JP2000258414A - 一体型多層化学分析要素および定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中のマグネシウムイオンを定量するため
の、グリセロールキナーゼとグリセロリン酸オキシダー
ゼを用いる酵素法を利用した、取扱いが簡便で、高感
度、かつ高精度な一体型多層化学分析要素、およびマグ
ネシウムイオンの定量方法を提供すること。 【解決手段】 光透過性支持体、グリセロールキナー
ゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼお
よび色素形成化合物を含む組成物を含有する試薬層、そ
してアデノシン−３−リン酸およびキレート剤を含有す
る多孔質材料からなる展開層をこの順に有する検体中の
マグネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グリセロールキナ
ーゼとグリセロリン酸オキシダーゼとを用いる酵素法に
よる、検体中のマグネシウムイオンを定量する一体型多
層化学分析要素、および定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マグネシウムイオンは、カリウムイオン
に次いで最も一般的な細胞内イオンである。また、マグ
ネシウムイオンは、エネルギー富化ホスフェートの移転
において、アデノシン−３−リン酸（以下「ＡＴＰ」と
略す。）の活性化剤として作用することによって、炭水
化物および脂質の代謝に重要な役割を果たす。さらに、
脂質、炭水化物およびタンパク質の代謝過程に含有され
る多くの酵素の活性化に必須である。体内におけるマグ
ネシウムイオンの量は、種々の病気診断の重要な情報で
ある。腸管での吸収不良、内分泌疾患、利尿剤の長期服
用等が原因となって、低マグネシウム血症あるいはマグ
ネシウム欠乏症をきたし、腎機能障害時では、高マグネ
シウム血症あるいはマグネシウム過剰症を引き起こすこ
とが知られている。そこで、病院等の検査室では、体
液、尿等の種々の検体中のマグネシウムイオンの量が頻
繁に測定されている。

【０００３】体液や尿中のマグネシウムイオンの定量方
法として、従来から乾式法あるいは湿式法による数種類
の方法が知られている。その中で、乾式法による定量方
法として、特公平５−１１９０８号の明細書には、試薬
層中にシアノホルマザンを存在させた、あるいはシアノ
ホルマザンに加えて、検体中の妨害イオンであるカルシ
ウムイオンを捕捉するカルシウムイオンキレート化剤を
存在させた一体型多層化学分析要素を用い、その分析要
素上にマグネシウムイオンを含む検体を点着させ、生成
したマグネシウムイオン−シアノホルマザン錯体の反射
濃度を測定して検体中のマグネシウムイオンを定量する
方法が開示されている。しかし、その方法は、シアノホ
ルマザンがマグネシウムイオンと錯体を形成するアルカ
リ条件下においては、シアノホルマザンそのものが不安
定であり、そのため分析要素の経時保存性に欠けると共
に、マグネシウムイオンの定量域が狭いという問題点を
有する。

【０００４】一方、特開平６−５９２４０号公報には、
酵素法を利用した、湿式法によるマグネシウムイオンの
定量方法が開示されている。この酵素法の原理は、ＡＴ
Ｐおよびグリセロールの存在下、検体にグリセロールキ
ナーゼおよびグリセロリン酸オキシダーゼを反応させ
て、生成した過酸化水素を発色原体と結合させて発色体
に導き、これを比色測定することによって検体中のマグ
ネシウムイオンを定量するものである。この定量方法で
は、反応系にキレート剤を添加することによって、マグ
ネシウムイオンを介してＡＴＰとキレート剤とを競合的
に拮抗させ、グリセロールキナーゼの基質であるＡＴＰ
−マグネシウムイオン複合体の生成量を適度に抑えるた
め、グリセロールキナーゼのマグネシウムイオンに対す
る高い親和性を解決することができる。従って、従来は
高濃度の尿検体を用いる場合にはその希釈操作を必要と
していたものを、この方法により、高濃度の尿検体でも
希釈することなく定量することができる。

【０００５】また、米国特許４８１８６９１号の明細書
には、上記と同じ酵素法によるマグネシウムイオンの湿
式の定量方法が開示されている。この方法では、反応系
のｐＨを５．５〜９．２の範囲に設定することによっ
て、グリセロールキナーゼのマグネシウムイオンに対す
る高い親和性を解決している。

