CN114774511A - 检测血液样本中镁离子的反应液、干试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测血液中镁离子的干试纸及其制备方法，所述干试纸依次包括上支持层，扩散层，沉淀层，遮光层，反应层，下支持层；所述遮光层为经十二烷基聚乙二醇醚水溶液涂布的无纺布；所述反应层经过反应液处理，所述反应液包括A组分和B组分，所述A组分包括10KU～25KU过氧化物酶、3.6KU～10KU甘油‑3‑磷酸氧化酶，0.3g～2g甘油，2g～4g三磷酸腺苷，5KU～12KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分包括0.04g～0.1g DAOS和0.04g～0.1g 4‑AAP的TES缓冲溶液。本发明所述干试纸能够最大程度地减低红细胞的影响，直接检测血液中的镁离子浓度，且检测结果准确，特异性高。

Description

检测血液样本中镁离子的反应液、干试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于体外检测技术，涉及到一种检测血液样本中镁离子的反应液、干试纸及其制备方法。
背景技术
镁是一种在生物体内广泛存在的一种金属离子，是影响各种酶活性的必需离子。其在舒张血管、凝血和保护血脑屏障(BBB)的三个关键生理机制中显得非常重要，这使得对镁的测定成为重要的临床诊断项目。目前测定镁离子的方法一般有离子选择电极法、原子吸收光度法(AAS)、分光光度法、染料比色法等。其中AAS法的特异性最好，最准确，但价格仪器价格昂贵，不易自动化操。染料比色法一般是在碱性环境下，基于染料与镁离子结合而发生颜色改变建立的，但该方法容易受pH变化的影响，且容易受到其他阳离子等的干扰，在增加稳定性过程中，甚至需要加入剧毒剂氰化物。
使用干试纸法测定镁离子的方法具有简单便捷的优势。已存在的干试纸测定镁含量的方法，通常是在一定条件下，镁与染料络合剂中的染料络合形成有颜色的络合物，该方法简单，但一样容易受其他物质如钙等干扰，且目前这种方法多使用血清或血浆进行测定，测定前需要对样本进行处理，操作不便捷性给临床使用带来了不便。
专利US5397710公开了一种用于全血的干测试片，具有分离血细胞的功能。该方法使用了络黑T、偶氮胂Ⅰ、羟基萘酚蓝等染料为指示剂实现定量检测，然而，染料变色会受到诸多因素的干扰，比如钙等其他离子，虽然方法中添加了掩蔽剂GEDTA，但若要在干扰物质浓度高时达到掩蔽作用，势必需要加入大量的掩蔽剂。大量的掩蔽剂存在下，在未进行与镁的染色之前，就能观察到较高水平的染色。也就是说，该方法存在背景信号值高的缺陷，在待检测样本中镁离子浓度较低时，使得检测是准确性堪忧。且染料显色的特异性较差，消除所有干扰来实现特异性识别待检测物质是较为困难的。
专利CN1168977A申请了题为“用于测定生物体液中镁的测试片”，发明了一种用于测定生物体液中镁的测试片，该测试片提供的一种表现出低背景值的镁测试方法，在整个测定范围内具有非常好的测定准确度，不受钙等的干扰，且具有较好的储藏稳定性。测试片试剂成分主要为邻甲酚酞配位酮、离子型去污剂等，测试片包含具有检测区的不透水支持体，其中检测区含有样品保留层和粘合层。但遗憾的是，该发明无法应用于未经前处理的全血样本。因为全血样本中含有血细胞，一般对测试效果的影响很大。
有些检测试纸，通过反应基层、反应层、滤血层和吸样层构成的一个虹吸体系，这种结构具有一定的抗干扰能力，进一步保证了快速检测样本的需求。但这种结构的试纸在进行光信号检测时，无法消除位于滤血层中血细胞的红色对检测光的影响，使得检测信号受到干扰，影响最终的检测结果准确性。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种检测全血样本中镁离子的干试纸，该试纸条能够最大程度地减低红细胞的影响，不仅能够检测血清、血浆，还能直接检测全血样本中的镁离子浓度，且检测结果准确，特异性高。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测血液样本中镁离子的干试纸，依次包括上支持层，扩散层，沉淀层，遮光层，反应层，下支持层；
所述遮光层为经质量体积比1g/100ml～2g/100ml的十二烷基聚乙二醇醚水溶液涂布过的无纺布；
