CS212752B2 - Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol - Google Patents
Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol Download PDFInfo
- Publication number
- CS212752B2 CS212752B2 CS224374A CS224374A CS212752B2 CS 212752 B2 CS212752 B2 CS 212752B2 CS 224374 A CS224374 A CS 224374A CS 224374 A CS224374 A CS 224374A CS 212752 B2 CS212752 B2 CS 212752B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- esterase
- bound
- actinomyces
- assay
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.The invention relates to a method for the determination of cholesterol, both total and bound.
Cholesterol se vyskytuje v biologickém materiálu, například v séru apod. 'částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí nejprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázané formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některý ze známých způsobů, buď chemicky, nebo· enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extínkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.Cholesterol is present in the biological material, for example in serum and the like, partly in free form and partly in bound form as ester. For the determination of bound cholesterol or total cholesterol, it is necessary to first release the cholesterol which is present in the bound form. This release has so far been carried out by saponification under alkaline conditions, for example with an alcoholic potassium hydroxide solution. After saponification, the released cholesterol can then be determined by any known method, either chemically or enzymatically. The chemical assay can be carried out, for example, by the method of Liebermann and Burchard, the enzymatic assay being carried out with cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase or cholesterol dehydrase. Since the cholesterol esters and free cholesterol respectively have different extinction coefficients when carrying out the chemical assay, it is necessary to convert the cholesterol esters by alkaline hydrolysis to free cholesterol.
V každém, případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití re3 akčních složek k odbourání cholesterolu. K zábraně tohoto odbourání, které pak mění výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.In any case, the saponification of bound cholesterol under alkaline conditions is a disruptive and time consuming step in the process. In addition, cholesterol may be degraded when using the reactants. In order to prevent this degradation, which in turn alters the results of the assay, hydrolysis must be carried out under relatively mild conditions, further extending the time it takes to conduct the assay.
Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktivaci enzymu, je. zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno· provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.Particularly disadvantageous is the release of cholesterol under alkaline conditions when the cholesterol determination is to be carried out by an otherwise very advantageous enzymatic method. Because the enzyme is inactivated in a strongly alkaline environment, it is. the pH of the hydrolyzate should be changed to 5 to 8 by the addition of an acid in order to carry out the enzymatic determination. This further increases the time required to determine cholesterol.
Vynález si klade za cíl navrhnout způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného· cholesterolu, který je zbaven svrchu uvedených nevýhod.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for determining total cholesterol or bound cholesterol, which is free from the above disadvantages.
Předmětem vynálezu je tedy způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu uvolněním vázaného cholesterolu s následným stanovením takto uvolněného cholesterolu známým způsobem, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou mikrobiálního původu.Accordingly, the present invention provides a method of determining total cholesterol or bound cholesterol by releasing bound cholesterol followed by determining the cholesterol released in a known manner, characterized in that the bound cholesterol is released by cholesterol esterase of microbial origin.
Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativní212752 mu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento· postup je zvláště výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje způsob podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymatickými metodami, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože takto upravený způsob je možno snadno provádět automaticky.Cholesterol esterase has been found to rapidly and quantitate 212752 saponify bound cholesterol. This procedure is particularly advantageous if the subsequent determination of the released cholesterol is carried out in an enzymatic manner, for example with cholesterol oxidase or cholesterol dehydrase. In this case, the method according to the invention permits accurate determination of cholesterol only by enzymatic methods, which means a significant improvement in diagnostics, since the method thus modified can easily be carried out automatically.
Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo·, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu [Biochemica et Biophysica Acta 270 (1972) 156 až 166], Dále vázaný cholesterol je v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitavní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.It is known that the pancreas, liver and Nocardia restrictus contain cholesterol esterase. However, it has not been known that this enzyme can be used for rapid and complete saponification of cholesterol esters for quantitative determination, since the achievement of the group was not quantitative but was at most 80% bound cholesterol [Biochemica et Biophysica Acta 270 (1972) 156-166]. cholesterol is in the biological material in the form of esters with very different acids. For use in the analytical process, it is important that all the esters present are quantitatively cleaved approximately equally rapidly. Given the known properties of these enzymes, it is surprising that cholesterol esterases cause quantitative cleavage of all total cholesterol esters over a very short period of time. This is also surprising because known cholesterol esterases are known to exhibit substantial differences in potency relative to different cholesterol esters.