【０００６】しかし、上記の二つの湿式法は、前記の乾
式法に比べて、簡便性、迅速性等の点で充分であるとは
言い難い。そこで、この酵素法を乾式法に利用すること
を考える。乾式法の分析器具として、フィルム状、シー
ト状等の一体型多層化学分析要素が実用化されている
が、例えばその分析要素の同一層に、ＡＴＰ、グリセロ
ール、発色原体、酵素およびキレート剤のすべてを含有
させてなる分析要素を用いたのでは、分析要素内でグリ
セロールキナーゼの基質となるマグネシウムイオンとＡ
ＴＰとの複合体が迅速に生成されず、分析精度や分析感
度の点で問題が残る。そこで、これらの問題点を解決で
きる一体型多層化学分析要素の開発が必要とされる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、検体
中のマグネシウムイオンを定量するための、グリセロー
ルキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼを用いる酵素
法を利用した、取扱いが簡便で、高感度、かつ高精度な
一体型多層化学分析要素、およびマグネシウムイオンの
定量方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者により、光透過
性支持体、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色素形成化合物を含
む組成物を含有する試薬層、そしてＡＴＰおよびカルシ
ウムイオンと特異的に結合するキレート剤を含有する多
孔質材料からなる展開層をこの順に有する検体中のマグ
ネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素が上記
記載の課題を解決できることが判明した。

【０００９】本発明のマグネシウムイオンの定量用一体
型多層化学分析要素の好ましい態様は、以下の通りであ
る。 （１）キレート剤が、エチレングリコールビス（２−ア
ミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸で
あることを特徴とするマグネシウムイオンの定量用一体
型多層化学分析要素。 （２）色素形成化合物が、ロイコ色素であることを特徴
とするマグネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析
要素。 （３）試薬層および展開層が、何れもｐＨ５〜７の範囲
にあることを特徴とするマグネシウムイオンの定量用一
体型多層化学分析要素。 （４）多孔質材料が、編み物であることを特徴とするマ
グネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素。

【００１０】本発明は、また、上記記載の一体型多層化
学分析要素上に、検体を点着させ、分析要素内の発色濃
度を測定することを特徴とする検体中のマグネシウムイ
オンの定量方法にもある。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、下記式で表されるグリ
セロールキナーゼおよびグリセロリン酸オキシダーゼを
用いる酵素法を利用する。この方法は、グリセロールお
よびグリセロールキナーゼの存在下、マグネシウムイオ
ンを含有する検体をＡＴＰと反応させ、グリセロール−
３−リン酸に導き、次いでこのものにグリセロリン酸オ
キシダーゼを反応させて、生成した過酸化水素を色素形
成化合物と反応させて発色体に導き、これを比色測定す
ることによって検体中のマグネシウムイオンを定量する
方法である。但し、下記式中、ＡＤＰはアデノシン−２
−リン酸を意味する。

【００１２】

【化１】

【００１３】図１に、本発明の代表的な一体型多層化学
分析要素の模式図を示す。分析要素は、光透過性支持体
（１１）、グリセロール、グリセロールキナーゼ、グリ
セロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色素
形成化合物からなる組成物を含有する試薬層（２１）、
並びにＡＴＰおよびカルシウムイオンと特異的に結合す
るキレート剤を含む多孔質材料からなる展開層（３１）
をこの順に有する。

【００１４】光透過性支持体は、水不浸透性の光透過性
支持体である。本発明に使用することができる水不浸透
性光透過性支持体としては、特開昭５５−１６４３５６
号公報等に記載されている多層化学分析要素の支持体に
用いられているものを使用することができる。支持体の
材質は、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等の親水性に乏しいある
いは疎水性のポリマー、または透明なガラスである。好
ましくは、ポリエチレンテレフタレートである。支持体
の厚さは、ポリマーの場合には、５０μｍ〜１ｍｍの範
囲にあることが好ましく、８０〜４００μｍの範囲にあ
ることがさらに好ましい。透明なガラスの場合には、１
００μｍ〜２ｍｍの範囲にあることが好ましく、１５０
μｍ〜１ｍｍの範囲にあることがさらに好ましい。

【００１５】支持体の表面は、必要により公知の物理化
学的処理（紫外線照射処理、コロナ放電処理、グロー放
電処理等）を行って、試薬層との接着力をさらに高める
ことができる。または、物理化学的処理を施し（あるい
は施さずに）、さらにゼラチン下塗り層を設けて試薬層
との接着力を高めることができる。

