JPH08233817A - 正規化方法 - Google Patents
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- JPH08233817A JPH08233817A JP7330692A JP33069295A JPH08233817A JP H08233817 A JPH08233817 A JP H08233817A JP 7330692 A JP7330692 A JP 7330692A JP 33069295 A JP33069295 A JP 33069295A JP H08233817 A JPH08233817 A JP H08233817A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生物学的サンプル中の被検物質のアッセイに
おいて，液体のサンプルおよび／または試薬の添加に際
してのピペット操作が原因となる不正確さを最小限にし
て被検物質の定量の正確さを改良する． 【解決手段】 アッセイ試薬の少なくとも１種に内部指
示薬を添加し，内部指示薬によって発生するシグナルを
読み取り，これとアッセイ試薬によって生じるシグナル
の比に基づいてアッセイシグナルを正規化する．
おいて，液体のサンプルおよび／または試薬の添加に際
してのピペット操作が原因となる不正確さを最小限にし
て被検物質の定量の正確さを改良する． 【解決手段】 アッセイ試薬の少なくとも１種に内部指
示薬を添加し，内部指示薬によって発生するシグナルを
読み取り，これとアッセイ試薬によって生じるシグナル
の比に基づいてアッセイシグナルを正規化する．
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，分析アッセイのシ
グナルを正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ）する方法に
関する．さらに詳しくは本発明は試薬系に内部指示薬を
導入して測定の精度を改良することからなる分析アッセ
イのアッセイシグナルを正規化する方法に関する．
グナルを正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ）する方法に
関する．さらに詳しくは本発明は試薬系に内部指示薬を
導入して測定の精度を改良することからなる分析アッセ
イのアッセイシグナルを正規化する方法に関する．
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】生物学的液体中の被検
物質の定量には，多くの方法が本技術分野において知ら
れている．これらは一般的に，被検物質と各種試薬の相
互作用によって試薬系の特性に検知可能な変化を起こさ
せるものである．たとえば，被検物質と試薬の間の相互
作用は，その系に，肉眼的検出もしくは評価または分光
光学的な読み取りが可能な色の変化を起こさせることが
できる．さらに，標識された生物学的種の相互作用によ
って発生する蛍光シグナルの検出には分光蛍光法を使用
することができる．これらの方法はすべて，診断装置に
おける手操作または自動化操作による生物学的サンプル
の試薬への添加を包含する．いずれの場合も，生物学的
液体は，一般的，に液体の形態または溶液としてピペッ
ト操作によって試薬系に添加される．被検物質の測定す
なわち生物学的液体中の被検物質の定量には，既知の特
定容量および／または濃度の液体サンプルおよび試薬を
使用しなければならない．一方，最近の手操作添加用の
ピペットおよび自動添加用のピペット装置は，一般に，
極めて少量の場合でも，サンプルおよび試薬の正確な量
を提供するが，重大な不正確さを生じる可能性がある．
不正確さはオペレーターによるピペットの誤使用または
装置の故障によって起こる可能性がある．手操作でのピ
ペットによる採取ではたとえば，不正確さは欠陥のある
ピペットまたは目盛り誤ったピペットの使用から生じる
ことがある．自動操作でのピペットによる採取では，不
正確さは欠陥のある装置の使用のみでなく，液体サンプ
ルまたは試薬の正しい量の以後の添加および混合のため
のピペットからの排出の失敗によっても起こることがあ
る．液体サンプルまたは試薬中の空気の気泡はアッセイ
におけるピペット操作の不正確さの原因になる．