本发明所述反应层为经反应液处理的尼龙材料、或带衬底的硝化纤维素，所述反应液包括和A组分B组分，所述A组分包括含有10KU～25KU过氧化物酶、3.6KU～10KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.3g～2g甘油，2g～4g三磷酸腺苷，5KU～12KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分包括含有0.04g～0.1g N-乙基甲基苯胺衍生物和0.04g～0.1g4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
在其中一些实施例中，所述A组分包括含有12KU～16KU过氧化物酶、4KU～5KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.35g～0.8g甘油，2.2g～3g三磷酸腺苷，6KU～9KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分包括含有0.05g～0.7g N～乙基甲基苯胺衍生物和有0.05g～0.07g N-乙基甲基苯胺衍生物和0.05g～0.07g 4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
在其中一些优选的实施例中，所述A组分包括含有14KU～15KU过氧化物酶、4.5KU～5KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.45g～0.52g甘油，2.5g～2.8g三磷酸腺苷，7KU～8KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分包括含有0.05g～0.07g的N-乙基甲基苯胺衍生物和0.05g～0.07g的4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
在其中一些优选的实施例中，所述A组分包括含有14.5KU±0.1KU过氧化物酶，4.84KU±0.05KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.49g±0.01g甘油，2.63g±0.05g三磷酸腺苷,7.23KU±0.05KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分包括含有0.06g±0.005g的N-乙基甲基苯胺衍生物,和0.06g±0.005g 4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
在其中一些实施例中，所述制备遮光层的无纺布重量是5g/m2～40g/m2，进一步优选为8g/m2～15g/m2，9g/m2～12g/m2,更优选10g/m2。
在其中一些实施例中，处理无纺布的十二烷基聚乙二醇醚水溶液的浓度为0.8g/100ml～1.2g/100ml，进一步优选为0.9g/100ml～1.1g/100ml，更优选为1g/100ml。
在其中一些实施例中，所述扩散层为玻璃纤维制备而成，优选其厚度为355.6μm～508.0μm，孔径0.5μm～1.0μm，更优选厚度355.6μm～450μm，孔径为0.8μm～1.0μm。
在其中一些实施例中，所述沉淀层为不对称膜材制备而成，所述不对称膜材为孔径0.05μm～0.8μm聚醚砜材料，优选孔径为0.45μm～0.8μm。
在其中一些实施例中，所述沉淀层经0.1g/100ml～2g/100ml，优选0.8g/100ml～1.2g/100ml，更优选1g/100ml的表面活性剂水溶液进行预处理，按50mL/m2的量进行涂布，干燥。
所述血液样本，包括血清样本，血浆样本或全血样本。
本发明的另一目的是提供上述检测全血样本中镁离子的干试纸的制备方法。
上述检测全血样本中镁离子的干试纸的制备方法，包括以下步骤：
制备扩散层，
制备沉淀层，
制备遮光层，
制备反应层：先使用B组分进行包被，再于30℃～50℃下干燥30min～120min；然后使用A组分进行包被，再于30℃～50℃下干燥30min～120min；
然后按照疏水性材料板制备的上支持层，扩散层，沉淀层，遮光层，反应层，疏水性材料板制备的下支持层顺序依次进行粘贴组装，即得。
在其中一些实施例中，所述反应层的制备为：先使用B组分进行包被，30℃～40℃下干燥40min～60min；然后使用A组分进行包被，再与30℃～40℃下干燥60min～90min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开发了一种将镁离子作为甘油激酶的激活剂进行检测的方法。在检测原理上，采用有酶法检测原理，减少离子干扰；在结构上，通过设置合适的遮光层，以及配合摸索得到的合适溶液处理的反应层，制备得到可用于直接测试血液样本中镁离子含量的试纸条，其不仅能够测试血清、血浆，还可以在不离心的情况下测试全血，避免检测过程中红细胞的影响，有效提高检测的准确度和特异性，有利于临床大规模检测使用。