【００１６】試薬層は、グリセロール、グリセロールキ
ナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼおよび色素形成化合物を、親水性の被膜形成能を有す
るポリマーバインダの中に分散あるいは溶解してなる層
である。試薬層の厚さは、１〜５００μｍの範囲である
ことが好ましく、５〜３００μｍの範囲であることが特
に好ましい。

【００１７】親水性ポリマーバインダとしては、特開昭
５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−２０８９９７
号公報等に記載の親水性ポリマーを用いることができ
る。具体例としては、ゼラチン、ゼラチン誘導体、プル
ラン、プルラン誘導体、アガロース、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドを挙
げることができる。ゼラチンを用いることが好ましい。

【００１８】グリセロールキナーゼは、ラットあるいは
ハトの肝、腎、小腸、脂肪組織の可溶性画分、ウシ精
子、昆虫筋肉の顆粒画分、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母等の何れ
の由来のものも用いることができるが、精製された市販
品であることが好ましく、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌ
ｏｍｏｎａｓ）属由来のものを用いることが特に好まし
い。グリセロールキナーゼの試薬層中の塗布量は、塗布
後の乾燥状態で０．１〜５ＫＵ／ｍ²の範囲にあること
が好ましい。

【００１９】グリセロリン酸オキシダーゼは、種々の細
菌にその存在が知られているが、精製された市販品（例
えば、ポディオコッカス（Ｐｏｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属
由来）を用いることが好ましい。グリセロリン酸オキシ
ダーゼの試薬層中の塗布量は、塗布後の乾燥状態で１〜
１０ＫＵ／ｍ²の範囲にあることが好ましい。

【００２０】試薬層中のグリセロールの塗布量は、塗布
後の乾燥状態で０．１〜１０ｇ／ｍ ²の範囲にあること
が好ましい。

【００２１】ペルオキシダーゼは、植物起源、動物起
源、あるいは微生物起源のペルオキシダーゼを用いるこ
とができるが、植物起源あるいは微生物起源のペルオキ
シダーゼを用いることが好ましい。西洋わさびもしくは
大根から抽出したペルオキシダーゼ、あるいはコヒリロ
ボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属もしくはカルバ
ラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属の微生物から抽出し
たペルオキシダーを用いることが特に好ましい。ペルオ
キシダーゼの試薬層中の塗布量は、乾燥状態で５０００
〜２００ＫＵ／ｍ²の範囲にあることが好ましく、１０
〜１６０ＫＵ／ｍ²の範囲にあることが特に好ましい。

【００２２】色素形成化合物は、過酸化水素の存在下
に、ペルオキシダーゼ等の酸化作用を有する物質が触媒
として働くことにより呈色する発色体であれば、単一の
化合物で色素形成化合物となるものであっても、あるい
は複数の化合物が試薬層中で反応して色素形成化合物と
なるものであってもよい。色素形成化合物としては、ロ
イコ色素、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と４
−ＡＡＰとのカップリングを生じるカップリング試薬と
の組み合わせ、ベンジジンもしくはその誘導体等を挙げ
ることができる。

【００２３】カップリング試薬の具体例として、フェノ
ール誘導体（例えば、ｐ−クロロフェノール等）、ナフ
タレン誘導体（例えば、１，７−ジヒドロナフタレン
等）、トルイジン誘導体（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−２
−スルホエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｍ−トルイジン等）、ジヒドロインドール類、テトラヒ
ドロキノリン類、あるいは置換アニリン化合物（例え
ば、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、５，
６，７，８−テトラヒドロ−１−ナフチルアミン等）を
挙げることができる。

【００２４】ベンジジンの誘導体としては、ｏ−トリジ
ン、ｍ−トリジン、テトラメチルベンジジン、ｏ−メチ
ルベンジジン、ｏ−ジアニシジン等を挙げることができ
る。その他の色素形成化合物として、４，４’−ジアミ
ノジフェニル、ｏ−フェニレンジアミン、２，３−トリ
レンジアミン等の置換フェニレンジアミン類を使用する
こともできる。

【００２５】ロイコ色素としては、特開昭５９−１９３
３５２号公報に記載のロイコ色素を使用することができ
るが、その中でも２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒド
ロキシフェニル）−４−［４−（ジメチルアミノ）フェ
ニル］−５−フェネチルイミダゾール、２−（３，５−
ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−［４−
（ジメチルアミノ）フェニル］−５−ベンジルイミダゾ
ール、あるいはそれらの塩を使用することが好ましい。

