, d.h. ein biotinyliertes Antigen oder ein biotinylierter Antikörper. Andererseits wird (1) ein Komplex aus einem Enzym und einem Avidin, d.h. ein mit Enzym markiertes Avidin, durch ein chemisches Bindungsverfahren hergestellt, oder (2) ein Komplex aus einem Enzym und einem Avidin über ein Biotin, d.h. ein mit Enzym markiertes Avidin, durch Mischen eines biotinylierten Enzyms und eines Avidins in einem geeigneten Verhältnis hergestellt.
Das chemische Bindungsverfahren (1) umfasst das Verbinden eines Enzyms und eines Avidins mit Glutaraldehyd oder einem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel (Immunochemistry, 1969, Bd. 6, S. 43–52) und kann daher durch Wiederholen einer Prozedur des Verfahrens zur Herstellung des mit Enzym markierten Antikörpers durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass anstatt der Kombination eines Enzyms und eines Antikörpers ein Enzym und Avidin kombiniert werden.
Das im vorstehenden Verfahren (2) verwendete biotinylierte Enzym kann zum Beispiel gemäß einem Genmanipulationsverfahren hergestellt werden, wenn Luciferase als Enzym verwendet wird (Analytical Biochemistry, 1996, Bd. 243, S. 176–180 und J. Clinical Ligand Assays, 1998, Bd. 21, S. 358–362). Insbesondere wird, wenn ein Gen, das ein Luciferasegen und ein daran ligiertes Biotinakzeptorgen enthält, in einer Wirtszelle exprimiert wird, ein verknüpftes Protein von Luciferase und Biotinakzeptor in der Wirtszelle synthetisiert. Dann wird Biotin durch eine Aktion der Wirtszelle mit dem kondensierten Protein gekoppelt, wobei ein biotinyliertes Enzym, d.h. ein verknüpftes Protein von Luciferase und Biotinakzeptor, in das Biotin eingeführt ist, hergestellt wird.
Das Verfahren, in dem das erhaltene biotinylierte Antigen oder der biotinylierte Antikörper und das mit Enzym markierte Avidin verwendet werden, umfasst Umsetzen einer Probe, die eine zu analysierende Verbindung (ein Antigen) enthält, mit einem Träger, der immobilisierte Antikörper darauf trägt; Waschen des Reaktionsgemisches; Umsetzen des biotinylierten Antikörpers damit; Waschen des Reaktionsgemisches; Umsetzen des mit Enzym markierten Avidins damit und Messen der Menge des Enzyms, das aus dem mit Enzym markierten Avidin stammt, das an den Komplex aus dem die immobilisierten Antikörper tragenden Träger und der zu analysierenden Verbindung gebunden ist, wodurch die Menge des Antigens bestimmt werden kann (Am. J. Clin. Pathol., 1981, Bd. 75, S. 816–821).
Das Immunoassay, das die Avidin-Biotin-Reaktion verwendet, hat Vorteile dahingehend, dass, wenn das mit Enzym markierte Avidin vorher hergestellt wird, verschiedene Antikörper als Markierung nach der Biotinylierung verwendet werden können, und dass ein Enzym, dessen Aktivität durch eine chemische Behandlung stark gestört ist, in Form eines mit Enzym markierten Avidins verwendet werden kann, wobei seine Aktivität aufrechterhalten wird, wenn das biotinylierte Enzym gemäß der Genmanipulation exprimiert wird. Das vorstehende Immunoassay weist jedoch dahingehend Nachteile auf, dass die Anzahl an Verfahrensschritten zunimmt und die bei jeder Bestimmung erhaltenen Daten eine schlechtere Reproduzierbarkeit zeigen.
Es wurde versucht, die Reaktionsschritte durch Vormischen eines biotinylierten Antikörpers, von Avidin und eines biotinylierten Enzyms und Verwenden dieser in Form eines mit Enzym markierten Antikörpers, d.h. eines Komplexes aus biotinyliertem Antikörper, Avidin und biotinyliertem Enzym zu verringern. Die Reaktivität ist jedoch stark herabgesetzt oder die Stabilität ist merklich verringert, und daher kann er nicht als solcher als Reagenz verwendet werden.
Die Avidin-Biotin-Reaktion wird neben dem Immunoassay auf ein DNA- oder RNA-Assay mittels einer DNA-Sonde (Methods in Enzymology, Bd. 184, S. 560–617) oder ein Rezeptor-Ligand-Assay (Methods in Enzymology, Bd. 184, S. 660–668) angewendet. Die Anwendung der Avidin-Biotin-Reaktion auf die vorstehenden Assays weist ähnliche Nachteile auf, wie sie in den Immunoassays auftreten.
In Reznik et al., Nature Biotechnology (1996) Bd. 14, S. 1007–1011, werden bestimmte Streptavidine mit Vernetzungen zwischen Untereinheiten beschrieben. CN-A-1142610 betrifft ein bestimmtes Verfahren zur Analyse nicht kovalenter Wechselwirkungen zwischen biologischen Komponenten, umfassend die Verwendung von Biotin-Reagenzien und radioaktiven Isotopen, um Komponenten zu markieren und die Zugabe von Flüssigkeit, gefolgt von Avidin oder ähnlichem Streptavidin, das mit einen festen Träger kovalent vernetzt ist. In Liu et al., Analytical Chemistry (1995) Bd. 67, Nr. 10, S. 1679–1683, wird ein spezifischer mit Nitrilase modifizierter glasartiger Kohlenstoff-Mikroelektrodensensor für Benzonitril beschrieben. US-A-4,282,287 offenbart ein bestimmtes Mehrschichtverfahren zum Auftragen des Proteins, des Avidins und eines Biotin enthaltenden Extendermaterials auf eine feste Oberfläche in abwechselnden, aufeinanderfolgenden Schichten. In Wink et al., Analytical Chemistry (1998) Bd. 70, Nr. 5, S. 827–832, wird eine spezifische durch Liposome vermittelte Verstärkung der Empfindlichkeit in Immunoassays von Proteinen und Peptiden in der Oberflächen-Plasmon-Resonanzspektrometrie beschrieben.