附图说明
图1是本发明所述试纸条的结构示意图。
图2是实施例4中检测结果相关性分析结果示意图。
图3是实施例5中检测结果相关性分析结果示意图。
图4是实施例6中4例样本检测的原始信号值进行分析的结果示意图。
图5是实施例7中遮光层的位置对检测结果的影响的示意图。
附图标记：上支持层1，扩散层2，沉淀层3，遮光层4，反应层5，下支持层6，加样孔7，测试孔8。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在全血检测中，最大的干扰是红细胞和溶血后的红细胞释放的物质，本发明通过对扩散层材料的选择，选择能够捕捉红细胞的材料，同时对材料进行处理降低了红细胞通过扩散层发生溶血的概率；沉淀层具有截留扩散层未捕捉红细胞的作用，同时也可以吸附一些大分子，内源性物质减少对测试的干扰；遮光层一方面可以保证仪器检测的光线穿透不了遮光层，检测不到沉淀层的红细胞，降低红细胞的干扰，使入射光在反应层最深到遮光层，就会发生反射，另一方面对于轻微溶血的样本，遮光层对溶血的样本具有吸附功能，使溶血后的血红蛋白在遮光层被阻截，不会影响反应层的反应，从而提高低值的准确度。
检测原理：将适量样本加入到试纸条的加样孔后，通过扩散层均匀渗透到反应层中反应。样本中的Mg2+与ATP结合形成复合物，甘油在甘油激酶(GK)作用下被Mg-ATP磷酸化，生成L-a-甘油磷酸，L-a-甘油磷酸在3-磷酸甘油氧化酶(GPO)作用下氧化产生磷酸二羟基丙酮和H2O2，最后，在过氧化物酶(POD)作用下，指示剂(还原态)被H2O2氧化生成有色产物，颜色变化与样本中的镁浓度成正比，在610nm波长处检测镁的浓度，单位以mmol/L显示，反应原理如下:
Figure BDA0003592890090000061
Figure BDA0003592890090000062
Figure BDA0003592890090000063
本发明所述试纸结构依次为：上支持层1，扩散层2，沉淀层3，遮光层4、反应层5，下支持层6；在上支持层中设有加样孔7，在下支持层中设有测试孔8。
所述上支持层1和下支持层(6)同为疏水性材料板，如聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯(PC)、聚酰胺酯、聚醇酯或聚酯。优选为聚酯，进一步优选为PET基板。
所述扩散层为玻璃纤维，厚度为355.6μm～508.0μm，孔径0.5μm～1.0μm，优选厚度355.6μm～450μm，孔径为0.8μm～1.0μm。
玻璃纤维的厚度影响样本量，越厚样本量越大，玻纤材料滤血主要是红细胞可以吸附在玻纤纤维上，孔径决定全血中血清或者血浆向下渗透的速度，决定反应的时长，孔径越小，血清或者血浆向下渗透的速度越慢，反应时长就越长。
沉淀层为不对称膜材制备，如聚醚砜材料，孔径0.05μm～0.8μm，优选孔径为0.45μm。
遮光层：选用无纺布，重量是5g/m2～40g/m2，优选8g/m2～15g/m2，更优选9g/m2～11g/m2，最优选10g/m2。
无纺布越重，其厚度越厚和致密程度越大，都会影响样本的用量。恰当的厚度对反应时长有好处，从而也影响反应的结果。
反应层：为尼龙材料或带衬底的硝化纤维素材料，优选厚度为185μm±20.0μm。
制备反应液：将试剂1～5按用量比例使用试剂8溶解，成为溶液A；将试剂6～7按用量使用试剂8溶解，成为溶液B；
反应层先使用溶液B进行包被处理。每个测试条的反应层纸条被量为5μL～10μL，最佳为6.5μL的B溶液进行包被处理，然后在30℃～50℃下干燥30min～120min；然后使用溶液A进行包被处理：每个测试条的反应层纸条包被量为5μL～10μL，最佳为6.5μL的A溶液进行处理，然后在30℃～50℃下干燥30min～120min处理。
遮光层:100mL纯水中加入1g Brij35(十二烷基聚乙二醇醚，或称聚氧)，搅拌均匀，对无纺布浸泡处理。
扩散层制备：使用表面活性剂(例如Tween20、Triton～100或Brij35))与氯化钠、牛血清白蛋白BSA按量用水溶解后进行预处理。按50mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后待用。
