WO2018216628A1 - タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬 - Google Patents

タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2018216628A1
WO2018216628A1 PCT/JP2018/019368 JP2018019368W WO2018216628A1 WO 2018216628 A1 WO2018216628 A1 WO 2018216628A1 JP 2018019368 W JP2018019368 W JP 2018019368W WO 2018216628 A1 WO2018216628 A1 WO 2018216628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
monomer
copolymer
solution
formula
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/019368
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕貴 鈴木
佐々木　崇
伸行 坂元
Original Assignee
日油株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日油株式会社 filed Critical 日油株式会社
Priority to JP2019520225A priority Critical patent/JP7226310B2/ja
Priority to CN201880033772.1A priority patent/CN110650969B/zh
Priority to US16/616,656 priority patent/US11261275B2/en
Publication of WO2018216628A1 publication Critical patent/WO2018216628A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
    • C08F220/28—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety
    • C08F220/282—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety and containing two or more oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F230/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal
    • C08F230/02—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a protein stabilizer and a protein stabilizing reagent in which the protein stabilizer is dissolved in a solution containing the protein.
  • Biochemical measurements such as enzyme immunoassay, immunoturbidimetry, latex agglutination, immunochromatography, nucleic acid analysis, and immunostaining are widely used in the fields of clinical examination, in vitro diagnosis, and companion diagnosis. In recent years, food analysis and environmental analysis using these measurement techniques have been widely performed.
  • the measurement object (specimen) of the measurement method may be a protein such as an enzyme or an antibody. In such a case, the protein of the measurement object needs to be stably stored.
  • the stability required for a protein that is a component of a reagent is the stability when the protein stabilizing reagent is stored at room temperature and the stability when stored in a refrigerated state.
  • the stability when stored at room temperature means keeping the reagent active during the waiting time from the preparation of the reagent to the measurement in biochemical measurement or the measurement waiting time in multi-analyte processing using an automatic analyzer. It is stable.
  • the stability when stored in a refrigerated state refers to stability in consideration of long-term storage of the reagent or on-board storage of the reagent in an automatic analyzer.
  • the stability required when the protein is the measurement object is also the stability when the solution containing the measurement object is placed under the same situation as described above.
  • protein stabilization is very important, but many proteins have various factors such as heat, refrigeration, freezing, light, pH, salt concentration, oxidation, nonspecific adsorption to the container, protein It is easily denatured and deactivated under the influence of self-aggregation and the like.
  • reagents and measurement objects are in solution for ease of automation, but proteins dissolved in the solution are in a dry state that contains little moisture. It is known that its long-term stability is very low compared to the other proteins.
  • BSA bovine serum albumin
  • Patent Document 1 is an amino acid ester or polyamine
  • Patent Document 2 is a copolymer having a phosphorylcholine group
  • Non-Patent Document 1 is an amino acid
  • Non-Patent Document 2 is a protein containing polyethylene glycol.
  • a containing solution is disclosed. Also known is a method of improving the protein stabilization effect by dissolving saccharides such as sucrose, lactose, and trehalose in a protein-containing solution.
  • any of the above methods has insufficient protein stabilization effect.
  • saccharides such as sucrose
  • an object of the present invention is to provide a protein stabilizer and a protein stabilizing reagent for stably storing proteins such as enzymes, antibodies, enzyme-labeled antibodies, etc. used in biochemical measurements in a solution. .
  • the copolymer is obtained by copolymerizing the monomer a of the formula (1), the monomer b of the formula (2), and the monomer c of the formula (3).
  • a protein stabilizer is provided.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 2 is a hydrogen atom or a methyl group, and R 3 is a C 3-6 alkyl group having two or more hydroxyl groups.
  • R 4 is a hydrogen atom or a methyl group, and R 5 is an alkyl group having 2 to 18 carbon atoms.
  • a protein stabilizing reagent comprising protein, water, and the above protein stabilizer, wherein the content of the protein stabilizer is 0.01 to 5.0% by mass.
  • the protein stabilizer and protein stabilizing reagent of the present invention stably stabilize proteins such as enzymes, antibodies, and enzyme-labeled antibodies used in biochemical measurements in a solution for a long period of time at both room temperature and low temperature. Can be saved. Further, when a saccharide such as sucrose is added to the protein stabilizing reagent, the protein stabilizing effect can be improved even if the addition amount is small, so that the thickening of the solution can be suppressed.
  • the protein stabilizer of the present invention comprises a monomer a represented by the formula (1), a monomer b represented by the formula (2), and a monomer c represented by the formula (3). It consists of a polymerized copolymer.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group. From the viewpoint of raw material availability, R 1 is preferably a methyl group.
  • R 2 is a hydrogen atom or a methyl group. From the viewpoint of stability, R 2 is preferably a methyl group.
  • R 3 is a C 3-6 alkyl group having two or more hydroxyl groups. From the viewpoint of availability, R 3 is preferably an alkyl group having 3 to 5 carbon atoms having 2 to 4 hydroxyl groups.
  • the monomer b of the formula (2) include glycerin mono (meth) acrylate, threitol mono (meth) acrylate, erythritol mono (meth) acrylate, xylitol mono (meth) acrylate, and arabitol mono (meth).
  • examples include acrylate, mannitol mono (meth) acrylate, galactitol mono (meth) acrylate, and sorbitol mono (meth) acrylate.
  • glycerin mono (meth) acrylate and xylitol mono (meth) acrylate are preferable.
  • “(meth) acrylate” represents “acrylate and / or methacrylate”.
  • R 4 is a hydrogen atom or a methyl group. From the viewpoint of stability, R 4 is preferably a methyl group.
  • R 5 is an alkyl group having 2 to 18 carbon atoms. This alkyl group does not have a substituent such as a hydroxyl group.
  • monomer c of formula (3) examples include ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, pentyl (meth) acrylate, hexyl (meth) acrylate, Heptyl (meth) acrylate, octyl (meth) acrylate, nonyl (meth) acrylate, decyl (meth) acrylate, undecyl (meth) acrylate, dodecyl (meth) acrylate, tridecyl (meth) acrylate, ( Examples include tetradecyl (meth) acrylate, pentadecyl (meth) acrylate, cetyl (meth) acrylate, heptadecyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, and the like. In particular, butyl methacrylate, lauryl methacrylate, and o
  • the ratio of monomer a is 10 to 80 mol%, and the ratio of monomer b is It is preferably 10 to 80 mol%, and the proportion of monomer c is preferably 10 to 80 mol%.
  • the proportion of monomer a is 40 to 50 mol%
  • the proportion of monomer b is 20 to 40 mol%
  • the proportion of monomer c is 20 to 40 mol%. % Is more preferable.
  • the copolymer obtained by copolymerizing the monomers a to c is a ternary copolymer having structural units of the following formulas (4) to (6).
  • R 1 to R 5 in formulas (4) to (6) have the same meanings as those in formulas (1) to (3), and preferred embodiments are also the same.
  • the copolymer has a terminal structure corresponding to each polymerization method described later. Due to the specificity of the polymerization reaction, those containing a small amount of unintended branched structures and by-products are also within the scope of the copolymer. Those containing inevitable impurities are also within the scope of the copolymer.
  • the proportions of the structural units of the formulas (4) to (6) in the copolymer correspond to the proportions of the monomers a to c used for the copolymerization.
  • the proportion of the structural units of the formula (4) is 10 to 80%
  • the proportion of the structural units of the formula (5) is 10 to 80%
  • the proportion of the structural unit of the formula (6) is preferably 10 to 80%.
  • the structural unit of the formula (4) is 40 to 50%
  • the structural unit of the formula (5) is 20 to 40%
  • the structural unit of the formula (6) is 20 to 40%.