Demgemäß besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, den vorstehend erwähnten Nachteilen des Stands der Technik abzuhelfen und ein schnelles, einfaches und genaues Assay mit einer geringen Zahl an Verfahrensschritten zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biotip-Avidin-Biotip-Komplex, umfassend mindestens zwei biotinylierte Substanzen, welche gleich oder voneinander verschieden sind, und ein vernetztes Avidin, welches sandwichartig dazwischen vorliegt, wobei das vernetzte Avidin ein vernetztes Avidinmonomer ist, welches aus einem Avidinmolekül oder einem vernetzten Avidinpolymer, welches aus mehreren Avidinmolekülen zusammengesetzt ist, zusammengesetzt ist, welche durch intermolekulare Vernetzungen aneinander gebunden sind.
Im erfindungsgemäßen Biotin-Avidin-Biotin-Komplex ist mindestens eine der biotinylierten Substanzen vorzugsweise eine biotinylierte Bindungskomponente und mindestens eine der biotinylierten Substanzen vorzugsweise eine biotinylierte Markierungssubstanz.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Biotin-Avidin-Biotin-Komplexes, umfassend die Schritte:

(1) Behandeln eines Avidins mit einem Vernetzungsmittel, um ein vernetztes Avidin herzustellen,
(2) Biotinylieren der gleichen oder voneinander verschiedenen zu biotinylierenden Substanzen, um gleiche oder voneinander verschiedene biotinylierte Substanzen zu bilden; und
(3) Binden des vernetzten Avidins und der gleichen oder voneinander verschiedenen biotinylierten Substanzen, um den Biotin-Avidin-Biotin-Komplex zu bilden.

Weiterhin betrifft die vorliegenden Erfindung ein Analyseverfahren, wobei der vorliegende Biotin-Avidin-Biotin-Komplex verwendet wird.
Weiterhin wird hier ein Analyseverfahren beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass (1) eine biotinylierte Bindungskomponente, (2) ein vernetztes Avidin und (3) eine biotinylierte Markierungssubstanz verwendet werden.
Weiterhin wird hier ein Verfahren zum Analysieren einer zu analysierenden Verbindung beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass

(1) eine Probe, welche möglicherweise die zu analysierende Verbindung enthält, eine biotinylierte Bindungskomponente, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Verbindung zu binden, ein vernetztes Avidin und eine biotinylierte Markierungssubstanz in jeglicher Reihenfolge miteinander in Kontakt gebracht werden, um einen Komplex aus der zu analysierenden Verbindung, der biotinylierten Bindungskomponente, dem vernetzten Avidin und der biotinylierten Markierungssubstanz zu bilden; und
(2) ein Signal, das von der Markierungssubstanz im Komplex stammt, analysiert wird.

Weiterhin wird hier ein Analysekit beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass er ein vernetztes Avidin und ein biotinylierendes Mittel enthält.
Weiterhin wird hier ein Analysekit beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass er

(1) eine biotinylierte Bindungskomponente,
(2) ein vernetztes Avidin und
(3) eine biotinylierte Markierungssubstanz enthält.

Der hier verwendete Begriff „analysieren" oder „Analyse" bedeutet eine Bindungsanalyse, wobei die Eigenschaften von zwei Verbindungen, die spezifisch aneinander binden, verwendet werden, wobei eine der beiden Verbindungen einer zu analysierenden Zielverbindung entspricht und die Zielverbindung dann unter Verwendung einer „Bindungskomponente", die in der Lage ist, an die zu analysierende Zielverbindung spezifisch zu binden, analysiert wird. Als eine Kombination aus den beiden Verbindungen, die spezifisch aneinander binden, können erwähnt werden: eine Kombination aus einem Antigen und einem Antikörper, eine Kombination aus einer DNA und einer dazu komplementären DNA oder RNA, eine Kombination aus einer RNA und einer dazu komplementären DNA oder RNA, eine Kombination aus einem Rezeptor und einem Liganden dafür, wie ein Hormon, Zytokin, Neurotransmitter oder Lectin, eine Kombination aus einem Enzym und einem Ligand dafür, wie ein Substratanalog des Enzyms, ein Coenzym, ein Regulationsfaktor oder ein Inhibitor, eine Kombination aus einem Enzymanalog und einem Substrat für ein Enzym, welches ein Ursprung des Enzymanalogs ist, und eine Kombination aus einem Zucker und einem Lectin. Das Enzymanalog ist eine Verbindung mit einer hohen Affinität für ein Substrat des ursprünglichen Enzyms, das aber keine katalytische Aktivität zeigt.
1 ist eine Graphik, welche die Ergebnisse zeigt, die durch Messen von AFP gemäß einem ELISA unter Verwendung eines vernetzten Streptoavidins erhalten wurden.
2 ist ein Graphik, welche die Ergebnisse zeigt, die durch Messen von AFP gemäß einem ELISA unter Verwendung eines nicht vernetzten Streptoavidins erhalten wurden.
Der erfindungsgemäße Biotin-Avidin-Biotin-Komplex enthält zwei oder mehr biotinylierte Substanzen, welche gleich oder voneinander verschieden sind, und ein vernetztes Avidin, welches sandwichartig dazwischen vorliegt. Das vernetzte Avidin ist an jede der biotinylierten Substanzen über eine Bindung einer Biotin-Avidin-Reaktion gebunden.
Das Avidin, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist jedes Avidin, das an Biotin bindet, zum Beispiel ein Hühnereiweiß-Avidin, ein Streptoavidin, ein mittels eines Genmanipulationsverfahren hergestelltes Avidin, d.h. ein rekombinantes Avidin, oder dergleichen.
Das Avidin ist ein Protein, das aus vier gleichen Untereinheiten zusammengesetzt ist. Die Untereinheit weist eine Biotin-Bindungsstelle auf, und ein Avidinmolekül kann bis zu 4 Biotinmoleküle binden. Die Untereinheiten sind aneinander nicht über eine kovalente Bindung gebunden. Es ist bekannt, dass ein Avidin beim Erwärmen bei einer erhöhten Temperatur in die jeweilige Untereinheit gespalten wird.