表面活性剂的浓度范围为质量体积比0.01％～1％，进一步优选为0.05％～0.15％，在其中一个实施例中，最佳用量为0.1％，氯化钠浓度范围为质量体积比0.5％～1％，最佳用量为0.85％(此浓度保持红细胞的渗透压，降低溶血)，BSA浓度范围为质量体积比3％～10％，最佳用量为7％(降低基质影响)。
沉淀层制备：用试剂九表面活性剂(例如Tween20、Triton-100或Brij35)用浓度为0.8g/100ml～1.2g/100ml，优选为1g/100ml后进行涂布预处理。按50mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后待用。
对所述试纸条各组层进行处理的混合试剂包括如下：试剂(反应层)：
试剂一：过氧化物酶；
试剂二：甘油-3-磷酸氧化酶；
试剂三：甘油；
试剂四：三磷酸腺苷；
试剂五：甘油激酶；
试剂六：新型Trinder's试剂N-乙基甲基苯胺衍生物：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(ADOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(ADPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐(ALPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)、N,N-二(4-磺丁基)-3,5-二甲基苯胺钠盐(MADB)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐一水合物(MAOS)，优选为DAOS；
试剂七：4-氨基安替比林(4-AAP)或3-甲基苯并噻唑砜腙(MBTH)；
试剂八：pH＝7.0～8.0的TES缓冲溶液(三羟甲基氨基甲烷)；
试剂九：表面活性剂(Tween20、Triton-100或Brij35)。
上述试剂的使用的量可以如下：
Figure BDA0003592890090000081
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中，所选的材料为：
所述上支持层和下支持层分别为PET基板。
扩散层为优选厚355.6μm～450μm，孔径为0.8μm～1.0μm的1660材料。
沉淀层为PALL不对称膜材，孔径为0.45的BTS材料。
遮光层：选用Ahlstrom的无纺布，10g/m2的3254材料。
反应层为优选厚度为185μm±20.0μm的
Figure BDA0003592890090000082
A材料。
实施例1
本实施例所述检测血液样本中镁离子的干试纸的制备方法，包括如下：
步骤一、制备扩散层(1660材料)：取0.85g氯化钠、7gBSA、0.1g表面活性剂Triton-100，使用100mL纯水搅拌溶解后，按50mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后，裁成7mm/条的扩散层，待用。
步骤二、制备沉淀层(BTS材料)：用1g表面活性剂Brij35用100mL纯水搅拌溶解后，按50mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后，裁成10mm/条的沉淀层，待用。
步骤三、制备遮光层(3254材料)：用1g表面活性剂Brij35(十二烷基聚乙二醇醚)用100mL纯水搅拌溶解后，按20mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后，裁成10mm/条的遮光层，待用。
步骤四、制备反应层(
Figure BDA0003592890090000091
A)：称取表1.1中试剂1～5相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为A溶液，待用；称取表1.1中试剂6～7相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为B溶液，待用。
每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的B溶液进行包被处理，然后在37℃下干燥90min处理；干燥后，每个测试条的反应层5纸条使用6.5μL的A溶液进行包被处理，然后在37℃下干燥90min处理。
表1.1
序号 用量/100mL
试剂1 11.23KU
试剂2 3.78KU
试剂3 0.33g
试剂4 2.41g
试剂5 5.43KU
试剂6-DAOS 0.045g
试剂7-4-AAP 0.047g