物質の定量には，多くの方法が本技術分野において知ら
れている．これらは一般的に，被検物質と各種試薬の相
互作用によって試薬系の特性に検知可能な変化を起こさ
せるものである．たとえば，被検物質と試薬の間の相互
作用は，その系に，肉眼的検出もしくは評価または分光
光学的な読み取りが可能な色の変化を起こさせることが
できる．さらに，標識された生物学的種の相互作用によ
って発生する蛍光シグナルの検出には分光蛍光法を使用
することができる．これらの方法はすべて，診断装置に
おける手操作または自動化操作による生物学的サンプル
の試薬への添加を包含する．いずれの場合も，生物学的
液体は，一般的，に液体の形態または溶液としてピペッ
ト操作によって試薬系に添加される．被検物質の測定す
なわち生物学的液体中の被検物質の定量には，既知の特
定容量および／または濃度の液体サンプルおよび試薬を
使用しなければならない．一方，最近の手操作添加用の
ピペットおよび自動添加用のピペット装置は，一般に，
極めて少量の場合でも，サンプルおよび試薬の正確な量
を提供するが，重大な不正確さを生じる可能性がある．
不正確さはオペレーターによるピペットの誤使用または
装置の故障によって起こる可能性がある．手操作でのピ
ペットによる採取ではたとえば，不正確さは欠陥のある
ピペットまたは目盛り誤ったピペットの使用から生じる
ことがある．自動操作でのピペットによる採取では，不
正確さは欠陥のある装置の使用のみでなく，液体サンプ
ルまたは試薬の正しい量の以後の添加および混合のため
のピペットからの排出の失敗によっても起こることがあ
る．液体サンプルまたは試薬中の空気の気泡はアッセイ
におけるピペット操作の不正確さの原因になる．
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは，試薬系に
内部指示薬を導入することによって，生物学的サンプル
中の被検物質の定量の精度に対する液体サンプルおよび
／または試薬の容量および／または濃度の変動の影響が
最小限になり，その結果，関心被検物質のさらに正確な
評価が可能になることを見出した．診断アッセイにおけ
る内部指示薬として有効であるためには，その物質は試
薬系の成分およびサンプルと相互作用してはならない
し，また活性な試薬およびサンプルと同じ添加（ピペッ
トによる）および混合工程に付されなければならない．
これらの条件下には，ピペット操作の不正確さから生じ
る指示薬のシグナルにおける変動が，被検物質濃度にお
ける変動を反映し，その正規化によるアッセイシグナル
の補正を可能にする．
内部指示薬を導入することによって，生物学的サンプル
中の被検物質の定量の精度に対する液体サンプルおよび
／または試薬の容量および／または濃度の変動の影響が
最小限になり，その結果，関心被検物質のさらに正確な
評価が可能になることを見出した．診断アッセイにおけ
る内部指示薬として有効であるためには，その物質は試
薬系の成分およびサンプルと相互作用してはならない
し，また活性な試薬およびサンプルと同じ添加（ピペッ
トによる）および混合工程に付されなければならない．
これらの条件下には，ピペット操作の不正確さから生じ
る指示薬のシグナルにおける変動が，被検物質濃度にお
ける変動を反映し，その正規化によるアッセイシグナル
の補正を可能にする．
【０００４】
【発明の実施の形態】蛍光内部指示薬としては，クマリ
ン類たとえばはウンベリフェロン，およびキサンテン類
たとえばＮ−［９−（２−カルボキシフェニル) −６−
ジエチルアミノ) −３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］
−Ｎ−エチルエタナミニウムクロリド（ローダミン
Ｂ），ビス−（３−スルホプロピル）ローダミンカルボ
ン酸，またはビス−（３−スルホプロピル）ローダミン
ピペラジンアミドを挙げることができる．
ン類たとえばはウンベリフェロン，およびキサンテン類
たとえばＮ−［９−（２−カルボキシフェニル) −６−
ジエチルアミノ) −３Ｈ−キサンテン−３−イリデン］
−Ｎ−エチルエタナミニウムクロリド（ローダミン
Ｂ），ビス−（３−スルホプロピル）ローダミンカルボ
ン酸，またはビス−（３−スルホプロピル）ローダミン
ピペラジンアミドを挙げることができる．