  • the terminal structures other than the structural units of the formulas (4) to (6) are very small and almost negligible.
  • the copolymer obtained by copolymerizing the monomers a to c as the protein stabilizer of the present invention may have any structure such as a random copolymer or a block copolymer. It may be a mixture.
  • the molecular weight of the copolymer is 1,000 to 700,000, preferably 5,000 to 500,000, and preferably 10,000 to 250 in terms of polyethylene glycol equivalent weight average molecular weight (Mw) by gel filtration chromatography analysis. 50,000 is more preferable, and 50,000 to 150,000 is particularly preferable. This is because the protein stabilization effect is good. In addition, you may perform a gel filtration chromatography analysis using the high performance liquid chromatography system CCPS8020 series (made by Tosoh Corporation), for example.
  • a copolymerization method for obtaining a copolymer known methods such as solution polymerization, bulk polymerization, emulsion polymerization, and suspension polymerization can be used.
  • a method of polymerizing monomers a to c by a polymerization reaction such as radical polymerization in a solvent in the presence of a polymerization initiator can be employed.
  • the initiator used for the polymerization reaction can be selected from ordinary initiators.
  • it may be an aliphatic azo compound or an organic peroxide.
  • Specific examples include 2,2′-azobisisobutyronitrile, benzoyl peroxide, diisopropyl peroxydicarbonate, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate, t-butylperoxypivalate, t-butylperoxydiisobutene.
  • examples thereof include tyrate and persulfates such as potassium persulfate and ammonium persulfate.
  • These polymerization initiators may be used as a mixture of two or more.
  • a redox type radical accelerator may be used.
  • the polymerization temperature is preferably 30 ° C. to 80 ° C., more preferably 40 ° C. to 70 ° C.
  • the polymerization time is preferably 2 to 72 hours. This is because the polymerization reaction proceeds well.
  • a solvent may be used for smoothly performing the polymerization reaction, and examples of the solvent include water, methanol, ethanol, propanol, t-butanol, benzene, toluene, dimethylformamide, tetrahydrofuran, dioxane, chloroform, and mixtures thereof. Etc.
  • Proteins that can be stabilized by the protein stabilizer of the present invention are not particularly limited, but antibodies such as immunoglobulin G and immunoglobulin E, peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, lipase, DNA polymerase, RNA polymerase, reverse Examples thereof include enzymes such as photoenzymes, and complexes of antibodies and enzymes (enzyme-labeled antibodies). Among these, it can apply suitably for stabilization of the enzyme labeled antibody frequently used with an enzyme immunoassay.
  • the protein stabilizer of the present invention coexists with a protein in a solution to prevent inactivation of the protein and maintain its physiological activity for a long time.
  • the protein is dissolved and stored in an aqueous solution in which the protein stabilizer of the present invention is dissolved.
  • aqueous solution only the protein and the protein stabilizer of the present invention may be dissolved, or a buffer may be further dissolved. That is, as a solvent for dissolving the protein and the protein stabilizer of the present invention, a buffer solution usually used in this field can be used. For example, phosphate buffer, Tris buffer, Good buffer, glycine buffer, borate buffer, carbonate buffer and the like can be mentioned. Moreover, you may mix and use these.
  • the concentration of the protein stabilizer of the present invention is preferably 0.01 to 5.0% by mass. This is because the protein stabilization effect is good.
  • concentration in the aqueous solution of the protein to stabilize differs greatly with protein of object, what is necessary is just to set it as the suitable density
  • a suitable temperature for protein stabilization is ⁇ 30 ° C. to 40 ° C., particularly preferably 0 ° C. to 30 ° C. That is, the protein can be stably stored for a long period of time by allowing the protein and the protein stabilizer of the present invention to coexist in the solution within the temperature range.
  • the protein stabilization reagent of the present invention is a solution containing protein, water, and the protein stabilizer of the present invention, and the protein stabilizer of the present invention contains 0.01 to 5.0% by mass in the solution.
  • it is an aqueous solution in which the protein stabilizer and protein of the present invention are dissolved in water.
  • water purified water, pure water, ion-exchanged water and the like are preferable.
  • the protein contained in the protein stabilizing reagent is a protein that can be stabilized by the protein stabilizing agent.
  • the protein concentration in the protein stabilizing reagent varies greatly depending on the type of protein, and can be adjusted according to the purpose of use of the protein to be stabilized in the range of 10 -15 to 1% by mass or the reagent, for example. preferable.
  • the protein stabilizer of the present invention can be used in combination with a buffer solution usually used in this field as long as it does not lose physiological activity such as enzyme activity, antibody activity, and antigenicity of the protein. . Therefore, it can be set as the protein stabilization reagent containing protein, water, the protein stabilizer of this invention, and a buffer solution. Alternatively, a protein and a protein stabilizer can be dissolved in a buffer solution to obtain a protein stabilizing reagent.
  • buffers examples include phosphate buffer, Tris-HCl buffer, Good's buffer, glycine buffer, borate buffer, and carbonate buffer.
  • the protein stabilizing reagent of the present invention may contain these reagents and compounds in addition to protein, water, and the protein stabilizer of the present invention.
  • these reagents and compounds include polyols, polyethers, proteins other than the protein to be stabilized, salts, surfactants, biochemical reagents, preservatives, organic solvents, and the like.
  • the polyol include glycerol, sucrose, glucose and the like.
  • the polyether include polyoxyethylene glycol.
  • proteins other than the protein to be stabilized include serum albumin, gelatin, and casein.
  • salts include amino acids and amino acid salts such as glycine, alanine, glutamic acid, aspartic acid, lysine, histidine, peptides, sodium salts, potassium salts, magnesium salts, calcium salts, phosphates, sulfates, hydrochlorides, etc.
  • organic salts such as salts, trishydroxyethylaminomethane, ethylenediaminetetraacetic acid, acetic acid, citric acid, and malic acid.
  • the surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan monoalkyl ether, and alkyl betaine.
  • biochemical reagents include flavins, coenzymes such as colipase, and nucleic acids such as nucleosides and nucleotides.
  • preservative include sodium azide, paraoxybenzoic acid preparation, dehydroacetic acid preparation, procrine preparation and the like.
  • organic solvent include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, isoamyl alcohol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, chloroform, phenol and the like.
  • the use temperature of the protein stabilizer of the present invention is preferably ⁇ 30 ° C. to 40 ° C., more preferably 0 ° C. to 30 ° C. from the viewpoint of the protein stabilization effect.
  • the storage temperature of the protein stabilizing reagent of the present invention is preferably ⁇ 30 ° C. to 40 ° C., more preferably 0 ° C. to 30 ° C.
  • the organic solvent which has antifreezing effects such as glycerol.
  • Monomer a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as MPC)
  • Monomer b glycerol monomethacrylate (hereinafter abbreviated as GLM)
  • GLM glycerol monomethacrylate
  • Monomer c n-butyl methacrylate (hereinafter abbreviated as BMA)
  • MAc methacrylic acid which is a monomer other than monomers a to c
  • AIBN 2,2′-azobisisobutyronitrile
  • the resulting reaction solution was ice-cooled and added dropwise to diethyl ether to precipitate the product.
  • the precipitate was filtered off, washed with diethyl ether, and dried in vacuo to obtain copolymer 1 in the form of a white powder.
  • the obtained copolymer 1 was dissolved in phosphate physiological buffer saline, and gel filtration chromatography (hereinafter referred to as GFC) analysis of this solution was performed.
  • GFC gel filtration chromatography
  • the obtained copolymer 2 was dissolved in phosphate physiological buffer saline, and GFC analysis of this solution was performed. As a result, the weight average molecular weight of the copolymer 2 was 22,000 in terms of polyethylene glycol. GFC analysis was performed under the same conditions as in Synthesis Example 1.