步骤五、试纸制作：取所述上下支持层、反应层、遮光层、沉淀层、扩散层按，上支持层，扩散层，沉淀层，遮光层，反应层，下支持层顺序依次进行粘贴组装，得到测试卡成品1。
实施例2：
本实施例所述检测血液样本中镁离子的干试纸的制备方法，包括如下：
步骤一、制备扩散层：如实施例1所述方法进行。
步骤二、配制沉淀层：如实施例1所述方法进行。
步骤三、配制遮光层：如实施例1所述方法进行。
步骤四、配制反应层：称取例1中试剂1～5相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为A溶液，待用；称取表2.1中试剂6～7相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为B溶液，待用。每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的B溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min处理；干燥后，每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的A溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min处理。
表2.1
序号 用量/100mL
试剂1 23.44KU
试剂2 9.88KU
试剂3 0.48g
试剂4 3.85g
试剂5 11.56KU
试剂6-DAOS 0.092g
试剂7-4-AAP 0.091g
步骤五、试纸制作：取支持层、反应层、遮光层、沉淀层、扩散层按从下向上的顺序依次进行粘贴组装，得到测试卡成品2。
实施例3：
本实施例所述检测血液样本中镁离子的干试纸的制备方法，包括如下：
步骤一、如实施例1所述方法进行。
步骤二、如实施例1所述方法进行。
步骤三、配制遮光层：如实施例1所述方法进行。
步骤四、配制反应层：称取例1中试剂1～5相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为A溶液，待用；称取表3.1中试剂6～7相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为B溶液，待用。每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的B溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min；干燥后，每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的A溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min处理。
表3.1
序号 用量/100mL
试剂1 14.50KU
试剂2 4.84KU
试剂3 0.49g
试剂4 2.63g
试剂5 7.23KU
试剂6-DAOS 0.060g
试剂7-4-AAP 0.060g
步骤五、试纸制作：取支持层、反应层、遮光层、沉淀层、扩散层按从下向上的顺序依次进行粘贴组装，得到测试卡成品3。
实施例4：
将实施例1～3分别制备得到的试纸条成品1(实施例1)、成品2(实施例2)、成品3(实施例3)均与医院检测结果进行对比。将成品测试卡在万孚生物股份有限公司销售的干式生化仪DC-101进行测试，样本为随机抽取的有梯度的20例静脉全血，样本来源医院检验科，医院检测系统贝克曼全自动生化仪+迈克镁检测试剂盒，医院检测系统检测的样本为静脉全血离心所得的血浆(液体生化检测系统只能用离心/沉降后的血清或血浆进行测试，无法对全血进行测试)，本发明镁成品测试卡检测的是全血血样。
检测结果如下
检测结果
Figure BDA0003592890090000111
Figure BDA0003592890090000121
检测结果相关性分析，Y＝kX+b中，k越接近1，相关性R2越大，说明测试结果与参比试剂越接近，通过比较见下表，通过检测的数据表明实施例3的结果与医院检测值最接近，同时也与上述关键试剂组成的浓度筛选的结果一致，实施例3所制备得到的试纸条，效果最好。
Figure BDA0003592890090000122
实施例5
本实施例按实施例3所述方法制备具有遮光层的试纸条，且同时按照实施例3的方式进行没有遮光层的试纸条，其他参数不变，对血液样本进行检测。与医院结果进行对比。将成品试纸条在万孚生物销售的干式生化仪DC～101进行测试，样本为随机抽取的有梯度的20例静脉全血，样本来源医院检验科，医院检测系统贝克曼全自动生化仪+迈克镁检测试剂盒,医院检测系统检测的样本为静脉全血离心所得的血浆，本发明所述镁成品测试卡(试纸条)检测的是全血血样。