Im in der vorliegenden Erfindung verwendeten vernetzten Avidin bestehen Vernetzungen mindestens zwischen Untereinheiten, d.h. intramolekulare Vernetzungen. Das vernetzte Avidin kann ein vernetztes Avidinmonomer sein, welches aus einem Avidinmolekül und einem vernetzten Avidinpolymer, welches aus mehreren Avidinmolekülen zusammengesetzt ist, zusammengesetzt ist, welche durch intermolekulare Vernetzungen aneinander gebunden sind.
Das vernetzte Avidin kann durch Behandeln von Avidin mit einem Vernetzungsmittel hergestellt werden. Das Vernetzungsmittel, das verwendet werden kann, ist zum Beispiel ein Vernetzungsmittel zum Binden von zwei Aminogruppen, wie Glutaraldehyd, Disuccinimid, Dimethylpimelimidat oder Dimethylsuberimidat, oder ein Vernetzungsmittel zum Binden einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe, zum Beispiel verschiedene Carbodiimide, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete biotinylierte Substanz wird durch Biotinylieren jeder zu biotinylierenden Substanz hergestellt. Die zu biotinylierende Substanz ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie biotinyliert werden kann und die erhaltene biotinylierte Substanz mittels der Biotin-Avidin-Reaktion an das vernetze Avidin binden wird. Die zu biotinylierende Substanz kann jede Substanz in einer Lösung sein, zum Beispiel eine Markierungssubstanz, die zum Markieren eines Antikörpers oder Antigens in einem herkömmlichen Immunoassay verwendet wird, oder eine Bindungskomponente, die biotinyliert werden kann.
Als Markierungssubstanz können zum Beispiel ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz oder ein Protein, welches eine fluoreszierende Substanz bindet, eine lumineszierende Substanz oder ein Protein, welches eine lumineszierende Substanz bindet, oder ein radioaktives Isotop erwähnt werden.
Das Enzym kann zum Beispiel Luciferase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, β-D-Galactosidase, Glucokinase, Hexokinase oder Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) sein.
Die fluoreszierende Substanz kann zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, Dansylchlorid, Fluornitrobenzofurazan, Europiumchelat oder Samariumchelat sein.
Das Protein, welches eine fluoreszierende Substanz bindet, kann zum Beispiel ein Protein sein, an das fluoreszierende Substanzen gebunden und darauf angereichert sind.
Die lumineszierende Substanz kann zum Beispiel ein Acridiniumester, Adamantyl-dioxan oder Isolumina sein; und das Protein, welches eine lumineszierende Substanz bindet, kann zum Beispiel ein Protein sein, an das lumineszierende Substanzen gebunden und darauf angereichert sind.
Das radioaktive Isotop kann zum Beispiel ³²P ³⁵S ¹²⁵I oder ³H sein.
Das biotinylierte Enzym, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist zum Beispiel ein biotinyliertes Enzym, wie Luciferase, alkalische Phosphatase, Peroxidase oder β-D-Galactosidase.
Das biotinylierte Enzym kann zum Beispiel durch ein chemisches Modifikationsverfahren oder ein Genmanipulationsverfahren hergestellt werden. Das chemische Modifikationsverfahren umfasst das chemische Binden von Biotin an eine Aminosäuregruppe eines Enzyms.
Das Genmanipulationsverfahren umfasst das Exprimieren eines verknüpften Proteins von einem Enzym und einem Biotinakzeptor in einer Wirtszelle, um ein biotinyliertes Enzym zu erhalten. Das Genmanipulationsverfahren wird für ein Enzym, wie Luciferase, das gegenüber einer chemischen Modifikation instabil ist, bevorzugt. Der Biotinakzeptor bedeutet ein Protein, das eine besondere Aminosäuresequenz enthält und zu dem Biotin in einer Wirtszelle zugegeben wird. Ein Gen, das eine Sequenz enthält, welche das Akzeptorprotein codiert, kann gemäß seiner Anwendung gewählt werden.
Wenn ein Gen, das ein Enzymgen (wie ein Luciferasegen) und ein daran ligiertes Biotinakzeptorgen enthält, in einer Wirtszelle exprimiert wird, wird ein verknüpftes Protein von einem Enzym und einem Biotinakzeptor in der Wirtszelle synthetisiert. Dann wird Biotin an das verknüpfte Protein durch die Aktion der Wirtszelle gebunden, und dadurch kann ein biotinyliertes Enzym, d.h. ein biotinyliertes verknüpftes Protein von einem Enzym und einem Biotinakzeptor, erhalten werden.
Von den biotinylierten Markierungssubstanzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können die vom biotinylierten Enzym verschiedenen Substanzen gemäß den Verfahren, die als solche bekannt sind, hergestellt werden.
Die Bindungskomponente in der biotinylierten Bindungskomponente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie biotinyliert werden kann und spezifisch an eine zu analysierende Verbindung binden kann. Als Bindungskomponente können zum Beispiel erwähnt werden (a) ein Protein, wie ein Antikörper, der ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein kann, ein Antikörperfragment [wie Fab, Fab', F(ab'₂ oder Fv], ein Proteinantigen, ein Rezeptor, ein Proteinhormon, ein Zytokin, ein Lectin, ein Enzym oder ein Enzymanalog; (b) eine Nucleinsäure, wie eine DNA oder eine RNA; oder (c) eine von einem Protein oder einer Nucleinsäure verschiedene Verbindung, wie ein Nichtprotein-Antigen, ein Nichtprotein-Hormon, ein Ligand für ein Enzym (wie ein Substratanalog für ein Enzym, ein Coenzym, ein Transkriptionsfaktor oder ein Inhibitor), ein Substrat für ein ursprüngliches Enzym eines Enzymanalogs oder ein Zucker.