【０００５】本発明は，多様なアッセイに適用できるも
のであるが，生物学的サンプル中の被検物質の濃度を，
定量すべき被検物質に特異的な抗体を包含する免疫原性
技術によって測定する分析試験に適している．たとえば
競合アッセイおよび酵素イムノアッセイを含むこれらの
アッセイには，液体サンプルおよび試薬のピペットによ
る添加および混合工程が包含され，ピペットによる添加
および混合工程での変動が最終的なアッセイシグナルの
不正確さに寄与することになる．興味がもたれるのは競
合診断アッセイである．低分子量被検物質についてのこ
のアッセイにおいては，被検物質および標識被検物質類
縁体が抗体の結合部位で競合するか，または標識抗体と
固定化被検物質類縁体が被検物質と結合部位で競合す
る．いずれの場合も最終的な被検物質シグナル，すなわ
ち被検物質の定量は，サンプルおよび試薬の液体容量お
よび濃度の変動に敏感である．これらのパラメーターの
変動は最終シグナル値では拡大され，したがってこれら
の定量においては，内部指示薬の使用がとくに有益であ
る．
のであるが，生物学的サンプル中の被検物質の濃度を，
定量すべき被検物質に特異的な抗体を包含する免疫原性
技術によって測定する分析試験に適している．たとえば
競合アッセイおよび酵素イムノアッセイを含むこれらの
アッセイには，液体サンプルおよび試薬のピペットによ
る添加および混合工程が包含され，ピペットによる添加
および混合工程での変動が最終的なアッセイシグナルの
不正確さに寄与することになる．興味がもたれるのは競
合診断アッセイである．低分子量被検物質についてのこ
のアッセイにおいては，被検物質および標識被検物質類
縁体が抗体の結合部位で競合するか，または標識抗体と
固定化被検物質類縁体が被検物質と結合部位で競合す
る．いずれの場合も最終的な被検物質シグナル，すなわ
ち被検物質の定量は，サンプルおよび試薬の液体容量お
よび濃度の変動に敏感である．これらのパラメーターの
変動は最終シグナル値では拡大され，したがってこれら
の定量においては，内部指示薬の使用がとくに有益であ
る．
【０００６】実際には，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ
によって製造され市販されているＯＰＵＳ［登録商標；
装置の説明，試験モジュール，およびその操作様式の考
察については，Ｃ．Ｏｌｉｖｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１４，
１２６（１９９１) 参照］のような自動化装置で実施さ
れたエストラジオールの蛍光イムノアッセイについて例
示されるように，アッセイは，ウエル中にエストラジオ
ールに対するウサギポリクローナル抗体，エストラジオ
ール−アルカリホスファターゼ接合体，および4 −メチ
ルウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質を別個に含
有するホイルでシールした３個のウエルを有し，ヤギ−
抗−ウサギＩｇＧ抗体が固定化されたＷｈａｔｍａｎガ
ラス線維マトリックスが導入された試験モジュールで実
施される．操作に際してはピペット操作および混合工程
により，蛍光指示薬，ビス−（３−スルホプロピル)ロ
ーダミンカルボン酸が，エストラジオール−アルカリホ
スファターゼ接合体と接合体指示薬溶液およびエストラ
ジオールに対する抗体に添加される．45分間インキュベ
ートしたのち，アッセイ混合物をガラス線維マトリック
ス上に分散し，指示薬の蛍光を測定する．アッセイ混合
物はウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄し
て非結合接合体を除去する．結合した接合体−蛍光原基
質の蛍光をモニターして，観察されたアッセイシグナル
とローダミンシグナルの比に定数を乗じて正規化された
アッセイシグナルを計算する．
ｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ
によって製造され市販されているＯＰＵＳ［登録商標；
装置の説明，試験モジュール，およびその操作様式の考
察については，Ｃ．Ｏｌｉｖｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１４，