检测结果如下：
下表的检测结果表明，有遮光层可以提高低值端(0.60～1.10mmol/L为正常人的参考范围)的准确度，而无遮光层的检测明显偏高，受到了全血中红细胞对检测光的干扰。
Figure BDA0003592890090000131
进行相关性分析：有遮光层的试剂检测的结果与液体生化测试结果相关性更好，见下表。
Figure BDA0003592890090000141
实施例6：遮光层处理方式的影响
本实施例所述检测血液样本中镁离子的干试纸的制备方法，包括如下：
步骤一、如实施例1所述方法进行。
步骤二、如实施例1所述方法进行。
步骤三、1g表面活性剂Brij35、0.49g试剂3和2.63g试剂4用100mL纯水搅拌溶解后，按20mL/m2的量进行涂布，然后在37℃环境下干燥0.5h后，裁成10mm/条的遮光层，待用。
步骤四、配制反应层：称取例1中试剂1、2、5相应质量，加入到pH＝7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为A溶液，待用；称取表3.1中试剂6～7相应质量，加入到pH为7.2的0.5M TES缓冲液100mL进行搅拌半小时，使溶解，为B溶液，待用。每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的B溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min处理；然后使用溶液A进行处理。然后，每个测试条的反应层纸条使用6.5μL的A溶液进行处理，然后在37℃下干燥90min处理；然后使用溶液A进行处理。
Figure BDA0003592890090000142
Figure BDA0003592890090000151
检测结果如上表，检测的结果整体偏低，对其中有浓度梯度(0.62mmol/L、0.86mmol/L、1.01mmol/L、1.24mmol/L)的4例样本检测的原始信号值进行分析，见图4，当反应达到约250s～300s时，反应的曲线才是一条直线，反应的信号值与浓度才发生明显的变化，反应才趋于稳定，所以相对于120s的检测时间，300s的检测时间明显偏长。
发明人经过反复实验后发现，导致检测时间明显偏长原因可能为：反应层
Figure BDA0003592890090000152
A是一个多孔非对称材料，参与反应试剂包被在多孔面一侧，当待测物从上向下渗透到反应层后，在多孔区域会截留部分含待测物液体，这些液体能够快速溶解在反应层上的试剂，并且能够快速进行生化显色反应；反而，当将一些关键试剂放在遮光层上，当待测物从上向下渗透的过程中，不能瞬间将在遮光层上参与反应的关键试剂溶解，随待测物渗到反应层参与反应，但是随着时间的延长，反应层上多孔面上的液体的反渗作用会逐渐溶解遮光层上的试剂，让它们参与反应，而且也存在遮光层上的试剂也没有完全随液体渗下来问题，这就导致在遮光层放一些关键试剂反应后速率变缓。遮光层上并不能负载检测所需要的关键试剂成分。
实施例7
为了验证遮光层的位置是否有影响，本实施例按照实施例3的方式制备各层，组合时将沉淀层与遮光层的位置交换，制备成试纸，对全血样本进行测试，遮光层(下)是实施例3的制备方式，遮光层(上)是本实施例的制备方式，测试结果见下表
Figure BDA0003592890090000153
Figure BDA0003592890090000161
通过相关性分析，遮光层(上)的测试结果明显偏低，而且会出现阴阳不符情况(0.60mmol/L～1.10mmol/L为正常人的参考范围值)，说明本发明所述遮光层(上)此制备工艺会导致全血干扰，所述遮光层是一种厚度相对很薄的材料，当血样中红细胞较多时，所述遮光层会被瞬间着成红色，起不到遮光作用，同时当大量红细胞通过时干试纸时，所述遮光层也起不到滤血的作用，所以导致测试的结果与实施例5中没有遮光层一致，可见，遮光层的位置在所述干试纸的位置非常关键，否则就会没有起到相应作用。参见图5。
Figure BDA0003592890090000162
实施例8
通过实施例1、实施例2和实施例3研究中发现，反应液中组分的浓度会对产品性能产生很大的影响，发明人总结了以往开发干化学产品的经验，确定了反应层中的特殊酶(甘油-3-磷酸氧化酶、甘油激酶)和底物(甘油和三磷酸腺苷)的用量对检测结果有较大影响，于是分别对上述酶和底物进行了单因子实验，进行验证：
8.1甘油-3-磷酸氧化酶(试剂2)浓度研究