Die biotinylierte Bindungskomponente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und welche die Proteinbindungskomponente (wie einen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Proteinantigen, einen Rezeptor, ein Proteinhormon, ein Zytokin, ein Lectin, ein Enzym oder ein Enzymanalog) enthält, kann durch Einführen von Biotin in die Bindungskomponente gemäß den in Verbindung mit dem biotinylierten Enzym beschriebenen Verfahren, d.h. dem chemischen Modifikationsverfahren oder dem Genmanipulationsverfahren, hergestellt werden.
Die biotinylierte Bindungskomponente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und welche die Nucleinsäurebindungskomponente (wie eine DNA oder eine RNA) enthält, kann durch Einführen von Bioton in die Bindungskomponente gemäß Verfahren, die als solche bekannt sind, hergestellt werden. Die bekannten Verfahren sind zum Beispiel ein Verfahren, wobei eine Nick-Translation oder eine Primer-Elongation unter der Bedingung durchgeführt wird, dass eines von vier Nucleotiden durch ein biotinyliertes Nucleotid, wie ein biotinyliertes dUTP oder ein biotinyliertes UTP, ersetzt wird, oder ein Verfahren, wobei eine DNA-Synthese unter der Bedingung durchgeführt wird, dass eines von vier Nucleotiden durch ein aminiertes Nucleotid, wie ein Amino-7-dUTP, ersetzt wird und die erhaltene modifizierte DNA mit einem geeigneten Biotinderivat umgesetzt wird.
Als biotinyliertes dUTP oder biotinyliertes UTP, das in der Nick-Translation oder der Primer-Elongation verwendet wird, ist zum Beispiel ein Nucleotid, enthaltend Biotin, das an das 5-Kohlenstoffatom im Pyrimidinring von dUTP oder UTP über einen Linker gebunden ist, im Handel erhältlich und kann daher verwendet werden.
Die biotinylierte Bindungskomponente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und welche die von einem Protein oder einer Nucleinsäure verschiedene Verbindung enthält, kann durch Einführen von Biotin in die Bindungskomponente gemäß den Verfahren, die als solche bekannt sind, hergestellt werden.
Eine Kombination aus den biotinylierten Substanzen im Biotin-Avidin-Biotin-Komplex der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, solange der Komplex mindestens zwei biotinylierte Substanzen, die gleich oder voneinander verschieden sein können, und ein vernetztes Avidin, welches sandwichartig dazwischen vorliegt, enthält. Die Kombination kann zum Beispiel eine Kombination aus einer biotinylierten Bindungskomponente und einer biotinylierten Markierungssubstanz, eine Kombination aus einer biotinylierten Bindungskomponente und einer gleichen oder davon verschiedenen biotinylierten Bindungskomponente, oder eine Kombination aus einer biotinylierten Markierungssubstanz und einer gleichen oder davon verschiedenen biotinylierten Markierungssubstanz sein. Die Kombination aus der biotinylierten Bindungskomponente und der biotinylierten Markierungssubstanz wird bevorzugt.
Eine bevorzugte in der vorliegenden Erfindung verwendete biotinylierte Bindungskomponente enthält ein Biotin in einem Molekül, das heißt ein Biotinmolekül pro Molekül der Bindungskomponente. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein biotinyliertes Antikörperfragment Fab' als die biotinylierte Bindungskomponente verwendet werden. Das biotinylierte Antikörperfragment Fab' kann durch kovalentes Einführen eines Biotinmoleküls in ein Antikörperfragment Fab', das aus einem Antikörper (der ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein kann), der spezifisch an eine zu analysierende Verbindung bindet, erhalten wird, hergestellt werden.
Das Antikörperfragment Fab' kann durch Verdauen eines Antikörpers mit Pepsin und Reduzieren des erhaltenen Antikörperfragments F(ab')₂ mit einem Reduktionsmittel, wie (β-Mercaptoethanol oder Mercaptoethylamin hergestellt werden. Insbesondere besteht eine S-S-Bindung, die zwei schwere Ketten in der Gelenkregion eines Antikörpermoleküls verbindet. Die Verdauung mit Pepsin erfolgt abwärts der S-S-Bindung am C-Ende, und daher verbleibt die S-S-Bindung im Bereich des C-Endes des Antikörperfragments F(ab')₂. Wenn die S-S-Bindung mit dem Reduktionsmittel reduziert wird, werden zwei Moleküle eines Antikörperfragments Fab' aus einem Molekül des Antikörperfragments F(ab')₂ gebildet. Das erhaltene Antikörperfragment Fab' enthält eine SH-Gruppe im Bereich des C-Endes.
Das biotinylierte Antikörperfragment Fab' mit einem Biotinmolekül pro Molekül des Antikörperfragments Fab' kann durch Umsetzen des erhaltenen Antikörperfragments Fab', das eine SH-Gruppe enthält, mit einem Biotinderivat, das eine Maleimidgruppe enthält, hergestellt werden.
Das biotinylierte Antigen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist vorzugsweise ein Produkt, das durch kovalentes Einführen eines Biotinmoleküls in ein Antigen hergestellt wird. Das biotinylierte Antigen kann gemäß den in Verbindung mit dem biotinylierten Enzym beschriebenen Verfahren, das heißt, dem chemischen Modifikationsverfahren oder dem Genmanipulationsverfahren, hergestellt werden.
Der erfindungsgemäße Biotin-Avidin-Biotin-Komplex kann zum Beispiel gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, ist aber keineswegs darauf beschränkt. Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden das vernetzte Avidin und die gleichen oder voneinander verschiedenen biotinylierten Produkte vorher getrennt hergestellt und werden dann gleichzeitig oder nacheinander gekoppelt, um den erfindungsgemäßen Biotin-Avidin-Biotin-Komplex zu bilden.