１２６（１９９１) 参照］のような自動化装置で実施さ
れたエストラジオールの蛍光イムノアッセイについて例
示されるように，アッセイは，ウエル中にエストラジオ
ールに対するウサギポリクローナル抗体，エストラジオ
ール−アルカリホスファターゼ接合体，および4 −メチ
ルウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質を別個に含
有するホイルでシールした３個のウエルを有し，ヤギ−
抗−ウサギＩｇＧ抗体が固定化されたＷｈａｔｍａｎガ
ラス線維マトリックスが導入された試験モジュールで実
施される．操作に際してはピペット操作および混合工程
により，蛍光指示薬，ビス−（３−スルホプロピル)ロ
ーダミンカルボン酸が，エストラジオール−アルカリホ
スファターゼ接合体と接合体指示薬溶液およびエストラ
ジオールに対する抗体に添加される．45分間インキュベ
ートしたのち，アッセイ混合物をガラス線維マトリック
ス上に分散し，指示薬の蛍光を測定する．アッセイ混合
物はウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄し
て非結合接合体を除去する．結合した接合体−蛍光原基
質の蛍光をモニターして，観察されたアッセイシグナル
とローダミンシグナルの比に定数を乗じて正規化された
アッセイシグナルを計算する．
【０００７】例１に示すように，内部指示薬の使用によ
り，このエストラジオールの定量においては，変動係数
（ＣＶ）は１１．５５％から 5. １６％に低下する．
り，このエストラジオールの定量においては，変動係数
（ＣＶ）は１１．５５％から 5. １６％に低下する．
【０００８】同様に，サンプル中のビタミンＢ12は，ホ
イルでシールした３個のウエルのモジュールを使用し
て，ＯＰＵＳ（登録商標）自動化装置上で行う蛍光イム
ノアッセイによって定量する．このアッセイでは，別個
のウエルに内因子（天然のタンパク質；Ｓｃｒｉｐｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより供給されてい
る），長さ０．８ミクロンまたはそれ以上のラテックス
粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｗａｒ
ｒｉｎｇｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａより供給
されている），および既知濃度の蛍光指示薬，ビス−
（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン酸を含有さ
せ，ピペット操作によってビタミンＢ12−アルカリホス
ファターゼ接合体および4 −メチルウンベリフェリルホ
スフェート蛍光原基質に添加する．ビタミンＢ12を含む
アッセイサンプルをラテックス−内因子溶液に加え，続
いて吸引およびピペッティングによって完全に混合した
のち，この溶液を３０分間インキュベートし，ガラス線
維マトリックス上に分散する．ついで，蛍光ローダミン
のシグナル読み取る．線維にビタミンＢ12−アルカリホ
スファターゼ接合体を加え，ついで混合物を４−メチル
ウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄する．
結合した接合体は蛍光原基質を変換する．蛍光アッセイ
シグナルをモニターし，結果をエストラジオール定量の
場合と同様に正規化する．アッセイシグナルの不正確さ
はこの正規化により変動係数（ＣＶ）１２．３％から
６．７％に低下する．
イルでシールした３個のウエルのモジュールを使用し
て，ＯＰＵＳ（登録商標）自動化装置上で行う蛍光イム
ノアッセイによって定量する．このアッセイでは，別個
のウエルに内因子（天然のタンパク質；Ｓｃｒｉｐｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより供給されてい
る），長さ０．８ミクロンまたはそれ以上のラテックス
粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｗａｒ
ｒｉｎｇｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａより供給