【００２６】定量すべき検体が赤血球を含んでいる場合
には、上記の色素形成化合物としては、発色体の発色が
６００ｎｍ以上、好ましくは６００〜７００ｎｍの波長
の範囲に吸収ピークを有するものを使用することが好ま
しく、また、特に４−ＡＰＰとそのカップリング試薬と
の組み合わせを使用する場合には、そのカップリング試
薬としては、その種類によって発色体の発色の吸収ピー
クが異なるため、４−ＡＰＰと当該試薬とが反応して生
成する発色体の発色が上記の波長の範囲に吸収ピークを
有するものであれば、何れのカップリング試薬を用いて
もよい。

【００２７】色素形成化合物としては、ロイコ色素を用
いることが好ましく、２−（３，５−ジメトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）−４−［４−（ジメチルアミノ）
フェニル］−５−フェネチルイミダゾール酢酸塩を用い
ることが特に好ましい。色素形成化合物の試薬層中の塗
布量は、乾燥後の状態で０．１〜１０ｇ／ｍ²の範囲に
あることが好ましく、１〜５ｇ／ｍ²の範囲にあること
が特に好ましい。

【００２８】試薬層は、ｐＨが５〜７の範囲にあること
が好ましい。試薬層には、好ましい範囲のｐＨを維持す
るために、ｐＨ調整剤を添加してもよい。ｐＨ調整剤と
しては、試薬層に含まれる酵素（グリセロールキナー
ゼ、グリセロリン酸オキシダーゼおよびペルオキシダー
ゼ）の最適ｐＨ値がその起源によって異なるため、酵素
の最適ｐＨ値を維持できるようなｐＨ調整剤が好まし
い。ｐＨ調整剤としては、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
る。試薬層には、界面活性剤を添加してもよい。界面活
性剤は、親水化処理を行うもので、試薬層中でのグリセ
ロールとＡＴＰ−マグネシウムイオン複合体との反応を
促進する。

【００２９】界面活性剤としては、水溶性のノニオン、
カチオン、アニオン、両性の何れの界面活性剤も用いる
ことができる。ノニオン性界面活性剤、例えば、ジメチ
ルシクロヘキサン−メチル（ポリオキシエチレン）共重
合体、ポリオキシエチレンやポリグルセリンのアルキル
アリールエーテル、脂肪酸エステル等を用いることが好
ましい。８〜１５個のオキシエチレン基もしくはオキシ
プロピレン基が連なった鎖状構造からなるノニオン性界
面活性剤を用いることがさらに好ましい。

【００３０】展開層は、ＡＴＰおよびキレート剤を含む
多孔質材料からなる。展開層は、ＡＴＰおよびキレート
剤を前記記載の親水性ポリマーバインダに分散あるいは
溶解させ、この塗布液を多孔質材料に塗布することによ
って形成することが好ましいが、この塗布液中に多孔質
材料を浸積して形成してもよい。親水性ポリマーバイン
ダとしては、ポリアクリルアミドを用いることが好まし
い。また、展開層には、上記の界面活性剤を添加しても
よい。

【００３１】展開層中のＡＴＰの塗布量は、塗布後の乾
燥状態で０．１〜５ｇ／ｍ²の範囲にあることが好まし
い。

【００３２】検体中にカルシウムイオンが存在すると正
確な測定値が得られないため、キレート剤を添加してカ
ルシウムイオンを捕捉することが好ましい。キレート剤
としては、カルシウムイオンを特異的にキレートできる
ものであれば何れも用いることができる。そのようなキ
レート剤としては、エチレングリコールビス（２−アミ
ノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｅ
ＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエ
チレントリアミン五酢酸、８−ヒドロキシキノリン−５
−スルホン酸等を挙げることができるが、エチレングリ
コールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を用いることが特に好
ましい。キレート剤の展開層中の塗布量は、塗布後の乾
燥状態で０．３〜２．７ｇ／ｍ²の範囲（５０〜１００
ｍＭの範囲に相当）にあることが好ましい。