Der erfindungsgemäße Biotin-Avidin-Biotin-Komplex kann zum Beispiel im Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung kann ein geeignetes biotinyliertes Produkt, insbesondere eine biotinylierte Bindungskomponente, gemäß einer zu analysierenden Verbindung gewählt werden. Wenn zum Beispiel ein Antigen eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinylierter Antikörper oder ein biotinyliertes Antikörperfragment, hergestellt durch Einführen von Biotin in einen Antikörper oder ein Antikörperfragment der/das mit dem Antigen spezifisch reagiert, verwendet werden. Wenn ein Antikörper eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinyliertes Antigen, hergestellt durch Einführen von Biotin in ein Antigen, das vom Antikörper erkannt wird, verwendet werden. Wenn eine DNA oder RNA eine zu analysierende Verbindung ist, kann eine biotinylierte DNA oder eine biotinylierte RNA, hergestellt durch Einführen von Biotin in eine zur zu analysierenden DNA oder RNA komplementäre DNA oder RNA, verwendet werden. Wenn ein Rezeptor eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinylierter Ligand, hergestellt durch Einführen von Biotin in einen Liganden eines Rezeptors, verwendet werden. Wenn ein Ligand eines Rezeptors eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinylierter Rezeptor, hergestellt durch Einführen von Biotin in einen Rezeptor für den Ligand, hergestellt werden. Wenn ein Enzym eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinylierter Ligand, hergestellt durch Einführen von Biotin in einen Liganden für das Enzym, verwendet werden. Wenn ein Ligand eines Enzyms eine zu analysierende Verbindung ist, kann ein biotinyliertes Enzym, hergestellt durch Einführen von Biotin in das Enzym, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung, d.h. das Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung und der Analysekit, in dem der vorliegende Biotin-Avidin-Biotin-Komplex verwendet werden kann, wird nachstehend weiterhin hauptsächlich hinsichtlich der Ausführungsformen, in denen das biotinylierte Antikörperfragment Fab' als die biotinylierte Bindungskomponente und das biotinylierte Enzym als die biotinylierte Markierungssubstanz verwendet werden, beschrieben.
Zum Beispiel kann der mit Enzym markierte Antikörper durch Mischen (1) des biotinylierten Antikörperfragments Fab', (2) des vernetzten Avidins und (3) des biotinylierten Enzyms, die jeweils vorher gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wobei eine Enzymaktivität und eine Antikörperaktivität aufrechterhalten wurden, in einem angemessenen Verhältnis erhalten werden.
Weiterhin können (1) das biotinylierte Antikörperfragment Fab', (2) das vernetzte Avidin und (3) das biotinylierte Enzym getrennt verwendet werden. Zum Beispiel werden nach der Umsetzung des Trägers mit immobilisiertem Antikörper und einer zu analysierenden Verbindung (eines Antigens)

(a) die vorstehend erwähnten drei Reagenzien (1) bis (3) in der vorstehenden aufeinanderfolgenden Reihenfolge zugegeben, um die Umsetzungen in drei Schritten durchzuführen,
(b) ein Gemisch, das vorher aus dem biotinylierten Antikörperfragment Fab' und dem vernetzten Avidin hergestellt wurde, damit umgesetzt, und dann das biotinylierte Enzym umgesetzt, um dadurch die Umsetzungen in zwei Schritten durchzuführen, oder
(c) das biotinylierte Antikörperfragment Fab' umgesetzt, und dann ein vorher aus dem vernetzten Avidin und dem biotinylierten Enzym hergestelltes Gemisch umgesetzt, um dadurch die Umsetzungen in zwei Schritten durchzuführen.

Die Art der Verwendung der vorstehenden drei Reagenzien, d.h. ob die Reagenzien verwendet werden, nachdem vorher das Gemisch daraus hergestellt wurde, oder ob sie getrennt verwendet werden, kann gemäß einem verwendeten Messverfahren angemessen gewählt werden.
Das erfindungsgemäße Analyseverfahren kann ohne jegliche Modifikation auf ein herkömmliches Immunoassay, wie ein Sandwichverfahren oder ein kompetitives Verfahren, angewendet werden, mit der Ausnahme, dass (1) das biotinylierte Antikörperfragment Fab', (2) das vernetzte Avidin und (3) das biotinylierte Enzym verwendet werden.
Zum Beispiel wird gemäß dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren, wobei der mit Enzym markierte Antikörper, hergestellt durch Mischen (1) des biotinylierten Antikörperfragments Fab', (2) des vernetzten Avidins und (3) des biotinylierten Enzyms in einem angemessenen Verhältnis, im Sandwichverfahren verwendet wird, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment (ein erster Antikörper), der/das mit einer zu analysierenden Verbindung an einem Epitop, das von dem durch das biotinylierte Antikörperfragment Fab' erkannte verschieden ist, reagiert, an einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert. Dann wird eine Oberfläche des unlöslichen Trägers mit einer geeigneten blockierenden Substanz, wie Rinderserumalbumin (RSA) oder Gelatine, beschichtet, um eine nicht spezifische Bindung zwischen dem unlöslichen Träger und einer Probe zu verhindern. Danach wird die Probe dazu zugegeben und mit dem ersten Antikörper eine vorgegebene Zeitspanne, zum Beispiel 5 Minuten bis 3 Stunden, bei einer vorgegebenen Temperatur, zum Beispiel bei 4°C bis 40°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur, in Kontakt gebracht, wobei eine Umsetzung (eine erste Umsetzung) erfolgt. Dann wird das Gemisch aus diesen drei Reagenzien, d.h. der mit Enzym markierte Antikörper, dazu zugegeben und mit dem Reaktionsgemisch eine vorgegebene Zeitspanne, zum Beispiel 5 Minuten bis 3 Stunden, bei einer vorgegebenen Temperatur, zum Beispiel bei 4°C bis 40°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur, in Kontakt gebracht, wobei eine Umsetzung (eine zweite Umsetzung) erfolgt. Das Ganze wird mit einem geeigneten Detergens, wie einer physiologischen Kochsalzlösung, die ein oberflächenaktives Mittel enthält, gewaschen, und dann wird die Menge der auf dem unlöslichen Träger vorhandenen mit Enzym markierten Antikörper quantitativ bestimmt. Die Menge der zu analysierenden Verbindung in der Probe kann aus den erhaltenen Bestimmungen berechnet werden.
Im erfindungsgemäßen Analyseverfahren können die drei Reagenzien getrennt zugegeben werden, um die Umsetzungen wie vorstehend in zwei oder drei Schritten durchzuführen, anstatt durch Zugabe des Gemisches der drei Reagenzien, d.h. des mit Enzym markierten Antikörpers, die Umsetzungen in einem Schritt durchzuführen.