されている），および既知濃度の蛍光指示薬，ビス−
（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン酸を含有さ
せ，ピペット操作によってビタミンＢ12−アルカリホス
ファターゼ接合体および4 −メチルウンベリフェリルホ
スフェート蛍光原基質に添加する．ビタミンＢ12を含む
アッセイサンプルをラテックス−内因子溶液に加え，続
いて吸引およびピペッティングによって完全に混合した
のち，この溶液を３０分間インキュベートし，ガラス線
維マトリックス上に分散する．ついで，蛍光ローダミン
のシグナル読み取る．線維にビタミンＢ12−アルカリホ
スファターゼ接合体を加え，ついで混合物を４−メチル
ウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄する．
結合した接合体は蛍光原基質を変換する．蛍光アッセイ
シグナルをモニターし，結果をエストラジオール定量の
場合と同様に正規化する．アッセイシグナルの不正確さ
はこの正規化により変動係数（ＣＶ）１２．３％から
６．７％に低下する．
【０００９】本アッセイに用いられる試薬は，市販品を
入手できるかまたは既知の方法で製造できる．たとえ
ば，ビス−（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン
酸およびビス−（３−スルホプロピル）ローダミンピペ
ラジンアミドは，Ｍ．Ｊ．Ａｍｏｓｔらに１９９０年２
月１３日に発行された米国特許第４，９００，６８６号
の記載のように製造される．
入手できるかまたは既知の方法で製造できる．たとえ
ば，ビス−（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン
酸およびビス−（３−スルホプロピル）ローダミンピペ
ラジンアミドは，Ｍ．Ｊ．Ａｍｏｓｔらに１９９０年２
月１３日に発行された米国特許第４，９００，６８６号
の記載のように製造される．
【００１０】
例１ エストラジオールのアッセイ アッセイには３０μｌのエストラジオール−アルカリホ
スファターゼ接合体を使用する．接合体を試験モジュー
ル上のシールされたウエル中に包含される．２０個のモ
ジュール中９個には意図的に，所定の容量３０μｌより
も少ない容量，２５μｌ，２０μｌまたは１５μｌを満
たした．すべての試験モジュールについて同レベルのエ
ストラジオール１５０ pg/mlを用いて行い，シグナルを
測定した．シグナルの測定値は，そのままの値とするか
または相当するビス−（３−スルホプロピル)ローダミ
ンカルボン酸のシグナル値で正規化した．シグナルの変
動性は，２０例のアッセイシグナルについて変動係数
（ＣＶ）；標準偏差／平均値を計算して測定した．
スファターゼ接合体を使用する．接合体を試験モジュー
ル上のシールされたウエル中に包含される．２０個のモ
ジュール中９個には意図的に，所定の容量３０μｌより
も少ない容量，２５μｌ，２０μｌまたは１５μｌを満
たした．すべての試験モジュールについて同レベルのエ
ストラジオール１５０ pg/mlを用いて行い，シグナルを
測定した．シグナルの測定値は，そのままの値とするか
または相当するビス−（３−スルホプロピル)ローダミ
ンカルボン酸のシグナル値で正規化した．シグナルの変
動性は，２０例のアッセイシグナルについて変動係数
（ＣＶ）；標準偏差／平均値を計算して測定した．
【表１】 容量 アッセイシグナル ローダミン *正規化シグナル 30.07 29.69 32.63 28.19 31.98 28.4 26.31 29.03 29.21 25μl 29.39 26.93 35.17 20μl 23.98 23.97 32.24 15μl 22.84 23.49 31.33 28.73 29.48 31.4 28.55 29.87 30.79 28.7 31.13 29.7 25μl 27.01 27.59 31.54 20μl 24.43 23.35 33.71 15μl 22.83 22.75 32.32 26.33 28.66 29.59 27.17 28.17 31.07 28.62 29.04 31.75 25μl 28.42 28.83 31.75 20μl 21.04 23.47 28.88 15μl 19.13 19.61 31.44 28.14 29.14 31.11 28.99 29.85 31.29 平均 26.44 31.27 標準偏差 3.06 1.61 ％ＣＶ 11.55 5.18 * 正規化シグナル＝（アッセイシグナル／ローダミン）×定数