【００３３】多孔質材料は、その空隙率が３０〜８０％
の範囲にあれば、繊維性であっても非繊維性であっても
よい。繊維性多孔質材料としては、織編物、不織布、濾
紙、短繊維の集合体を挙げることができる。非繊維性多
孔質材料としては、メンブレンフィルターが代表的であ
る。珪酸土等を結合剤中に分散した分散物、あるいはガ
ラスや樹脂等を互いに点接着させた集合体も使用するこ
とができる。多孔質材料としては、繊維性多孔質材料を
用いることが好ましい。繊維性多孔質材料としては、織
編物を用いることが好ましい。ここで、織編物とは、織
物、編み物もしくはこれに類するものをすべて含む。

【００３４】織物としては、たて糸とよこ糸とで織った
平織物が好ましい。織物を構成する糸としては、綿、カ
ポック、亜麻、大麻、ラミー、絹、羊毛等の天然繊維、
ナイロン、テトロン、レーヨン、キュプラ、アセテー
ト、ビニロン、アクリル、ポリエチレンテレフタレート
等の化学繊維を挙げることができ、これらを２種以上組
み合わせてもよい。繊維の太さは、その種類にもよる
が、約２０〜３００デニールの範囲にあることが好まし
く、約４０〜１３０デニールの範囲にあることがさらに
好ましい。糸の形態としては、フィラメント糸、紡績糸
等が好ましく、紡績糸がさらに好ましい。織物の厚さ
は、約１００〜５００μｍの範囲にあることが好まし
く、約１２０〜３５０μｍの範囲にあることがさらに好
ましい。

【００３５】編み物としては、たてメリヤスもしくはよ
こメリヤスが好ましい。たてメリヤスとしては、一重ア
トラス編み生地、トリコット編み生地、ダブルトリコッ
ト編み生地、ミラニーズ編み生地、ラッシェル編み生地
等を挙げることができる。よこメリヤスとしては、平編
み生地、パール編み生地、ゴム編み生地、両面編み生地
等を挙げることができる。編み物を構成する糸および糸
の形態としては、織物の場合と同様である。繊維の太さ
は、その種類にもよるが、約３５〜１５０デニールの範
囲にあることが好ましく、約４５〜１２０デニールの範
囲にあることがさらに好ましい。編み物生地の編成工程
時のゲージ数としては、約２０〜５０の範囲にあること
が好ましい。編み物の厚さは、約１００〜６００μｍの
範囲にあることが好ましく、約１５０〜４００μｍの範
囲にあることがさらに好ましい。空隙率が３０〜８０％
の範囲のトリコット編み生地、ラッシェル編み生地、ミ
ラニーズ編み生地もしくはダブルトリコット編み生地を
用いることが好ましい。

【００３６】展開層は、ＡＴＰがマグネシウムイオンと
特異的に複合体を形成できるように、そのｐＨが５〜７
の範囲にあることが好ましい。好ましい範囲のｐＨを維
持するために、展開層にｐＨ調整剤を添加することが望
ましい。ｐＨ調整剤としては、前記記載の緩衝液を使用
することができる。また、展開層には、前記記載の界面
活性剤を添加することが好ましい。

【００３７】検体中のマグネシウムイオンの量は、本発
明の一体型多層化学分析要素上に検体を点着させ、必要
ならばインキュベーションを行い、発色体の反射濃度を
測光して決定する。定量可能な検体は、マグネシウムイ
オンを含むものであれば何れの検体であってもよく、血
液、血漿、血清、尿等であることが好ましい。マグネシ
ウムイオンの濃度が、１〜６００ｍｇ／ｄＬの範囲にあ
る検体について実施することがさらに好ましい。測光
は、光透過性支持体側から反射濃度測定用光線（４１）
を用いて行う（図１）。最適な波長は、色素形成化合物
の種類により異なる。検体が赤血球を含む場合には、６
００ｎｍ以上、好ましくは６００〜７００ｎｍの範囲の
波長で測光することが望ましい。検体の点着量は、１〜
１０μＬの範囲にあることが好ましい。

【００３８】本発明の一体型多層化学分析要素は、特開
昭５７−６３４５２号公報に記載の方法により保持部材
（マウント）で挟持固定される。保持部材（マウント）
の材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミド、ポリカーボネ
ート、ポリエチレンテレフタレート、ＡＢＳ樹脂、ポリ
メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）樹脂、セラミック
（例えば、アルミナ、シリカ等）、金属（アルミニウ
ム、ステンレス、チタン等）等を挙げることができる。