Figure BDA0003592890090000171
制作成干试纸，分别测试7个浓度线性校准品(血清基质)0.2mM,0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM、2.5mM和3.0mM 7个浓度。
校准品浓度mM A B C
0.20 0.21 0.51 0.24
0.50 0.5 0.52 0.54
1.00 0.87 0.98 0.95
1.50 1.34 1.54 1.47
2.00 1.95 2.05 1.94
2.50 2.47 2.64 2.52
3.00 2.51 3.12 2.96
A1和B1的溶液配方中甘油-3-磷酸氧化酶(试剂2)过高或者过低，会影响线性的区间，浓度高(B1配方)低值段区分不开，低度高(A1配方)高值段区分不开，合适试剂2的浓度对检测的线性影响较大。
8.2甘油(试剂3)浓度研究
Figure BDA0003592890090000181
制作成干试纸，分别测试7个浓度线性校准品(血清基质)0.2mM,0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM、2.5mM和3.0mM 7个浓度。
校准品浓度mM A2 B2 C2
0.20 0.18 0.22 0.21
0.50 0.41 0.48 0.55
1.00 0.9 0.97 1.04
1.50 1.41 1.51 1.53
2.00 1.81 1.92 1.94
2.50 2.32 2.43 2.52
3.00 2.65 2.81 3.04
甘油(试剂3)在反应中起到反应底物的作用，根据反应平衡理论，底物越多，反应越快，生成的产物就会越多，甘油(试剂3)浓度越高反应速度越快，但考虑到产品的成本和反应的时间，所以选择C2中甘油(试剂3)的浓度。
8.3三磷酸腺苷；(试剂4)浓度研究
Figure BDA0003592890090000182
Figure BDA0003592890090000191
8.4制作成干试纸，分别测试7个浓度线性校准品(血清基质)0.2mM,0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM、2.5mM和3.0mM 7个浓度。
校准品浓度mM A3 B3 C3
0.20 0.17 0.24 0.19
0.50 0.43 0.58 0.52
1.00 0.93 1.03 1.01
1.50 1.42 1.55 1.55
2.00 1.88 1.96 1.98
2.50 2.42 2.62 2.58
3.00 2.45 2.61 3.09
三磷酸腺苷(试剂4)在反应中首先与镁离子结合，这是反应的决定反应速度的一步，三磷酸腺苷(试剂4)越高反应速度越快，当底物足够的情况下，三磷酸腺苷(试剂4)结合镁离子形成的Mg-ATP越多，导致反应速度加快，显色的程度越深，超出了仪器读取信号的极限，导致实测信号的变化速率减低，使得高值测不上去，高值几乎无区分度，故选择C3中的三磷酸腺苷(试剂4)浓度。
甘油激酶(试剂5)浓度研究
Figure BDA0003592890090000192
制作成干试纸，分别测试7个浓度线性校准品(血清基质)0.2mM,0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM、2.5mM和3.0mM 7个浓度。
Figure BDA0003592890090000193
Figure BDA0003592890090000201
与甘油-3-磷酸氧化酶的浓度实验一致，A4和B4的溶液配方中甘油激酶(试剂5)过高或者过低，会影响线性的区间，浓度高(B4配方)低值段区分不开，低度高(A4配方)高值段区分不开，合适试剂5的浓度对检测的线性影响很大。
上述的实验验证结果表明，对于有底物参与的生化酶促反应，试剂中的主要成分的浓度非常重要，一个合适的浓度组合对于产品性能的提高能够起到关键的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (15)