  • the obtained copolymer 3 was dissolved in phosphate physiological buffer saline, and GFC analysis of this solution was performed. As a result, the weight average molecular weight of the copolymer 3 was 93,000 in terms of polyethylene glycol. GFC analysis was performed under the same conditions as in Synthesis Example 1.
  • the obtained copolymer 4 was dissolved in phosphate physiological buffer saline, and GFC analysis of this solution was performed. As a result, the weight average molecular weight of the copolymer 4 was 680,000 in terms of polyethylene glycol. GFC analysis was performed under the same conditions as in Synthesis Example 1.
  • Example 1-1 Preparation of protein stabilizing reagent Dulbecco's phosphate buffered saline (CAT NO. D1408, manufactured by SIGMA-ALDRICH), horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse immunoglobulin G antibody (CAT NO. 170-6516, manufactured by Bio-Rad) Hereinafter referred to as POD-IgG) so that its final concentration is 0.005% by volume, and a 5% by weight aqueous solution of copolymer 1 has a final concentration of 50% by volume (copolymer weight in the final solution).
  • the protein 1 was dissolved so that the concentration of the union 1 was about 2.5 w / v%) to prepare a protein stabilizing reagent.
  • w / v% means “(mass / volume)%”, and represents the mass of a certain component in 100 ml of solution in grams (g).
  • the solution contains 1.0 w / v% copolymer means that 100 ml of the solution contains 1.0 g of the copolymer.
  • the prepared protein stabilization reagent is incubated and stored at 25 ° C., and the day when the incubation is started is set as the “start date” of the test, on the start date (before incubation), 1 day, 3 days, And 6 days later, the protein stabilization effect was evaluated by the following test method.
  • the protein stabilizing reagent was added to a polystyrene 96-well microplate at 8 ⁇ L / well, and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine solution (TMB) (CAT NO. 50-) was added.
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine solution
  • 76 manufactured by KPL
  • 2N sulfuric acid was added at 50 ⁇ L / well to stop the color reaction.
  • the reaction solution was evaluated for its POD-IgG stabilization effect (protein stabilization effect) by measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm.
  • the absorbance on the start date immediately after the preparation of the protein stabilizing reagent and the absorbance on each elapsed day were measured by the following method, and the residual enzyme activity (%) was calculated by the following formula [1].
  • the protein stabilization effect was evaluated by the enzyme activity remaining rate (%). The higher the enzyme activity remaining rate, the higher the protein stabilization effect.
  • the remaining enzyme activity rate on the start day is 100% because the denominator of the following formula 1 is “absorbance on the start day”.
  • the number of days during which the enzyme activity remaining rate was maintained at 80% or more was defined as the high activity maintenance period (days). Table 2 shows the measurement results of the enzyme activity remaining rate and the high activity maintenance period.
  • Example 1-2 Example 1 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 1 was dissolved so that its final concentration was 10% by volume (the concentration of copolymer 1 in the final solution was about 0.5 w / v%). Similar to -1, a protein stabilizing reagent was prepared and evaluated. The results are shown in Table 2.
  • Example 1-3 A protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as Example 1-1 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 2 was used instead of the 5% by mass aqueous solution of copolymer 1. . The results are shown in Table 2.
  • Example 1-4 instead of the 5 mass% aqueous solution of copolymer 1, the final concentration of 5 mass% aqueous solution of copolymer 2 is 10 vol% (the concentration of copolymer 2 in the final solution is about 0.5 w / v%).
  • a protein stabilizing reagent was prepared and an evaluation test was conducted in the same manner as in Example 1-1 except that the sample was dissolved so that The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 1-1 A protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1-1 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 3 was used instead of the 5% by mass aqueous solution of copolymer 1. . The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 1-2 A protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1-1 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 4 was used instead of the 5% by mass aqueous solution of copolymer 1. . The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 1-3 A protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1-1 except that sucrose was used instead of the 5% by weight aqueous solution of copolymer 1 so that the final concentration was 10 w / v%. Went. The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 1-4 A protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1-1 except that a 5% by mass aqueous solution of BSA was used instead of the 5% by mass aqueous solution of copolymer 1. The results are shown in Table 2.
  • Example 1 A protein stabilizing reagent was prepared by adding only POD-IgG to Dulbecco's phosphate buffered saline and adjusting the concentration with purified water so that the final concentration of POD-IgG was 0.005% by volume. An evaluation test was conducted in the same manner as in -1. The results are shown in Table 2.
  • the protein stabilizing reagents of Examples 1-1 to 1-4 were more stable than the protein stabilizing reagents of Comparative Examples 1-1 to 1-5 (POD-IgG) at room temperature storage conditions. ) Is significantly improved.
  • the enzyme activity residual rate may show the value which increased a little with the passage of time, it seems to be a measurement error.
  • Example 2-1 Example 1 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 1 was dissolved so that its final concentration was 10% by volume (the concentration of copolymer 1 in the final solution was about 0.5 w / v%).
  • a protein stabilizing reagent was prepared as in -1. Incubation temperature is set to 4 ° C., and the progress date for evaluating the protein stabilization effect is defined as the start date, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 15 weeks, 30 weeks, and An evaluation test was conducted in the same manner as in Example 1-1 except that the change was made after 60 weeks. The results are shown in Table 3. The unit of the high activity maintenance period in the evaluation test under the refrigerated storage condition was set to “week”.
  • Example 2-2 Example 2 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 1 was dissolved so that its final concentration was 2% by volume (the concentration of copolymer 1 in the final solution was about 0.1 w / v%). Similar to -1, a protein stabilizing reagent was prepared and evaluated. The results are shown in Table 3.
  • Example 2-3 Example 2 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 2 was dissolved so that its final concentration was 10% by volume (the concentration of copolymer 2 in the final solution was about 0.5 w / v%). Similar to -1, a protein stabilizing reagent was prepared and evaluated. The results are shown in Table 3.
  • Example 2-4 Example 2 except that a 5% by mass aqueous solution of copolymer 2 was dissolved so that its final concentration was 2% by volume (the concentration of copolymer 2 in the final solution was about 0.1 w / v%). Similar to -1, a protein stabilizing reagent was prepared and evaluated. The results are shown in Table 3.
  • Example 2-5 A 5% by mass aqueous solution of copolymer 2 is dissolved so that its final concentration is 2% by volume (the concentration of copolymer 2 in the final solution is about 0.1 w / v%), and sucrose is further added to the final concentration.
  • a protein stabilizing reagent was prepared and evaluated in the same manner as in Example 2-1, except that it was dissolved so as to have a concentration of 10% by mass. The results are shown in Table 3.
  • Comparative Examples 2-1 to 2-5 The protein stabilizing reagents of Comparative Examples 2-1 to 2-5 were prepared in the same manner as Comparative Examples 1-1 to 1-5, respectively, and evaluation tests were performed in the same manner as in Example 2-1. The results are shown in Table 3.
  • the protein stabilizing agent of the present invention and the protein stabilizing reagent containing the protein stabilizing agent are used in fields where the protein is required to stably maintain physiological activity, preferably clinical examination, in vitro diagnosis, companion diagnosis, food analysis
  • biochemical measurements such as enzyme immunoassay, immunoturbidimetry, nucleic acid analysis, and immunostaining is expected.
  • application to a wide range of fields such as medical devices, pharmaceuticals, and biosensing can be expected.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