【００３９】

【実施例】［実施例１］マグネシウムイオン分析用乾式
スライドの作製（１） ゼラチンが下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチ
レンテレフタレート無色透明フィルム上に、下記の組成
（ａ）を有する水溶液を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液でｐＨ５．０に調製し、水溶液中の各々の成分の塗
布量が下記の量となるように、そして乾燥後の厚さが１
９μｍとなるように、塗布し、乾燥して試薬層を形成し
た。 ─────────────────────────────── ゼラチン １９．１ｇ／ｍ² 界面活性剤 １．５１ｇ／ｍ² グリセロール ０．１６ｇ／ｍ² グリセロキナーゼ １．２０ＫＵ／ｍ² グリセロリン酸オキシターゼ ９．２１ＫＵ／ｍ² ペルオキシターゼ １５．３４ＫＵ／ｍ² ロイコ色素 ０．２９ｇ／ｍ² ─────────────────────────────── 界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレ
ンノニルフェニルエーテル（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １
０Ｇ、オリオン社製）を、ロイコ色素は、２−（３，５
−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−
ジメチルアミノフェニル）−５−フェネチルイミダゾー
ル酢酸塩を用いた。

【００４０】次に、上記試薬層上に約３０ｇ／ｍ²の供
給量で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール
相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ
編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層
し、乾燥させた。

【００４１】上記の布地上に、下記の組成（ｂ）の水溶
液中を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によってｐＨ
５．０に調製し、各々の成分の塗布量が下記の量となる
ように、そして乾燥後の厚さが２５０μｍとなるよう
に、塗布し、乾燥して展開層を形成した。ＭＥＳ、ＥＧ
ＴＡは、それぞれ２−モリホリノエタンスルホン酸、エ
チレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸を意味し、界面活性剤とし
ては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを
用いた。このようにして、ポリエチレンテレフタレート
無色透明フィルム、試薬層および展開層をこの順に有す
る一体型多層分析要素を作製した。 ───────────────────────────── ＡＴＰ １．４０ｇ／ｍ² ＥＧＴＡ ２．３８ｇ／ｍ² ＭＥＳ ６．５１ｇ／ｍ² ポリアクリルアミド ３．１４ｇ／ｍ² 界面活性剤 ０．６１ｇ／ｍ² ──────────────────────────────

【００４２】上記の一体型多層化学分析要素を１２ｍｍ
×１３ｍｍ四方のチップに切断し、スライド枠（特開昭
５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、本発明に従
うマグネシウムイオン分析用乾式スライド（１）を作製
した。

【００４３】［実施例２］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（２） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に５．５に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スライド（２）を作製し
た。

【００４４】［実施例３］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（３） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に６．０に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スライド（３）を作製し
た。

【００４５】［実施例４］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（４） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に６．５に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スライド（４）を作製し
た。

【００４６】［実施例５］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（５） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に７．０に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スライド（５）を作製し
た。

【００４７】［比較例１］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（６） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に７．５に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スライド（６）を作製し
た。

【００４８】［比較例２］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（７） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に８．０に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スラド（７）を作製し
た。

【００４９】［比較例３］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（８） 組成（ａ）の水溶液および組成（ｂ）の水溶液のｐＨ
を、共に８．５に変える以外は実施例１と同様にして、
マグネシウムイオン分析用乾式スラド（８）を作製し
た。

【００５０】［実施例６］マグネシウムイオン分析用乾
式スライド（１）〜（５）の分析精度の確認 ［反射濃度とマグネシウムイオンの濃度との関係を示す
検量線の作成］濃度が既知で、かつその濃度が互いに異
なるマグネシウムイオンを含有する５つの試料を調製
し、それぞれの試料を実施例１で得られたスライド
（１）に１０μＬずつ点着させた。３７℃にて６分間イ
ンキュベートした後、その反射濃度を６５０ｎｍにて富
士ドライケム５０００（富士写真フィルム（株）製）に
より測定した。次いで、反射濃度とマグネシウムイオン
の濃度との関係を示す検量線を作成した（図２）。検量
線は、反射濃度をＸ、マグネシウムイオンの濃度をＹと
すると、下記式 Ｙ＝２４．７７６×（Ｘ）²＋７．８７８３×（Ｘ）−
０．１１７５ で表される。