Die Untereinheiten in dem im erfindungsgemäßen Analyseverfahren verwendeten vernetzten Avidin sind kovalent aneinander gebunden. Daher können bei der Herstellung des mit Enzym markierten Antikörpers durch Mischen (1) des biotinylierten Antikörperfragments Fab', (2) des vernetzten Avidins und (3) des biotinylierten Enzyms in einem angemessenen Verhältnis, die Enzymaktivität und die Antikörperaktivität stabil aufrechterhalten werden. Im Gegensatz dazu wird die Reaktivität des herkömmlichen mit Enzym markierten Antikörpers, der ein nicht vernetztes Avidin enthält, d.h. ein Komplex aus biotinyliertem Antikörper, Avidin und biotinyliertem Enzym, als mit Enzym markierter Antikörper stark verringert. Als Grund dafür wird angenommen, dass wenn zwei Biotinmoleküle (ein biotinylierter Antikörper und ein biotinyliertes Enzym) an ein Avidinmolekül binden, auf das Avidin eine starke Spannung wirkt, wie im Fall, in dem große Hitze angewendet wird, und daher die Untereinheiten voneinander getrennt werden.
Weiterhin, wenn das biotinylierte Antikörperfragment Fab', welches ein Biotinmolekül in einem seiner Moleküle enthält, zusammen mit dem biotinylierten Enzym verwendet wird, können die Enzymaktivität und die Antikörperaktivität stabiler aufrechterhalten werden. Als Grund dafür wird angenommen, dass wenn ein Antikörperfragment Fab', ein Antigen oder ein Enzym mehrere Biotinmoleküle enthält, koppelnde Kettenreaktionen über Avidine fortschreiten, Makromoleküle der mit Enzym markierten Antikörper gebildet werden und unerwünschte Reaktionen, wie eine Fällung auftreten.
Der hier beschriebene Analysekit enthält das vernetzte Avidin und das biotinylierende Mittel. Das biotinylierende Mittel, das verwendet werden kann, ist ein herkömmliches biotinylierendes Mittel, wie N-Biotinoyl-N'-(6-maleimidhexanoyl)-hydrazid oder N-Hydroxysuccinimidbiotinoyl-ε-aminocaproat. Ein biotinyliertes Antikörperfragment Fab' und ein biotinyliertes Enzym, welche durch Biotinylieren eines Antikörperfragments Fab' und eines Enzyms mit einem biotinylierenden Mittel hergestellt und getrennt vom Analysekit bereitgestellt werden, können in Kombination mit dem vernetzten Avidin als eine Komponente des Analysekits verwendet werden.
Zusätzlich zum vernetzten Avidin und zum biotinylierenden Mittel kann der Analysekit weiterhin die biotinylierte Markierungssubstanz, wie ein biotinyliertes Enzym, enthalten. Der Analysekit kann das vernetzte Avidin, die biotinylierte Markierungssubstanz beziehungsweise das biotinylierende Mittel als ein getrenntes Reagenz enthalten. In einer anderen Ausführungsform kann der Kit diese in Form eines Gemisches aus dem vernetzten Avidin und der biotinylierten Markierungssubstanz und in Form einer einzelnen Komponente des biotinylierenden Mittels enthalten.
Der Analysekit kann anstelle des biotinylierenden Mittels das biotinylierte Antikörperfragment Fab' und die biotinylierte Markierungssubstanz, wie das biotinylierte Enzym, als Komponenten enthalten. Insbesondere enthält der Analysekit in einer anderen Ausführungsform (1) das biotinylierte Antikörperfragment Fab', (2) das vernetzte Avidin und (3) die biotinylierte Markierungssubstanz. Der Analysekit kann (1) das biotinylierte Antikörperfragment Fab', (2) das vernetzte Avidin und (3) die biotinylierte Markierungssubstanz als getrennte Komponenten oder als ein Gemisch aus zwei oder mehr Komponenten enthalten. Beispiele für den Analysekit, der das Gemisch enthält, sind ein Analysekit, der ein Gemisch aus dem biotinylierten Antikörperfragment Fab', dem vernetzten Avidin und der biotinylierten Markierungssubstanz enthält; ein Analysekit, der ein Gemisch aus dem biotinylierten Antikörperfragment Fab' und dem vernetzten Avidin und eine einzelne Komponente der biotinylierten Markierungssubstanz enthält; und ein Analysekit, der eine einzelne Komponente des biotinylierten Antikörperfragments Fab' und ein Gemisch aus dem vernetzten Avidin und der biotinylierten Markierungssubstanz enthält.
Der Analysekit kann im Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung einzeln oder gegebenenfalls als eine Kombination aus anderen Reagenzien verwendet werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung hauptsächlich bezüglich der Ausführungsform beschrieben wird, in der das biotinylierte Antikörperfragment Fab' als die biotinylierte Bindungskomponente verwendet wird, und das biotinylierte Enzym als die biotinylierte Markierungssubstanz verwendet wird, kann ein biotinyliertes Antigen anstelle des biotinylierten Antikörperfragments Fab' verwendet werden, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der das biotinylierte Enzym als die biotinylierte Markierungssubstanz verwendet wird, wird nachstehend beschrieben.