生化学測定において用いられる酵素、抗体、酵素標識抗体等のタンパク質を、溶液中で安定に保存するためのタンパク質安定化剤を提供する。更に、タンパク質含有溶液中に該タンパク質安定化剤が溶解しているタンパク質安定化試薬を提供する。該タンパク質安定化剤は、式（１）の単量体ａ、式（２）の単量体ｂ、及び式（３）の単量体ｃを共重合した共重合体からなる。

Description

タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬
　本発明は、タンパク質安定化剤、及びタンパク質を含有する溶液中に該タンパク質安定化剤が溶解されているタンパク質安定化試薬に関する。
　臨床検査、体外診断、コンパニオン診断の分野において、酵素免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、核酸分析、免疫染色をはじめとした生化学測定が広く用いられている。また近年は、これらの測定技術を応用した食品分析、環境分析も広く行われるようになっている。
　上記診断及び分析場面において正確性は必須要件である。従って、診断又は分析用の試薬の一成分として使用される酵素、抗体、標識抗体等のタンパク質が長期間安定に生理活性等を保持できることが重要である。また、上記測定方法の測定対象物（検体）が、酵素や抗体等のタンパク質である場合もあり、このようなときも測定対象物のタンパク質が安定に保管される必要がある。
　試薬の一成分であるタンパク質に求められる安定性とは、具体的には、タンパク質安定化試薬を室温下に保存した場合の安定性、及び冷蔵状態で保存した場合の安定性である。室温下に保存した場合の安定性とは、生化学測定に際して試薬を準備してから測定までの待ち時間、或いは自動分析装置を用いた多検体処理における測定待ち時間での試薬の活性維持を念頭においた安定性である。また冷蔵状態で保存した場合の安定性とは、試薬の長期保管、或いは自動分析装置における試薬のオンボード保存を念頭に置いた安定性である。なお、タンパク質が測定対象物である場合に求められる安定性も、測定対象物を含む溶液が上記と同様の状況下に置かれた場合の安定性である。
　このように、タンパク質の安定化は非常に重要であるが、多くのタンパク質は種々の要因、例えば熱、冷蔵、凍結、光、ｐＨ、塩濃度、酸化、容器への非特異的吸着、タンパク質の自己凝集等の影響を受けて容易に変性、失活してしまう。
　また、自動分析装置においては、自動化でのハンドリングの容易さから、試薬や測定対象物は溶液状態であることが好まれるが、溶液中に溶解されているタンパク質は、水分をほとんど含まない乾燥状態のタンパク質と比較して、その長期安定性が非常に低いことが知られている。
　タンパク質が溶解している溶液を安定化させる方法としては、ウシ血清アルブミン（以後、ＢＳＡと略称する）を該溶液に添加する方法が一般的に知られている。しかし、該方法によるタンパク質の安定化効果は十分ではない。更に、狂牛病をはじめとした感染症リスク、天然物ゆえのロット間のバラツキ（低再現性）、長期保管時のＢＳＡの凝集沈殿の発生等、種々の問題が存在する。
　そこで、ＢＳＡの代替として、特許文献１はアミノ酸エステルやポリアミンを、特許文献２はホスホリルコリン基を有する共重合体を、非特許文献１はアミノ酸を、非特許文献２はポリエチレングリコールを、含有するタンパク質含有溶液を開示している。また、スクロース、ラクトース、トレハロース等の糖類をタンパク質含有溶液に溶解させ、タンパク質の安定化効果を向上させる方法も知られている。
特開２００４－１０８８５０ 特開１９９８－４５７９４
K. Shiraki, et. al., J. Biochem., 132, 591-595 (2002) Cleland JL, et. al., J. Biol. Chem., 267, 13327-13334 (1992)
　しかしながら、上記のいずれの方法もタンパク質安定化効果は不十分である。また、スクロース等の糖類をタンパク質含有溶液に溶解させた場合、該溶液の増粘が起こり、溶液のハンドリング性が低下するおそれがある。従って、タンパク質含有溶液の増粘防止とタンパク質の十分な安定化との両立は非常に困難である。
　そこで、本発明の課題は、生化学測定において用いられる酵素、抗体、酵素標識抗体等のタンパク質を溶液中で安定に保存するための、タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬を提供することである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の共重合体が、溶液中でタンパク質を高度に安定化することを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明の一形態によれば、式（１）の単量体ａ、式（２）の単量体ｂ、及び式（３）の単量体ｃを共重合した共重合体からなるタンパク質安定化剤が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式（１）中、Ｒ1は水素原子又はメチル基である。式（２）中、Ｒ2は水素原子又はメチル基であり、Ｒ3は２個以上の水酸基を有する炭素数３～６のアルキル基である。式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基であり、Ｒ5は炭素数２～１８のアルキル基である。
　本発明の他の形態によれば、タンパク質、水、及び上記タンパク質安定化剤を含有し、該タンパク質安定化剤の含有量が０．０１～５．０質量％である、タンパク質安定化試薬が提供される。
　本発明のタンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬は、生化学測定において用いられる酵素、抗体、酵素標識抗体等のタンパク質を、室温及び低温いずれの温度下においても、溶液中で長期間にわたって安定に保存することができる。また、このタンパク質安定化試薬にスクロース等の糖類を添加する場合、その添加量が少量であってもタンパク質安定化効果を改善することができるため、溶液の増粘を抑制することができる。
　本発明のタンパク質安定化剤は、式（１）で表される単量体ａ、式（２）で表される単量体ｂ、及び式（３）で表される単量体ｃを共重合した共重合体からなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（１）中、Ｒ1は水素原子又はメチル基である。原料入手性の観点からは、Ｒ1はメチル基であることが好ましい。
　式（２）中、Ｒ2は水素原子又はメチル基である。安定性の観点からは、Ｒ2はメチル基であることが好ましい。
　式（２）中、Ｒ3は２個以上の水酸基を有する炭素数３～６のアルキル基である。入手性の観点からは、Ｒ3は２～４個の水酸基を有する炭素数３～５のアルキル基であることが好ましい。
　式（２）の単量体ｂの具体例としては、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、トレイトールモノ（メタ）アクリレート、エリトリトールモノ（メタ）アクリレート、キシリトールモノ（メタ）アクリレート、アラビトールモノ（メタ）アクリレート、マンニトールモノ（メタ）アクリレート、ガラクチトールモノ（メタ）アクリレート、ソルビトールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。特に、グリセリンモノ（メタ）アクリレート及びキシリトールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。なお、本願において、「（メタ）アクリレート」は、「アクリレート及び／又はメタクリレート」を表す。
　式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基である。安定性の観点からは、Ｒ4はメチル基であることが好ましい。
　式（３）中、Ｒ5は炭素数２～１８のアルキル基である。このアルキル基は水酸基等の置換基を有さない。
　式（３）の単量体ｃの具体例としては、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル、（メタ）アクリル酸ウンデシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸トリデシル、（メタ）アクリル酸テトラデシル、（メタ）アクリル酸ペンタデシル、（メタ）アクリル酸セチル、（メタ）アクリル酸ヘプタデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル等が挙げられる。特に、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリル、及びメタクリル酸ステアリルが好ましい。なお、本願において、「（メタ）アクリル酸」は、「アクリル酸及び／又はメタクリル酸」を表す。
　共重合に用いる単量体ａ、単量体ｂ、及び単量体ｃの合計を１００モル％とすると、単量体ａの割合が１０～８０モル％であり、単量体ｂの割合が１０～８０モル％であり、単量体ｃの割合が１０～８０モル％であることが好ましい。タンパク質安定化効果向上の観点から、単量体ａの割合が４０～５０モル％であり、単量体ｂの割合が２０～４０モル％であり、単量体ｃの割合が２０～４０モル％であることがより好ましい。
　上記単量体ａ～ｃを共重合した共重合体は、下記式（４）～（６）の構成単位を有する３元共重合体である。式（４）～（６）中のＲ1～Ｒ5は、式（１）～（３）中のそれらと同義であり、好ましい態様も同じである。該共重合体は後述の各重合方法に応じた末端構造を有する。重合反応の特異性から、意図しない分岐構造や副生物を少量含有するものも、該共重合体の範囲内である。また、不可避的不純物を含有するものも、該共重合体の範囲内である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　共重合体中の式（４）～（６）の構成単位の割合は、共重合に用いる単量体ａ～ｃの割合に対応している。式（４）～（６）の構成単位の数の合計を１００％とすると、式（４）の構成単位の割合が１０～８０％であり、式（５）の構成単位の割合が１０～８０％であり、式（６）の構成単位の割合が１０～８０％であることが好ましい。式（４）の構成単位が４０～５０％であり、式（５）の構成単位が２０～４０％であり、式（６）の構成単位が２０～４０％であることがより好ましい。なお、共重合体において、式（４）～（６）の構成単位以外の末端構造等は極僅かであり、ほとんど無視できる範囲である。
　本発明のタンパク質安定化剤である、単量体ａ～ｃを共重合した共重合体は、ランダム共重合体やブロック共重合体等いずれの構造であってもよく、これらの共重合体の混合物であってもよい。
　共重合体の分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー分析によるポリエチレングリコール換算の重量平均分子量（Ｍｗ）で、１，０００～７００，０００であり、５，０００～５００，０００が好ましく、１０，０００～２５０，０００がより好ましく、５０，０００～１５０，０００が特に好ましい。タンパク質安定化効果が良好だからである。なお、ゲルろ過クロマトグラフィー分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーシステムＣＣＰＳ８０２０シリーズ（東ソー株式会社製）を用いて行ってよい。