【００５１】マグネシウムイオンの濃度が２．２０ｍｇ
／ｄＬおよび６．１４ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製し、
それぞれの試料をスライド（１）に１０μＬずつ点着さ
せた。点着後の各スライドを３７℃にて６分間インキュ
ベートした後、それぞれの反射濃度（Ｘ₁）、（Ｘ₂）を
測定した。反射濃度（Ｘ₁）は、数回繰り返し測定を行
い、これらの反射濃度を上記式に代入して得られた各マ
グネシウムイオンの濃度から標準偏差および平均値を求
め、標準偏差を平均値で除して、変動係数（ＣＶ）値を
求めた。反射濃度（Ｘ₂）についても同様な操作を行
い、そのＣＶ値を求めた。その結果を、図３のｐＨ５．
０にスライド（１）のＣＶ値として示す。○、△は、そ
れぞれ、マグネシウムイオンの濃度が２．２０ｍｇ／ｄ
Ｌの血清試料のＣＶ値、マグネシウムイオンの濃度が
６．１４ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値を示す。

【００５２】スライド（２）〜（５）にそれぞれ変える
以外は、上記記載と同様にして、マグネシウムイオンの
濃度が２．２０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値、マグネ
シウムイオンの濃度が６．１４ｍｇ／ｄＬの血清試料の
ＣＶ値を求めた。その結果を、図３のｐＨ５．５、６．
０、６．５、７．０にそれぞれスライド（２）、
（３）、（４）、（５）のＣＶ値として示す。○、△
は、それぞれ、上記記載と同様の意味を有する。

【００５３】［比較例４］マグネシウムイオン分析用乾
式スライド（６）〜（８）の分析精度の確認 スライド（６）〜（８）にそれぞれ変える以外は、実施
例６と同様な操作を行い、マグネシウムイオンの濃度が
２．２０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値、マグネシウム
イオンの濃度が６．１４ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値
を求めた。その結果を、図３のｐＨ７．５、８．０、
８．５にそれぞれスライド（６）、（７）、（８）のＣ
Ｖ値として示す。

【００５４】図３より、スライド（１）〜（５）では、
ＣＶ値が７％以下であり、分析スライド（６）〜（８）
では、７％を超えることが分かる。よって、分析スライ
ドの試薬層および展開層のｐＨは、５．０〜７．０の範
囲にあることが好ましく、ｐＨが７．５を超えると分析
精度が相対的に低下することが分かる。

【００５５】［実施例７］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（９） グリセロールおよびグリセロールキナーゼを展開層に有
する以外は、実施例１と同様にして、マグネシウムイオ
ン分析用乾式スライド（９）を作製した。

【００５６】［実施例８］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（１０） グリセロールキナーゼを展開層に有する以外は、実施例
１と同様にして、マグネシウムイオン分析用乾式スライ
ド（１０）を作製した。

【００５７】［比較例５］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（１１） グリセロールおよびグリセロールキナーゼを展開層に有
し、ＡＴＰを試薬層に有する以外は、実例例１と同様に
して、マグネシウムイオン分析用乾式スライド（１１）
を作製した。

【００５８】［比較例６］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（１２） グリセロールキナーゼを展開層に有し、ＡＴＰを試薬層
に有する以外は、実施例１と同様にして、マグネシウム
イオン分析用乾式スライド（１２）を作製した。

【００５９】［比較例７］マグネシウムイオン分析用乾
式スライドの作製（１３） ＡＴＰを試薬層に有する以外は、実施例１と同様にし
て、マグネシウムイオン分析用乾式スライド（１０）を
作製した。

【００６０】［実施例９］マグネシウムイオン分析用乾
式スライド（９）〜（１０）の分析精度の確認 上記のスライド（９）〜（１０）を用いる以外は、実施
例６と同様にしてＣＶ値を求めた。この結果を図４に示
す。△、○は、それぞれ、マグネシウムイオンの濃度が
２．２０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値、マグネシウム
イオンの濃度が６．１４ｍｇ／ｄＬの血清試料のＣＶ値
を示す。

【００６１】［比較例８］マグネシウムイオン分析用乾
式スライド（１１）〜（１３）の分析精度の確認 スライド（１１）〜（１３）を用いる以外は、実施例７
と同様にしてＣＶ値を求めた。この結果を図４に示す。
△、○は、それぞれ、実施例７と同様の意味を有する。