Zum Beispiel kann im Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung, wobei das mit Enzym markierte Antigen, das hergestellt wird durch Mischen (1) des biotinylierten Antigens, (2) des vernetzten Avidins und (3) des biotinylierten Enzyms in einem angemessenen Verhältnis, verwendet wird, ein Antigen immunologisch, zum Beispiel mittels eines kompetitiven Verfahrens, analysiert werden. Insbesondere wird ein Antikörper oder ein Antikörperfragment (ein erster Antikörper), der mit einer zu analysierenden Verbindung reagiert, an einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert. Dann wird eine Oberfläche des unlöslichen Trägers mit einer geeigneten blockierenden Substanz, wie Rinderserumalbumin (RSA) oder Gelatine, beschichtet, um eine nicht spezifische Bindung zwischen dem unlöslichen Träger und einer Probe zu verhindern. Danach werden die Probe und das mit Enzym markierte Antigen, welches das Gemisch aus den drei Reagenzien ist, zum unlöslichen Träger zugegeben und eine vorgegebene Zeitspanne, zum Beispiel 5 Minuten bis 3 Stunden, bei einer vorgegebenen Temperatur, zum Beispiel bei 4°C bis 40°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur, mit diesem in Kontakt gebracht, wobei eine Umsetzung erfolgt. Danach wird das Ganze mit einem geeigneten Detergens, wie eine physiologischen Kochsalzlösung, die ein oberflächenaktives Mittel enthält, gewaschen, und die Menge der auf dem unlöslichen Träger vorhandenen mit Enzym markierten Antigene quantitativ bestimmt. Die Menge der zu analysierenden Verbindung in der Probe kann aus den erhaltenen Bestimmungen berechnet werden.
Im erfindungsgemäßen Analyseverfahren können die drei Reagenzien getrennt zugegeben werden, um die Umsetzungen wie vorstehend in zwei oder drei Schritten durchzuführen, anstatt durch Zugabe des Gemisches der drei Reagenzien, d.h. des mit Enzym markierten Antigens, die Umsetzungen in einem Schritt durchzuführen.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung anstelle unter Verwendung des biotinylierten Antikörperfragments Fab' oder des biotinylierten Antigens unter Verwendung anderer biotinylierter Bindungskomponenten ausgeführt werden, wie eines biotinylierten Antikörpers, eines biotinylierten Antikörperfragments, einer biotinylierten DNA, einer biotinylierten RNA, eines biotinylierten Rezeptors, eines biotinylierten Enzyms, eines biotinylierten Liganden (einschließlich eines Liganden für einen Rezeptor und eines Liganden für ein Enzym), eines biotinylierten Enzymanalogs, eines biotinylierten Produktes, hergestellt durch Einführen von Biotin in eine Substanz eines ursprünglichen Enzyms eines Enzymanalogs, eines biotinylierten Lectins oder eines biotinylierten Zuckers.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung anstelle unter Verwendung des biotinylierten Enzyms unter Verwendung anderer biotinylierter Markierungssubstanzen ausgeführt werden, wie einer biotinylierten fluoreszierenden Substanz oder eines Proteins, welches eine biotinylierte fluoreszierende Substanz bindet, einer biotinylierten lumineszierenden Substanz oder eines Proteins, welches eine biotinylierte lumineszierende Substanz bindet, oder eines biotinylierten radioaktiven Isotops.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiel weiter veranschaulicht, ist aber keinesfalls auf diese beschränkt.
Beispiel 1
(1) Herstellung eines biotinylierten Antikörperfragments Fab'
Aus einem Antiserum, erhalten von einem mit humanem α-Fetoprotein (AFP) immunisierten Hasen, wurde eine spezifische Antikörper IgG-Fraktion mittels Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung einer AFP-immobilisierten Sepharose 4B erhalten.
Zu der spezifischen Antikörper IgG-Fraktion [0,1 mol/l Acetatpuffer (pH 4,5)] wurden 2 Gew.-% Pepsin zugegeben. Die Verdauung wurde in einem Inkubator über Nacht bei 37°C durchgeführt, wobei eine Fraktion Antikörperfragment F(ab')₂ mit einem Molekulargewicht von 100.000 mittels Gelchromatographie erhalten wurde. Die F(ab')₂-Fraktion wurde gegen einen 50 mmol/l Acetatpuffer (pH 5,0) dialysiert. Zu 5 mg (1 ml) der dialysierten F(ab')₂-Fraktion wurden 50 μl eines 0,25 mol/l 2-Mercaptoethylamins [50 mmol/l Acetatpuffer (pH 5,0)] zugegeben. Die Reduktion wurde bei 37°C 90 Minuten durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25 Säule (1,5 × 13 cm), die mit einem 50 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), der 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, equilibriert worden war, aufgetragen, und dann wurde die in einem Ausschlussvolumen eluierte Fraktion des Antikörperfragments Fab' vereinigt.
Zur Fraktion des Antikörperfragments Fab' wurden 0,4 mg N-Biotinoyl-N'-(6-maleimidhexanoyl)-hydrazin, gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid, zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann auf eine Sephadex G-25 Säule (1,5 × 13 cm), die mit einer physiologischen Kochsalzlösung equilibriert worden war, aufgetragen. In einem Ausschlussvolumen eluiertes Antikörperfragment Fab' wurde vereinigt.
(2) Herstellung eines vernetzten Streptoavidins
Zu 1 mg gereinigtem Streptoavidin, gelöst in 1 ml 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), wurden 20 μl einer 1 %-igen Glutaraldehydlösung [0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0)] zugegeben. Das Ganze wurde gemischt und bei 4°C 16 Stunden stehengelassen. Zum Reaktionsgemisch wurden 20 μl einer 4 mg/ml Natriumborhydrid-Lösung, hergestellt mit einem 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden stehengelassen, um den Aldehyd zu reduzieren. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25 Säule (1,5 × 15 cm), die mit einer 0,3 mol/l NaCl-Lösung equilibriert worden war, aufgetragen. In einem Ausschlussvolumen eluiertes vernetztes Streptoavidin wurde vereinigt.
(3) Beschichten mit einem monoklonalen Anti-AFP-Antikörper
In jede Vertiefung einer weißen 96-Well-Platte wurden 100 μl eines monoklonalen Anti-AFP-Antikörpers (Oriental Yeast Co., Ltd.), eingestellt auf 5 μg/ml mit einem 50 mmol/l Carbonatpuffer (pH 9,5), gegeben. Das Beschichten wurde unter Schütteln bei 37°C 2 Stunden durchgeführt, und dann wurden die Vertiefungen mit einer Waschlösung [20 mmol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 0,1% Tween 20 enthaltend] gewaschen. Die Platte wurde im folgenden Arbeitsgang verwendet.