　共重合体を得るための共重合の方法としては、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の公知の方法を用いることができる。例えば、溶媒中、重合開始剤の存在下、ラジカル重合等の重合反応によって、単量体ａ～ｃを重合する方法を採用することができる。
　重合反応に用いる開始剤は、通常の開始剤から選択でき、例えば、ラジカル重合の場合は脂肪族アゾ化合物や有機過酸化物であってよい。具体例としては、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート、ｔ－ブチルペルオキシピバレート、ｔ－ブチルペルオキシジイソブチレートや、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩等が挙げられる。これらの重合開始剤は２種以上を混合して使用してもよい。また、レドックス系のラジカル促進剤を使用してもよい。
　重合温度としては、３０℃～８０℃が好ましく、４０℃～７０℃がより好ましい。また、重合時間は２～７２時間が好ましい。重合反応が良好に進行するからである。更に、重合反応を円滑に行うために溶媒を用いてもよく、該溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ－ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、これらの混合物等を挙げることができる。
　本発明のタンパク質安定化剤によって安定化可能なタンパク質は特に限定されないが、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＥ等の抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、リパーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の酵素、抗体と酵素の複合体（酵素標識抗体）等が挙げられる。これらの中でも、酵素免疫測定法で多用される酵素標識抗体の安定化に好適に適用することができる。
　本発明のタンパク質安定化剤は、溶液中でタンパク質と共存することによって、タンパク質の失活を防止し、その生理活性を長期間維持する。好ましくは、本発明のタンパク質安定化剤が溶解した水溶液中にタンパク質を溶解させて保管する。
　該水溶液中にはタンパク質と本発明のタンパク質安定化剤のみが溶解していてもよく、又は、更に緩衝剤が溶解していてもよい。即ち、タンパク質及び本発明のタンパク質安定化剤を溶解する溶媒として、本分野で通常用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。また、これらを混合して使用してもよい。
　該水溶液中において、本発明のタンパク質安定化剤の濃度は０．０１～５．０質量％が好ましい。タンパク質安定化効果が良好だからである。なお、安定化させるタンパク質の水溶液中の好ましい濃度は、対象のタンパク質によって大きく異なるため、対象とするタンパク質に合わせてその好適な濃度とすればよい。
　タンパク質の安定化に好適な温度は－３０℃～４０℃であり、特に好ましくは０℃～３０℃である。即ち、当該温度範囲内で、タンパク質と本発明のタンパク質安定化剤とを溶液中に共存させることにより、タンパク質を長期間安定に保管することができる。
　本発明のタンパク質安定化試薬は、タンパク質、水、及び本発明のタンパク質安定化剤を含有する溶液であり、該溶液中に本発明のタンパク質安定化剤が０．０１～５．０質量％含有されている。好ましくは、本発明のタンパク質安定化剤及びタンパク質が水に溶解された水溶液である。水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましい。
　タンパク質安定化試薬に含まれるタンパク質は、上記タンパク質安定化剤によって安定化可能なタンパク質である。また、タンパク質安定化試薬中のタンパク質の濃度は、タンパク質の種類等によって大きく異なり、例えば、１０-15～１質量％の範囲で安定化させるタンパク質や、試薬の使用目的に合わせて調整することが好ましい。
　本発明のタンパク質安定化剤は、タンパク質の酵素活性、抗体活性、抗原性等の生理活性を失わせる条件でなければ、上記したように通常この分野で用いられる緩衝液を併用使用することができる。従って、タンパク質、水、本発明のタンパク質安定化剤、及び緩衝液を含有するタンパク質安定化試薬とすることができる。或いは、タンパク質及びタンパク質安定化剤を緩衝液に溶解させてタンパク質安定化試薬とすることもできる。
　併用使用可能な緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。
　更に、本発明の目的を阻害しない範囲で、通常この分野で用いられる他の試薬類や化合物等を併用使用してもよい。即ち、本発明のタンパク質安定化試薬は、タンパク質、水、本発明のタンパク質安定化剤以外に、これらの試薬類や化合物等を含有してもよい。これらの試薬類や化合物等として、例えば、ポリオール、ポリエーテル、安定化対象のタンパク質以外のタンパク質、塩類、界面活性剤、生化学試薬、防腐剤、有機溶剤等が挙げられる。ポリオールとしては、グリセロール、スクロース、グルコース等が挙げられる。ポリエーテルとしては、ポリオキシエチレングリコール等が挙げられる。安定化対象のタンパク質以外のタンパク質としては、血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。塩類としては、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、ヒスチジン等のアミノ酸及びアミノ酸塩類、ペプチド類、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩等の無機塩類、トリスヒドロキシエチルアミノメタン、エチレンジアミン四酢酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸等の有機塩類等が挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノアルキルエーテル、アルキルベタイン等が挙げられる。生化学試薬としては、フラビン類、コリパーゼ等の補酵素、ヌクレオシド、ヌクレオチド等の核酸類等が挙げられる。防腐剤としては、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸製剤、デヒドロ酢酸製剤、プロクリン製剤等が挙げられる。有機溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、イソアミルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、フェノール等が挙げられる。
　本発明のタンパク質安定化剤の使用温度としては、上記したようにタンパク質安定化効果の点で、－３０℃～４０℃が好ましく、０℃～３０℃がより好ましい。従って、本発明のタンパク質安定化試薬の保管温度も－３０℃～４０℃が好ましく、０℃～３０℃がより好ましい。なお、０℃以下で保管する場合は、グリセロール等の凍結防止効果のある有機溶媒を添加することが好ましい。
　以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
＜共重合体の合成＞
　合成例１～４に示すように、本発明のタンパク質安定化剤として共重合体１及び２を合成し、比較例のタンパク質安定化剤として共重合体３及び４を合成した。合成例１～４では以下の単量体を使用した。
・単量体ａ；２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以後、ＭＰＣと略称する）
・単量体ｂ；グリセリンモノメタクリレート（以後、ＧＬＭと略称する）
・単量体ｃ；メタクリル酸ｎ－ブチル（以後、ＢＭＡと略称する）
・単量体ｘ；単量体ａ～ｃ以外の単量体であるメタクリル酸（以後、ＭＡｃと略称する）
合成例１（共重合体１の合成）
　８．４ｇのＭＰＣ、４．５ｇのＧＬＭ、及び２．１ｇのＢＭＡを重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として０．１４７ｇの２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（以後、ＡＩＢＮと略称する）を加え、重合溶媒として４２．５ｇの精製水と４２．５ｇのエタノールを加えた。即ち、単量体のモル比は、ＭＰＣ／ＧＬＭ／ＢＭＡ＝４０／４０／２０であった。反応容器内を十分に窒素置換した後、５５℃で５時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して、白色粉末状の共重合体１を得た。
　得られた共重合体１をリン酸生理緩衝食塩水に溶解し、この溶液のゲルろ過クロマトグラフィー（以下ＧＦＣと記載）分析を行った。その結果、共重合体１の重量平均分子量は、ポリエチレングリコール換算で９８，０００であった。なお、ＧＦＣ分析は以下の条件で行った。
　システム：高速液体クロマトグラフィーシステムＣＣＰＳ８０２０シリーズ（東ソー株式会社製）
　カラム：ＳＢ－８０２．５　ＨＱ及びＳＢ－８０６ＭＮ　ＨＱを直列に接続
　溶離液：２０ｍＭリン酸バッファー
　検出器：ＲＩ及びＵＶ（波長２１０ｎｍ）
　流速：０．５ｍＬ／分
　測定時間：７０分
　注入量：１００μＬ
　ポリマー濃度：０．１重量％
　カラムオーブン温度：４５℃
合成例２（共重合体２の合成）
　１１．４ｇのＭＰＣ、３．１ｇのＧＬＭ、及び５．５ｇのＢＭＡを重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として０．７３０ｇのＡＩＢＮを加え、重合溶媒として４０．０ｇの精製水と４０．０ｇのエタノールを加えた。即ち、単量体のモル比は、ＭＰＣ／ＧＬＭ／ＢＭＡ＝４０／２０／４０であった。反応容器内を十分に窒素置換した後、５５℃で５時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して、白色粉末状の共重合体２を得た。
　得られた共重合体２をリン酸生理緩衝食塩水に溶解し、この溶液のＧＦＣ分析を行った。その結果、共重合体２の重量平均分子量は、ポリエチレングリコール換算で２２，０００であった。なお、ＧＦＣ分析は合成例１と同様の条件で行った。
合成例３（共重合体３の合成）
　４．７ｇのＭＰＣ及び５．３ｇのＢＭＡを重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として０．２４４ｇのＡＩＢＮを加え、重合溶媒として２７．０ｇの精製水と６３．０ｇのエタノールを加えた。即ち、単量体のモル比は、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０であった。反応容器内を十分に窒素置換した後、５５℃で５時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して、白色粉末状の共重合体３を得た。
　得られた共重合体３をリン酸生理緩衝食塩水に溶解し、この溶液のＧＦＣ分析を行った。その結果、共重合体３の重量平均分子量は、ポリエチレングリコール換算で９３，０００であった。なお、ＧＦＣ分析は合成例１と同様の条件で行った。