【００６２】図４より、展開層にＡＴＰのみを含有する
スライドが、最も分析精度が高いことが分かる。ＡＴＰ
だけでなく、グリセロールやグリセロールキナ−ゼを含
有したスライドでは、ＡＴＰのみを含有したスライドに
比べて分析精度が劣り、ＡＴＰを試薬層に含有したスラ
イドでは、さらに分析精度が低下することが分かる。

【００６３】［実施例１０］マグネシウムイオン分析用
乾式スライド（１）、（９）および（１０）の分析感度
の確認 スライド（１）、（９）および（１０）に、マグネシウ
ムイオンの濃度が６ｍｇ／ｄＬである血清試料１０μＬ
をそれぞれ点着し、３７℃で６分間インキュベートした
後、６５０ｎｍにて各反射濃度を測定した。この結果を
図５に示す。

【００６４】［比較例９］マグネシウムイオン分析用乾
式スライド（１１）〜（１３）の分析感度の確認 スライド（１１）〜（１３）に変える以外は実施例９と
同様にして、各反射濃度を測定した。この結果を図５に
示す。

【００６５】図５より、展開層にＡＴＰのみを含有した
スライドの感度が最も高いことが分かる。

【００６６】以上の結果より、マグネシウムイオン分析
用乾式スライドは、展開層にＡＴＰのみを有し、かつ展
開層および試薬層のｐＨが共に５〜７の範囲にあること
が特に好ましいことが明らかである。展開層にＡＴＰの
みを有することによって、ＡＴＰが検体中のマグネシウ
ムイオンと迅速に複合体を形成し、さらにグリセロール
キナーゼの失活も回避することができるためと考えられ
る。また、ｐＨが５〜７の範囲では、ＡＴＰとマグネシ
ウムイオンとの複合体が形成され易く、かつ検体中の妨
害イオンであるカルシウムイオンとＥＧＴＡとの複合体
も形成され易いために、カルシウムイオンを反応系から
ほぼ完全に除くことができ、測定感度の向上に繋がった
ものと考えられる。

【００６７】

【発明の効果】本発明の一体型多層化学分析要素を用い
る定量方法は、検体の希釈等の如何なる前処理も必要と
しない、測定感度の高いかつ迅速な方法であり、マグネ
シウムイオンが高濃度の検体についても適用することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の代表的なマグネシウムイオンの定量用
一体型多層化学分析要素の模式図である。

【図２】反射濃度とマグネシウムイオンの濃度との関係
を示す検量線である。

【図３】マグネシウムイオン分析用乾式スライド（１）
〜（８）の分析精度を示すグラフである。

【図４】マグネシウムイオン分析用乾式スライド（１）
および（９）〜（１３）の分析精度を示すグラフであ
る。

【図５】マグネシウムイオン分析用乾式スライド（１）
および（９）〜（１３）の分析感度を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

１１ 光透過性支持体 ２１ 試薬層 ３１ 展開層 ４１ 反射濃度測定用光線

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BB11 BC02 CA10 CB03 DA10 EA20 FA11 FA17 FB05 FC03 GA01 GA05 2G045 AA01 BB21 BB29 BB48 BB50 BB51 CA02 CA26 DB08 DB21 FA29 FB01 FB16 GC10 JA05

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光透過性支持体、グリセロール、グリセ
   ロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオ
   キシダーゼおよび色素形成化合物を含む組成物を含有す
   る試薬層、そしてアデノシン−３−リン酸およびカルシ
   ウムイオンと特異的に結合するキレート剤を含有する多
   孔質材料からなる展開層をこの順に有する検体中のマグ
   ネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素。
2. 【請求項２】 キレート剤が、エチレングリコールビス
   （２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
   四酢酸であることを特徴とする請求項１に記載のマグネ
   シウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素。
3. 【請求項３】 色素形成化合物が、ロイコ色素であるこ
   とを特徴とする請求項１に記載のマグネシウムイオンの
   定量用一体型多層化学分析要素。
4. 【請求項４】 試薬層および展開層が、何れもｐＨ５乃
   至７の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載のマ
   グネシウムイオンの定量用一体型多層化学分析要素。
5. 【請求項５】 多孔質材料が、編み物であることを特徴
   とする請求項１に記載のマグネシウムイオンの定量用一
   体型多層化学分析要素。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の一体型多層化学分析要
   素上に、検体を点着させ、分析要素内の発色濃度を測定
   することを特徴とする検体中のマグネシウムイオンの定
   量方法。