(4) Herstellen eines mit Enzym markierten Antikörpers
Das in Beispiel 1 (1) hergestellte biotinylierte Antikörperfragment Fab' (endgültige Konzentration = 0,1 μg/ml), das in Beispiel 1 (2) hergestellte vernetzte Streptoavidin (endgültige Konzentration = 1,2 μg/ml) und ein kondensiertes Protein biotinylierter Luciferase und eines Biotinakzeptors (Kikkoman Cor.) (endgültige Konzentration = 0,07 μg/ml) wurden in einem 5% Glycerol, 1% Rinderserumalbumin (RSA) und 1mmol/l EDTA enthaltenden, 50 mmol/l HEPES-Puffer (pH 7,5) gemischt, und das Ganze wurde 2 Stunden bei Raumtemaperatur stehen gelassen. Das erhaltene Gemisch wurde im folgenden Arbeitsgang als mit Enzym markierter Antikörper verwendet.
(5) Messung von AFP mittels eines ELISA-Verfahrens
In jede mit den Antikörpern beschichtete Vertiefung wurden 100 μl AFP-Standardlösungen, die mit einem Reaktionspuffer (die vorstehende erwähnte 0,15 mol/l NaCl enthaltende Waschlösung) auf vorgegebene Konzentrationen (1 pg/ml, 10 pg/ml und 100 pg/ml) verdünnt waren, gegeben, und die Umsetzung wurde dann unter Schütteln bei 37°C 1 Stunde durchgeführt. Nach viermaligem Waschen der Vertiefung mit der Waschlösung wurden in jede Vertiefung 100 μl des in Beispiel 1 (4) hergestellten mit Enzym markierten Antikörpers gegeben, und die Umsetzung wurde dann unter Schütteln bei 37°C 1 Stunde durchgeführt. Nach viermaligem Waschen der Vertiefung mit der Waschlösung wurde die Platte in einen Emissionsdetektor gegeben. Als Substanz wurden 100 μl eines 0,2 mg/ml Luciferin, 40 mmol/l ATP und 150 mmol/l MgSO₄ enthaltenden, 50 mmol/l HEPES-Puffers (pH 7,5) zugegeben, und dann wurde die jeweilige kumulative Menge der Lumineszenz 10 Sekunden gemessen.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Wie aus 1 ersichtlich ist, wurde eine Anzeige der Lumineszenzmenge erhalten, wenn die AFP- Konzentration sehr niedrig war.
Wie vorstehend beschrieben wurde festgestellt, dass das biotinylierte Antikörperfragment Fab' unter Verwendung von mit einem Vernetzungsmittel behandelten Streptoavidin stabil an das biotinylierte Enzym gebunden werden kann
Vergleichsbeispiel 1
Als Vergleichsbeispiel wurde der in Beispiel 1 (4) und Beispiel 1 (5) beschriebene Arbeitsgang wiederholt, mit der Ausnahme, dass Streptoavidin ohne eine Vernetzungsbehandlung anstelle des in Beispiel 1 (2) hergestellten vernetzten Streptoavidins verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in 2 angegeben. Wie aus 2 ersichtlich ist, wurde eine geringe Anzeige der Lumineszenz in Abhängigkeit der AFP-Menge erhalten. Es wurde festgestellt, dass das biotinylierte Antikörperfragment Fab' nicht an das biotinylierte Enzym gebunden werden konnte, wenn das nicht vernetzte Streptoavidin verwendet wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine zu analysierende Verbindung schnell, einfach und genau analysiert werden, indem die Avidin-Biotin-Reaktion genutzt wird.

Claims

Biotin-Avidin-Biotin-Komplex, umfassend mindestens zwei biotinylierte Substanzen, welche gleich oder voneinander verschieden sind, und ein vernetztes Avidin, welches sandwichartig dazwischen vorliegt, wobei das vernetzte Avidin ein vernetztes Avidinmonomer ist, welches aus einem Avidinmolekül oder einem vernetzten Avidinpolymer, welches aus mehreren Avidinmolekülen zusammengesetzt ist, zusammengesetzt ist, welche durch intermolekulare Vernetzungen aneinander gebunden sind.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 1, wobei mindestens eine der biotinylierten Substanzen eine biotinylierte Bindungskomponente ist und mindestens eine der biotinylierten Substanzen eine biotinylierte Markierungssubstanz ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 2, wobei die Bindungskomponente ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Antigen, eine DNS, eine RNS, ein Rezeptor, ein Ligand für einen Rezeptor, ein Enzym, ein Ligand für ein Enzym, ein Enzymanalog, ein Substrat für ein Enzym, welches ein Ursprung eines Enzymanalogs ist, ein Lectin oder ein Zucker ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 3, wobei das Antikörperfragment Fab' ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die biotinylierte Markierungssubstanz ein biotinyliertes Enzym, eine biotinylierte fluoreszierende Substanz oder ein Protein, welches an eine biotinylierte fluoreszierende Substanz gebunden ist, eine biotinylierte lumineszierende Substanz oder ein Protein, welches an eine biotinylierte lumineszierende Substanz gebunden ist, oder ein biotinyliertes radioaktives Isotop ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das biotinylierte Enzym ein biotinyliertes kondensiertes Protein eines Enzyms und eines Biotinakzeptors ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das biotinylierte Enzym eine biotinylierte Luciferase ist.
Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das vernetzte Avidin ein vernetztes Hühnereiweiß-Avidin, ein vernetztes Streptoavidin oder ein vernetztes rekombinantes Avidin ist.
Verfahren zur Herstellung des Biotin-Avidin-Biotin-Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die Schritte: (1) Behandeln eines Avidins mit einem Vernetzungsmittel, um ein vernetztes Avidin herzustellen, (2) Biotinylieren der gleichen oder voneinander verschiedenen zu biotinylierenden Substanzen, um gleiche oder voneinander verschiedene biotinylierte Substanzen zu bilden; und (3) Binden des vernetzten Avidins und der gleichen oder voneinander verschiedenen biotinylierten Substanzen, um den Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß Anspruch 1 zu bilden.
Analyseverfahren, wobei der Biotin-Avidin-Biotin-Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 verwendet wird.