合成例４（共重合体４の合成）
　６．０ｇのＭＰＣ及び４．０ｇのＭＡｃを重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として０．７８ｇのＡＩＢＮを加え、重合溶媒として９０．０ｇの精製水を加えた。即ち、単量体のモル比は、ＭＰＣ／ＭＡｃ＝３０／７０であった。反応容器内を十分に窒素置換した後、７０℃で６時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して、白色粉末状の共重合体４を得た。
　得られた共重合体４をリン酸生理緩衝食塩水に溶解し、この溶液のＧＦＣ分析を行った。その結果、共重合体４の重量平均分子量は、ポリエチレングリコール換算で６８０，０００であった。なお、ＧＦＣ分析は合成例１と同様の条件で行った。
　合成例１～４の単量体モル比及び重量平均分子量を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜室温保管条件におけるタンパク質安定化効果の評価試験＞
　共重合体１及び２を用いて実施例１－１～１－４のタンパク質安定化試薬を調製した。また、共重合体３及び４を用いて比較例１－１及び１－２のタンパク質安定化試薬を調製し、共重合体とは異なるタンパク質安定化剤を用いて比較例１－３及び１－４のタンパク質安定化試薬を調製した。比較例１－５ではタンパク質安定化剤を使用せず、タンパク質含有溶液を調製した。便宜上、比較例１－５のタンパク質含有溶液もタンパク質安定化試薬と称する。これらタンパク質安定化試薬を用い、下記の通り、室温保管条件下におけるタンパク質安定化効果の試験を実施した。
実施例１－１
タンパク質安定化試薬の調製
　ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＣＡＴ　ＮＯ．Ｄ１４０８、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体（ＣＡＴ　ＮＯ．１７０－６５１６、バイオラッド社製；以後、ＰＯＤ－ＩｇＧと略称する）をその最終濃度が０．００５体積％となるように、及び共重合体１の５質量％水溶液をその最終濃度が５０体積％（最終溶液中の共重合体１の濃度としては約２．５ｗ／ｖ％）となるように溶解し、タンパク質安定化試薬を調製した。なお、本願において、「ｗ／ｖ％」は「（質量／体積）％」を意味し、１００ｍｌの溶液中のある成分の質量をグラム（ｇ）で表したものである。例えば、「溶液が１．０ｗ／ｖ％の共重合体を含有する」とは、１００ｍｌの溶液が１．０ｇの共重合体を含有していることを意味する。
タンパク質安定化効果の評価試験
　調製したタンパク質安定化試薬を２５℃下でインキュベート保管し、インキュベートを開始した日を試験の「開始日」とし、開始日当日（インキュベート前）、１日後、３日後、及び６日後に下記試験方法によってタンパク質安定化効果を評価した。
　開始日及び各経過日に、タンパク質安定化試薬をポリスチレン製９６－ｗｅｌｌマイクロプレートに８μＬ／ｗｅｌｌで加え、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ）（ＣＡＴ　ＮＯ．５０－７６、ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＰＯＤ－ＩｇＧ（タンパク質）との発色反応を７分間行った。つづいて、２Ｎの硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止させた。この反応液について、波長４５０ｎｍに対する吸光度を測定することにより、ＰＯＤ－ＩｇＧの安定化効果（タンパク質安定化効果）を評価した。
　具体的には、タンパク質安定化試薬調製直後である開始日の吸光度と、各経過日の吸光度とを下記方法により測定して、下記数式［１］により酵素活性残存率（％）を算出した。タンパク質安定化効果は、当該酵素活性残存率（％）により評価した。酵素活性残存率の値が高いほどタンパク質安定化効果が高いことを表す。なお、開始日の酵素活性残存率は、下記数式１の分母分子とも「開始日の吸光度」であるので、１００％である。また、酵素活性残存率８０％以上を維持していた日数を、高活性維持期間（日間）とした。酵素活性残存率及び高活性維持期間の測定結果を表２に示す。
吸光度測定方法
　下記数式［１］の酵素活性残存率を算出するためのタンパク質安定化試薬の吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｍａｘ　Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用して、エンドポイント波長４５０ｎｍの条件で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
実施例１－２
　共重合体１の５質量％水溶液をその最終濃度が１０体積％（最終溶液中の共重合体１の濃度としては約０．５ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
実施例１－３
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、共重合体２の５質量％水溶液を用いたこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
実施例１－４
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、共重合体２の５質量％水溶液をその最終濃度が１０体積％（最終溶液中の共重合体２の濃度としては約０．５ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
比較例１－１
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、共重合体３の５質量％水溶液を用いたこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
比較例１－２
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、共重合体４の５質量％水溶液を用いたこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
比較例１－３
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、スクロースを最終濃度が１０ｗ／ｖ％となるように使用したこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
比較例１－４
　共重合体１の５質量％水溶液の代わりに、ＢＳＡの５質量％水溶液を用いたこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表２に示す。
比較例１－５
　ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にＰＯＤ－ＩｇＧのみを添加し、ＰＯＤ－ＩｇＧの最終濃度が０．００５体積％となるように精製水で濃度調整してタンパク質安定化試薬を調製し、実施例１－１と同様に評価試験を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表２から明らかなように、実施例１－１～１－４のタンパク質安定化試薬は、比較例１－１～１－５のタンパク質安定化試薬と比べ、室温保管条件におけるタンパク質（ＰＯＤ－ＩｇＧ）の安定化効果が顕著に優れている。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加した値を示す場合があるが、測定誤差であると思われる。
＜冷蔵保管条件におけるタンパク質安定化効果の評価試験＞
　下記の通り、タンパク質安定化試薬を調製し、冷蔵保管条件下におけるタンパク質安定化効果の試験を実施した。
実施例２－１
　共重合体１の５質量％水溶液をその最終濃度が１０体積％（最終溶液中の共重合体１の濃度としては約０．５ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例１－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製した。インキュベート保管温度を４℃とし、タンパク質安定化効果の評価を実施する経過日を、開始日当日、１週間後、２週間後、４週間後、８週間後、１５週間後、３０週間後、及び６０週間後に変更したこと以外は実施例１－１と同様に、評価試験を行った。結果を表３に示す。なお、冷蔵保管条件での評価試験における高活性維持期間の単位は「週間」とした。
実施例２－２
　共重合体１の５質量％水溶液をその最終濃度が２体積％（最終溶液中の共重合体１の濃度としては約０．１ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例２－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表３に示す。
実施例２－３
　共重合体２の５質量％水溶液をその最終濃度が１０体積％（最終溶液中の共重合体２の濃度としては約０．５ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例２－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表３に示す。
実施例２－４
　共重合体２の５質量％水溶液をその最終濃度が２体積％（最終溶液中の共重合体２の濃度としては約０．１ｗ／ｖ％）となるように溶解したこと以外は実施例２－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表３に示す。
実施例２－５
　共重合体２の５質量％水溶液をその最終濃度が２体積％（最終溶液中の共重合体２の濃度としては約０．１ｗ／ｖ％）となるように溶解し、更にスクロースをその最終濃度が１０質量％となるように溶解したこと以外は実施例２－１と同様に、タンパク質安定化試薬を調製し、評価試験を行った。結果を表３に示す。
比較例２－１～２－５
　比較例２－１～２－５のタンパク質安定化試薬をそれぞれ比較例１－１～１－５と同様にして調製し、実施例２－１と同様に評価試験を行った。結果を表３に示す。
[規則26に基づく補充 04.06.2018]　
Figure WO-DOC-TABLE-3
　表３から明らかなように、実施例２－１～２－５のタンパク質安定化試薬は、比較例２－１～２－５のタンパク質安定化試薬と比べ、冷蔵保管条件におけるタンパク質（ＰＯＤ－ＩｇＧ）の安定化効果が顕著に優れている。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加した値を示す場合があるが、測定誤差であると思われる。
　本発明のタンパク質安定化剤、及びタンパク質安定化剤を含むタンパク質安定化試薬は、タンパク質が安定に生理活性を維持することが求められる分野、好適には臨床検査、体外診断、コンパニオン診断、食品分析、環境分析等の分野における、酵素免疫測定法、免疫比濁法、核酸分析、免疫染色等の生化学測定等への展開が期待される。またこれらの分野に限らず、医療機器、製薬、バイオセンシング等、幅広い分野への応用が期待できる。