1.一种制备干试纸的反应层的反应液，其特征是，所述反应液包括A组分和B组分，所述A组分为含有10KU～25KU过氧化物酶，3.6KU～10KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.3g～2g甘油，2g～4g三磷酸腺苷，5KU～12KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分为含有0.04g～0.1g N～乙基甲基苯胺衍生物和0.04g～0.1g 4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征是，所述A组分为含有12KU～16KU过氧化物酶，4KU～5KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.35g～0.8g甘油，2.2g～3g三磷酸腺苷，6KU～9KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分为含有0.05g～0.07g的N-乙基甲基苯胺衍生物和0.05g～0.07g的4～氨基安替比林的TES缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的反应液，其特征是，所述A组分为含有14KU～15KU过氧化物酶、4.5KU～5KU甘油-3-磷酸氧化酶，0.45g～0.52g甘油，2.5g～2.8g三磷酸腺苷，7KU～8KU甘油激酶的TES缓冲溶液；所述B组分为含有0.05g～0.07g的N-乙基甲基苯胺衍生物和0.05g～0.07g的4-氨基安替比林的TES缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的反应液，其特征是，N-乙基甲基苯胺衍生物选自以下中的至少一种：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N,N-二(4-磺丁基)-3,5-二甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐一水合物，更优选为N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐。
5.一种干试纸的反应层，其特征是，其为经权利要求1～4任一项所述的反应液包被处理的尼龙材料或硝化纤维素材料。
6.一种检测血液样本中镁离子的干试纸，其特征是，所述干试纸依次包括上支持层、扩散层、沉淀层、遮光层、权利要求5所述的反应层、下支持层；
所述遮光层为经质量体积比1g/100ml～2g/100ml的二烷基聚乙二醇醚水溶液涂布处理的无纺布。
7.根据权利要求6所述的干试纸，其特征是，所述无纺布的重量是5g/m2～40g/m2。
8.根据权利要求7所述的干试纸，其特征是，所述无纺布的重量为8g/m2～15g/m2’，更优选10g/m2。
9.根据权利要求6所述的干试纸，其特征是，所述处理无纺布的十二烷基聚乙二醇醚水溶液的体积浓度比为0.8g/100ml～1.2g/100ml，更优选为0.9g/100ml～1.1g/100ml。
10.根据权利要求6～9任一项所述的干试纸，其特征是，所述扩散层为玻璃纤维制备而成，优选其厚度为355.6μm～508.0μm，孔径0.5μm～1.0μm；更优选厚度355.6μm～450μm，孔径为0.8μm～1.0μm。
11.根据权利要求6～9任一项所述的干试纸，其特征是，所述沉淀层为不对称膜材制备而成，优选地，所述不对称膜材为孔径0.05μm～0.8μm聚醚砜材料，优选孔径为0.45μm～0.8μm。
12.根据权利要求6～9任一项所述的干试纸，其特征是，所述沉淀层经1g/100ml～2g/100ml，优选0.8g/100ml～1.2g/100ml浓度的表面活性剂水溶液进行预处理，按50mL/m2的量进行涂布，干燥。
13.根据权利要求6～9任一项所述的干试纸，其特征是，血液样本是血清样本、血浆样本、或全血样本，优选全血样本。
14.一种权利要求6～13任一项所述检测血液样本中镁离子的干试纸的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
制备扩散层，
制备沉淀层，
制备遮光层，
制备反应层：先使用B组分进行包被，于30℃～50℃下干燥30min～120min；然后使用A组分包被处理，再于30℃～50℃下干燥30min～120min；
然后按照疏水性材料板制备的上支持层、扩散层、沉淀层、遮光层、反应层、疏水性材料板制备的下支持层顺序依次进行粘贴组装，即得。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征是，所述反应层的制备为：先使用B组分进行包被，30℃～40℃下干燥40min～60min；然后使用A组分进行包被处理，再与30℃～40℃下干燥60min～90min。
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