【００１１】例２ ＯＰＵＳ Ｂ12のアッセイ アッセイには５０μｌのラテックス−内因子複合体を使
用する．ラテックスを試験モジュール上のシールされた
ウエル中に含有させる．全試験モジュールに対し同レベ
ルのビタミンＢ12 １１５０pg/ml を用いてアッセイを
行い，シグナルを測定した．シグナルの測定値はそのま
まの値とするか，または相当するビス−（３−スルホプ
ロピル）ローダミンカルボン酸のシグナル値で正規化し
た．シグナルの変動性は，１８例のアッセイシグナルに
ついて変動係数（ＣＶ）；標準偏差／平均値を計算して
測定した．
用する．ラテックスを試験モジュール上のシールされた
ウエル中に含有させる．全試験モジュールに対し同レベ
ルのビタミンＢ12 １１５０pg/ml を用いてアッセイを
行い，シグナルを測定した．シグナルの測定値はそのま
まの値とするか，または相当するビス−（３−スルホプ
ロピル）ローダミンカルボン酸のシグナル値で正規化し
た．シグナルの変動性は，１８例のアッセイシグナルに
ついて変動係数（ＣＶ）；標準偏差／平均値を計算して
測定した．
【表２】 アッセイシグナル ローダミン *正規化シグナル 5.29 5.23 4.86 4.79 5.15 4.47 5.54 5.53 4.81 4.46 4.92 4.35 4.97 5.01 4.77 5.01 5.14 4.68 3.92 4.78 3.94 5.05 5.34 4.54 4.65 4.99 4.48 8.05 6.14 4.73 4.31 4.82 4.29 6.17 6.19 4.79 4.06 5.03 3.88 5.21 5.38 4.64 4.96 5.74 4.15 4.34 5.02 4.15 4.85 5.18 4.49 5.07 5.70 4.27 平均 4.93 4.46 標準偏差 0.61 0.30 ％ＣＶ 12.3 6.70 * 正規化シグナル＝（アッセイシグナル／ローダミン）×定数 アッセイシグナルの補正前の不正確さは１２．３％ＣＶ
であったのに対し，正規化後にはＣＶは６．７％に低下
した．
であったのに対し，正規化後にはＣＶは６．７％に低下
した．
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 311/82 Ｃ０７Ｄ 311/82 (72)発明者 シャイ インバー アメリカ合衆国マサチューセッツ州ブルッ クリン，マンチェスター ロード 23
Claims (20)
- 【請求項１】 生物学的サンプル中の被検物質のアッセ
イのシグナルを正規化する方法において， ａ）アッセイ試薬の少なくとも１種に内部指示薬を添加
し， ｂ）アッセイ試薬の添加および／または混合によってア
ッセイを実施して内部指示薬によって発生するシグナル
を読み取り， ｃ）アッセイ試薬によって生じたシグナルを読み取り， ｄ）正規化されたアッセイシグナルを計算する，ことか
らなる方法 - 【請求項２】 アッセイの精度が改良される「請求項
１」の方法 - 【請求項３】 内部指示薬は蛍光指示薬である「請求項
１」の方法 - 【請求項４】 蛍光指示薬はクマリンおよびキサンテン
またはそれらの誘導体からなる群より選ばれる「請求項
３」の方法 - 【請求項５】 クマリンは4 −メチルウンベリフェロン
である「請求項４」の方法 - 【請求項６】 キサンテンはＮ−［９−（２−カルボキ
シフェニル) −６−ジエチルアミノ) −３Ｈ−キサンテ
ン−３−イリデン］−Ｎ−エチルエタナミニウムクロリ
ド（ローダミンＢ），ビス−（３−スルホプロピル）ロ
ーダミンカルボン酸またはビス−（３−スルホプロピ
ル）ローダミンピペラジンアミドである「請求項４」の
方法 - 【請求項７】 アッセイはイムノアッセイである「請求
項１」の方法 - 【請求項８】 イムノアッセイは酵素イムノアッセイで
ある「請求項７」の方法 - 【請求項９】 イムノアッセイは競合アッセイである
「請求項８」の方法 - 【請求項１０】 被検物質，被検物質に特異的な抗体，