Claims (4)

  1. 　単量体ａ、単量体ｂ、及び単量体ｃを共重合した共重合体からなるタンパク質安定化剤であって、
    　前記単量体ａが下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ1は水素原子又はメチル基である。］で表され、
    　前記単量体ｂが下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（２）中、Ｒ2は水素原子又はメチル基であり、Ｒ3は２個以上の水酸基を有する炭素数３～６のアルキル基である。］で表され、
    　前記単量体ｃが下記式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基であり、Ｒ5は炭素数２～１８のアルキル基である。］で表される、
    　タンパク質安定化剤。
  2. 　前記共重合に用いる前記単量体ａ、前記単量体ｂ、及び前記単量体ｃの合計を１００モル％とするとき、前記単量体ａの割合が１０～８０モル％であり、前記単量体ｂの割合が１０～８０モル％であり、前記単量体ｃの割合が１０～８０モル％である、請求項１に記載のタンパク質安定化剤。
  3. 　前記共重合体の重量平均分子量が１，０００～７００，０００である、請求項１又は２に記載のタンパク質安定化剤。
  4. 　タンパク質、水、及び請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質安定化剤を含有し、
    　前記タンパク質安定化剤の含有量が０．０１～５．０質量％である、
    　タンパク質安定化試薬。
PCT/JP2018/019368 2017-05-25 2018-05-18 タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬 WO2018216628A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019520225A JP7226310B2 (ja) 2017-05-25 2018-05-18 タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬
CN201880033772.1A CN110650969B (zh) 2017-05-25 2018-05-18 蛋白质稳定剂及蛋白质稳定试剂
US16/616,656 US11261275B2 (en) 2017-05-25 2018-05-18 Protein stabilizer and protein stabilization reagent

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-103514 2017-05-25
JP2017103514 2017-05-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018216628A1 true WO2018216628A1 (ja) 2018-11-29

Family

ID=64396479

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/019368 WO2018216628A1 (ja) 2017-05-25 2018-05-18 タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11261275B2 (ja)
JP (1) JP7226310B2 (ja)
CN (1) CN110650969B (ja)
WO (1) WO2018216628A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923292A (zh) * 2019-11-15 2020-03-27 中山市创艺生化工程有限公司 一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用
JP2020122055A (ja) * 2019-01-29 2020-08-13 株式会社日本触媒 繊維強化材料、及び繊維強化材料の製造方法
JP2021042166A (ja) * 2019-09-11 2021-03-18 日油株式会社 蛋白質安定化剤および安定化された蛋白質を含有する試薬、ならびに試薬に含有される蛋白質の安定化方法
JP2021143224A (ja) * 2020-03-10 2021-09-24 日油株式会社 タンパク質安定化剤およびタンパク質含有製剤
WO2022163507A1 (ja) 2021-01-28 2022-08-04 日油株式会社 核酸増幅用の組成物
WO2022163506A1 (ja) 2021-01-28 2022-08-04 日油株式会社 核酸増幅用の増感剤、核酸増幅用の組成物および検査キット
WO2023054340A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 日油株式会社 核酸増幅促進剤およびそれを用いる検査方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006305401A (ja) * 2005-04-26 2006-11-09 Nof Corp 気相浄化体、気相浄化ユニット及び気相浄化方法
JP2007054516A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Nof Corp 気相浄化体、気相浄化ユニット及び気相浄化方法
JP2008105358A (ja) * 2006-10-27 2008-05-08 Nof Corp 感圧トリガー式酵素発色材、発色性シート、その製造方法及び用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3782851B2 (ja) 1996-07-31 2006-06-07 日本油脂株式会社 蛋白質の安定化方法および組成物
JP3976257B2 (ja) 2002-09-17 2007-09-12 栄研化学株式会社 蛋白質の安定化方法
JP5246400B2 (ja) * 2007-06-13 2013-07-24 Ｊｓｒ株式会社 タンパク安定化剤
EP3260862B1 (en) 2015-02-19 2019-10-23 National University Corporation Kyoto Institute of Technology Method for suppressing protein adsorption

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006305401A (ja) * 2005-04-26 2006-11-09 Nof Corp 気相浄化体、気相浄化ユニット及び気相浄化方法
JP2007054516A (ja) * 2005-08-26 2007-03-08 Nof Corp 気相浄化体、気相浄化ユニット及び気相浄化方法
JP2008105358A (ja) * 2006-10-27 2008-05-08 Nof Corp 感圧トリガー式酵素発色材、発色性シート、その製造方法及び用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAKAKI, SHUJIRO: "MPC polymer as a substitute for protein in the field of clinical diagnostic agent", SCIENCE AND INDUSTRY, vol. 79, no. 4, 2005, pages 188 - 193 *
SEO, J. -H. ET AL.: "Conformational stability of proteins conjugated with water-soluble phospholipid polymer from heat-induced denaturation: Effect of the hydrophilicity of the polymer materials", TRANSACTIONS OF THE ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOMATERIALS, vol. 32, no. 2, 2010, pages 678 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020122055A (ja) * 2019-01-29 2020-08-13 株式会社日本触媒 繊維強化材料、及び繊維強化材料の製造方法
JP7264368B2 (ja) 2019-01-29 2023-04-25 株式会社日本触媒 繊維強化材料、及び繊維強化材料の製造方法
JP2021042166A (ja) * 2019-09-11 2021-03-18 日油株式会社 蛋白質安定化剤および安定化された蛋白質を含有する試薬、ならびに試薬に含有される蛋白質の安定化方法
JP7294012B2 (ja) 2019-09-11 2023-06-20 日油株式会社 蛋白質安定化剤および安定化された蛋白質を含有する試薬、ならびに試薬に含有される蛋白質の安定化方法
CN110923292A (zh) * 2019-11-15 2020-03-27 中山市创艺生化工程有限公司 一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用
CN110923292B (zh) * 2019-11-15 2024-03-29 中山市创艺生化工程有限公司 一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用
JP2021143224A (ja) * 2020-03-10 2021-09-24 日油株式会社 タンパク質安定化剤およびタンパク質含有製剤
JP7419891B2 (ja) 2020-03-10 2024-01-23 日油株式会社 タンパク質安定化剤を含有するタンパク質含有製剤および臨床検査試薬
WO2022163507A1 (ja) 2021-01-28 2022-08-04 日油株式会社 核酸増幅用の組成物
WO2022163506A1 (ja) 2021-01-28 2022-08-04 日油株式会社 核酸増幅用の増感剤、核酸増幅用の組成物および検査キット
WO2023054340A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 日油株式会社 核酸増幅促進剤およびそれを用いる検査方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110650969A (zh) 2020-01-03
JP7226310B2 (ja) 2023-02-21
JPWO2018216628A1 (ja) 2020-04-23
US11261275B2 (en) 2022-03-01
CN110650969B (zh) 2023-07-07
US20200102415A1 (en) 2020-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7226310B2 (ja) タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬
EP1314982B1 (en) Highly reproducible agglutination immunoassay method and reagents
JP2020100652A (ja) 周囲温度における血液サンプル中の変性されていないポリペプチド、核酸、およびエキソソームの安定化
US11009505B2 (en) Reagent diluent
US20140113311A1 (en) Agglutination enhancer
JP7093975B2 (ja) 両性イオンポリマー、その製造方法、及び両性イオンポリマーを含むタンパク質安定化剤
US20010026927A1 (en) Measuring method and measuring reagent of C-reactive protein
CN106996978A (zh) α2巨球蛋白检测试剂盒及其制备方法
US20040157276A1 (en) Agglutination accelerator for immunological measurement
US20100016506A1 (en) Protein stabilizing agent
JP2021181929A (ja) Ａｐｔｔ測定試薬用添加剤、ａｐｔｔ測定試薬、ａｐｔｔ測定用試薬キットおよびａｐｔｔ測定法
US9879250B2 (en) Protein-stabilizing agent and protein-stabilizing method
JP7294012B2 (ja) 蛋白質安定化剤および安定化された蛋白質を含有する試薬、ならびに試薬に含有される蛋白質の安定化方法
JP3782851B2 (ja) 蛋白質の安定化方法および組成物
JP6085983B2 (ja) ブロッキング剤、標的物質に対する抗原または抗体が固定化された担体、これを含む体外診断用試薬およびキット、並びに標的物質の検出方法
JP7419891B2 (ja) タンパク質安定化剤を含有するタンパク質含有製剤および臨床検査試薬
CN112816684B (zh) 血清淀粉样蛋白a的校准品稀释液、其制备方法及其应用
CN112240931B (zh) 一种免疫比浊试剂盒
US20220026440A1 (en) Container and method for storing, pretreating, and analyzing biomaterial
JP2020186912A (ja) 免疫凝集の検出又は測定方法
JP4826293B2 (ja) 総蛋白質の定量方法およびそれに用いる総蛋白質定量用キット
JP6803371B2 (ja) 蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法
JP6051903B2 (ja) ラテックス凝集反応用凝集促進剤、標的物質の検出方法および標的物質の検出に用いるためのキット
JP7274272B2 (ja) 生体成分測定試薬及び測定方法
US20210140951A1 (en) Aptamer based methods for protein detection

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18805450

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019520225

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18805450

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1