接合体，抗体に特異的な抗−抗体，および蛍光性基質が
使用される「請求項７」の方法 - 【請求項１１】 内部指示薬−接合体溶液，被検物質混
合物はピペット操作によって抗体に添加され，この溶液
をインキュベートし，指示薬シグナルを読み取る「請求
項１０」の方法 - 【請求項１２】 シグナルは蛍光シグナルである「請求
項１１」の方法 - 【請求項１３】 液体試薬およびサンプルのピペット操
作による添加を包含するイムノアッセイのシグナルを正
規化する方法において， ａ）被検物質を含有するサンプルを蛍光指示薬を含有す
る被検物質の接合体の溶液に添加し， ｂ）ａ）で得られた溶液に被検物質に特異的な抗体を添
加し， ｃ）ｂ）で得られた溶液をインキュベートし， ｄ）ｃ）で得られたインキュベートを固定化された抗−
抗体上に配剤し， ｅ）内部指示薬の蛍光シグナルを読み取り， ｆ）ｄ）で得られた非結合接合体を蛍光原性基質で洗浄
し， ｇ）アッセイ蛍光シグナルを読み取り，ついで ｈ）アッセイシグナルを正規化する， 工程からなる方法 - 【請求項１４】 イムノアッセイは蛍光イムノアッセイ
である「請求項１３」の方法 - 【請求項１５】 液体試薬およびサンプルのピペット操
作を包含するイムノアッセイのシグナルを正規化する方
法において， ａ）被検物質を含有するサンプルを，蛍光指示薬ととも
にラテックス粒子の溶液に支持された内因子に添加し， ｂ）ａ）で得られた溶液をインキュベートし， ｃ）ｂ）で得られたインキュベートをガラス線維マトリ
ックスＧＦ／Ｆ上に分散し， ｄ）内部指示薬の蛍光シグナルを読み取り， ｅ）ｃ）で得られた分散液に接合体を添加し， ｆ）ｅ）で得られた非結合接合体を基質で洗浄し， ｇ）アッセイ蛍光シグナルを読み取り，ついで ｈ）正規化されたアッセイシグナルを計算する， 工程からなる方法 - 【請求項１６】 イムノアッセイは蛍光イムノアッセイ
である「請求項１５」の方法 - 【請求項１７】 サンプル中のエストラジオールを定量
する方法において，ａ）ビス−（３−スルホプロピル）
ローダミンピペラジンアミド酸を含有するエストラジオ
ール−アルカリホスファターゼ接合体の溶液中にエスト
ラジオールサンプルをピペット操作によって添加し， ｂ）工程ａ）で得られた溶液をウサギ抗エストラジオー
ル抗体中にピペット操作によって添加し， ｃ）工程ｂ）で得られた溶液をインキュベートし， ｄ）工程ｃ）で得られたインキュベートをガラス線維マ
トリックスＧＦ／Ｆ上に分散し， ｅ）工程ｄ）で得られた分散液の指示薬蛍光シグナルを
読み取り， ｆ）工程ｄ）で得られた非結合接合体を4 −メチルウン
ベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄し， ｇ）アッセイ蛍光シグナルを読み取り， ｈ）エストラジオールシグナルと指示薬シグナルの比に
定数を乗じてエストラジオールアッセイシグナルを正規
化する， 工程からなる方法 - 【請求項１８】 サンプル中のビタミンＢ12を定量する
方法において， ａ）ビス−（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン
酸とともにラテックス粒子上に支持された内因子の溶液
中にビタミンＢ12サンプルをピペット操作によって添加
し， ｂ）ａ）で得られた溶液をインキュベートし， ｃ）ｂ）で得られたインキュベートをガラス線維マトリ
ックスＧＦ／Ｆ上に分散し， ｄ）工程ｃ）で得られた分散液の指示薬の蛍光を読み取
り， ｅ）工程ｃ）で得られたインキュベート中にビタミンＢ
12−アルカリホスファターゼ接合体をピペット操作で添
加し， ｆ）工程ｃ）のマトリックスから非結合接合体を４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート蛍光原基質で洗浄
し， ｇ）工程ｆ）で発生した蛍光を読み取り， ｈ）ビタミンＢ12のアッセイシグナルとローダミンシグ
ナルの比に定数を乗じてビタミンＢ12のシグナルを正規
化する， 工程からなる方法 - 【請求項１９】 方法は分析装置上で実施される「請求
項１７」の方法 - 【請求項２０】 方法は分析装置上で実施される「請求
項１８」の方法
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