Při provádění způsobu podle vynálezu je zvláště vhodné užití cholesterolesteráz z mikroorganismů. Tyto enzymy mají daleko větší rychlost štěpení a vyšší účinnost oproti cholesterolesterázám jiného původu.Cholesterol esterases from microorganisms are particularly useful in the practice of the present invention. These enzymes have a much higher rate of cleavage and higher efficacy than cholesterol esterases of other origin.
Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití při provádění způsobu podle vynálezu bez izolace a čištění, To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesteroesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu,Furthermore, various microorganisms have been found to contain particularly effective cholesterol esterases and are therefore suitable for use in the process of the present invention without isolation and purification. This has the added advantage of avoiding the isolation steps for cholesteroesterase some enzymes specific for different types of cholesterol esters are not excluded from the cholesterol esterase mixture. The elimination of these types of esterases makes it difficult to achieve quantitative cleavage and determination of all types of ester-linked cholesterol,
Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.In addition, lipoid membrane-bound cholesterol esterase purification is very laborious and results in preparations that are expensive and therefore unsuitable for routine diagnosis in large batches.
Zvlášť dobrých výsledků je možno dosáhnou při provádění způsobu podle vynálezu při použití cholesterolesterázy za mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindraceaj ATCG 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno· užít jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možné užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhohný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při pužití následujících mikroorganismů:Particularly good results are obtained with the cholesterol esterase using Candida rugosa (also known as cylindrical ATCG 14830 or WS 90031 and Spec. Aspergillus WS 90030). Both of these microorganisms can be used as such or after drying from acetone emulsion. It is also possible to use an enriched preparation of cholesterol esterases from these microorganisms, which has the particular advantage that this enrichment is very easy to achieve.The above mentioned microorganism Candida rugosa can be produced on a technical scale and this process is very easy to carry out. , which is a substantially dried lactose-stabilized acetone emulsion, and similar beneficial results can be obtained using the following microorganisms:
Kromě výhodných cholesterolesteráz mikrobiologického původu je také možno při provádění způsobu podle vynálezu užít cholesterolesteráz jiného původu.In addition to preferred cholesterol esterases of microbiological origin, other cholesterol esterases may also be used in the present invention.
Jak již bylo uvedeno, spočívá nejdůležitěijší výhoda způsobu podle vynálezu v tom, že způsob umožňuje stanovení cholesterolu, které je prováděno výlučně enzymatickým způsobem. Zvláště důležité je to, že při .použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů doohází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.As already mentioned, the most important advantage of the method according to the invention is that the method allows the determination of cholesterol, which is carried out exclusively by an enzymatic method. Of particular importance is the use of cholesterol esterase preparations from microorganisms to rapidly and quantitatively release cholesterol from its esters. When using the above microorganisms, the pH and temperature can be used in a very small amount by direct addition of the microorganisms, which are then used in the enzymatic determination of cholesterol so that quantitative cholesterol release can be achieved in a few minutes. It has been found that the use of conventional carbohydrate-based stabilizing agents as used for similar microorganism preparations does not interfere with the enzymatic performance of the cholesterol assay.
Jak již bylo uvedeno, je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu také izolovaného· a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází ze suspenze mikroorganismu v acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu, a tato suspenze se podrobí dialýze, působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno· užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovými skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.As already mentioned, an isolated and enriched preparation of cholesterol esterase, preferably of microbial origin, may also be used in the process of the invention. The preparation may be enriched, for example, by starting from a suspension of a microorganism in acetone or from a suspension of other biological material in acetone, and subjecting the suspension to dialysis, a weakly basic anion exchanger or ammonium sulfate fractionation. In this way, 20 to 30-fold enrichment of cholesterol esterase is easily achieved. A weakly basic anion exchanger may be a carbohydrate modified with diethylaminoethanol groups. In the ammonium sulfate fractionation, in particular, the fractions obtained using a 1.8 to 2.4 molar ammonium sulfate solution are isolated. The enzymatic fractions thus obtained are then preferably chromatographed on the aforementioned ion exchangers.
Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout při provádění způsobu podle vynálezu pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu nebo směs těchto esterů užije jako jediný zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismu, nebo se užije ještě dalších uhlohydráitů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním stupni se užije vhodného uhlohydrátu, například glycerinu, a v druhém stuipni esteru cholesterolu; tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.Particularly favorable results can be obtained by the process according to the invention by means of microorganisms which can be grown in a cholesterol-containing nutrient medium in the form of an ester. It is possible to use the cholesterol ester or a mixture of these esters as the sole source of carbohydrates during the growth of the microorganism, or to use other carbohydrates. Particular preference is given to the use of microorganisms which can be grown in a multi-stage process, using in the first stage a suitable carbohydrate, for example glycerin, and in the second stage a cholesterol ester; this method is described, for example, in the German Offenlegungsschrift No. 2 224 133 and 2 307 518.
Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá při provádění způsobu podle vynálezu, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním· prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pHCholesterol esterase from Candida rugosa ATCC 14830, which is preferably used in the process of the invention, is very stable in a weakly acidic environment at pH 5 to 6.5. The optimum pH for the activity of this enzyme is 7.5. By using the enzyme, a very good catalytic reaction can be obtained with a relatively high salt content in the reaction medium. The process is preferably carried out at a buffer concentration of 0.2-0.8 M, in particular 0.4-0.6 M. The solution has a pH
4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Očinnosit oholesteroesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přídavek hydroxypolyethoxydodekanu.4.5 to 7.5, preferably 5 to 6.5. The activity of the oesterol esterase can be increased by the addition of surfactants, the addition of hydroxypolyethoxydodecane being particularly preferred.
Jak již bylo uvedeno, je výhodné provádět způsob podle vynálezu výlučně enzymatickým způsobem, to znamená, že následné stanovení cholesterolu se provádí rovněž enzymaticky, s výhodou za použití cholesterooxidázy. Je však možno užít také cholesterodehydrázy nebo cholesterodehydrogenázy.As already mentioned, it is advantageous to carry out the process according to the invention exclusively in an enzymatic manner, that is to say that the subsequent determination of cholesterol is also carried out enzymatically, preferably using cholestero oxidase. However, cholesterodehydrases or cholesterodehydrogenases may also be used.
Stanovení choiesteroloxidázou je popsáno například v NSR vykládacím spisu číslo 2 224 132. Tento způsob je možno s výhodou kombinovat se způsobem podle vynálezu. Zásadně se při provádění tohoto způsobu měří spotřeba kyslíku, tvorba peroxidu vo6 díku nebo tvorba cholestenonu.The choice of choiesterol oxidase is described, for example, in the German Offenlegungsschrift No. 2,224,132. In principle, the oxygen consumption, the formation of hydrogen peroxide or the formation of cholestenone are measured.
Měření spotřeby kyslíku je možno provádět například plynovou chromatografií, polaromsiricky nebo polarizačním způsobem. Tyto· způsoby stanovení jsou samy o sobě známy. Vytvořený peroxid vodíku je možno stanovit Utrácí, potenciometricky, polarograificky nebo kolorimetricky i enzymaticky. Výhodné je enzymatické stanovení při použití katalázy nebo peroxidázy, zvláště stanovení katalázou za přítomnosti /S-diketonů, jako cetylacetonu, nižších alkoholů a pufrů s obsahem amonných iontů, nebo stanovení peroxidázou za přítomnosti chromogenů, jako 2,2‘-aminobenzthiozolinsulfonové kyseliny. Cholestenon se stanoví pomocí ketolátek, například použitím 2,4-dinitrofenylhydrazinu nebo fotometricky při 240 nm.Oxygen consumption measurements can be made, for example, by gas chromatography, polaromsirally or by polarization. These assay methods are known per se. The hydrogen peroxide formed can be determined by digestion, potentiometrically, polarograifically or by colorimetric and enzymatic means. An enzymatic assay using a catalase or peroxidase is preferred, particularly a catalase assay in the presence of β-diketones such as cetylacetone, lower alcohols and ammonium ion buffers, or a peroxidase assay in the presence of chromogens such as 2,2‘-aminobenzthiosolinesulfonic acid. Cholestenone is determined using ketone bodies, for example using 2,4-dinitrophenylhydrazine or photometrically at 240 nm.
V případě, že se enzymatické stanovení celkového nebo vázaného chloesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erytbropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.Where the enzymatic determination of total or bound chloesterol is carried out with cholesterol oxidase, the enzyme produced by Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 or Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 is preferably used.
Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu se tedy skládá z cholesterolesterázy a reakčního systému ke stanovení volného cholesterolu. Reakční činidlo tohoto typu se skládá s výhodou z cholesterolesterázy mikrobiologického původu, cholesteroloxidázy, systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu. Zvláště výhodné je reakční činidlo, v němž má cholesteirolesteráza původ mikrobiální a je odvozena od některého ze svrchu uvedených mikroorganismů, zejména ve formě prášku získaného z acetonové suspenze, nebo ve formě takto získané bílkovinné frakce s cholesterolesterázovou účinností.Thus, the cholesterol assay reagent consists of a cholesterol esterase and a free cholesterol assay system. A reagent of this type preferably consists of a cholesterol esterase of microbiological origin, a cholesterol oxidase, a hydrogen peroxide assay system or a cholestenone assay system. Particularly preferred is a reagent in which the cholesteirolesterase is microbial in origin and is derived from one of the above microorganisms, in particular in the form of a powder obtained from an acetone suspension or in the form of a protein fraction with cholesterol esterase activity thus obtained.
Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to· jednotlivě, nebo ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrornogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonovs.In a particularly preferred embodiment of the method of the invention, the reagent consists of cholesterol oxidase, a cholesterol esterase preparation from one of the above microorganisms, catalase, acetylacetone, methanol and an ammonium ion buffer, either individually or in a mixture. According to a further preferred embodiment of the invention, the agent consists of cholesterol oxidase, a preparation of one of the above-mentioned microorganisms having cholesterol esterase activity, peroxidase, chromogen and a buffer, individually or in a mixture. The chromogen is preferably 2,2‘-aminobenzthiazolinesulfonic acid.
Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskuípinami za vzniku hydrazolu, a popřípadě z pufru. Jako derivát hydr,azinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazln.According to another preferred embodiment of the invention, the agent consists of a cholesterol oxidase, a cholesterol oxidase preparation from one of the above microorganisms, and a hydrazine derivative capable of reacting with ketoscopes to form hydrazole, and optionally a buffer. 2,4-Dinitrophenylhydrazine is preferably used as the hydr, azine derivative.
Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodné rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití v systémech ke stanovení peroxidu vodíku nebo dholestenonu.The above-mentioned preferred reagent composition may advantageously further comprise suitable solvents, stabilizers and / or surfactants as further ingredients. All these possible additives are known to those skilled in the art for use in systems for determining hydrogen peroxide or dholestenone.
S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:Preferably, the above reagents contain the essential components in the following proportions:
1) 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 104 až 5 X 105 jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a 2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu.1) 13 to 150 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin, 2 X 10 4 to 5 X 10 5 catalase units, 0.05 to 0.2 ml of acetylacetone and 2 to 10 ml of methanol in 100 ml an ammonium ion buffer at a pH of 5-7 and optionally 0.02-0.3 ml of a surfactant, preferably hydroxypolyethoxydodecane.
2) 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X 102 až 1 X 104 jednotek peroxidázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenzthiiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.2) 3 to 40 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin and 2 X 10 2 to 1 X 104 units of peroxidase, 50 to 200 mg of 2,2'-aminobenzthiiazolinesulfonic acid and optionally 0.05 to 0, 5 ml of a surfactant, preferably hydroxypolyethoxydodecane in 100 ml of a pH 6-8 buffer.
3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 ml roztoku 2,4-dlnltrofenylhydrazinu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 ml pufru o pH 6 až 8.3) 0.1 to 1 unit cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin, 1 to 5 ml of 1 ml solution of 2,4-dltrophenylhydrazine and optionally 0.005 to 0.1 ml of surfactant in 10 ml of buffer o pH 6 to 8.
4) 2 až 100 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg 'Cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního· činidla ( s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.4) 2 to 100 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of Cholesterol esterase of microbial origin and optionally 0.1 to 2.0 ml of a surfactant (preferably hydroxypolyethoxydodecane) in 50 ml of a buffer of pH 5-9, s preferably in 0.5 m of a sodium phosphate buffer at pH 7.5.
Při použití způsobu podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesterooxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Aspergillus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.By using the process of the invention, exceptionally rapid and complete saponification of the bound cholesterol can be achieved. For example, quantitative cleavage of bound cholesterol can be achieved by cholestero oxidase over 1 to 3 minutes with the addition of Candida rugosa ATCC 14830 or Aspergillus sp. WS 90030 in the form of a dried acetone suspension in an amount of 0.1 to 0.3 mg.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.The invention will be illustrated by the following examples.
Příklad 1Example 1
Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způsobem podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224132 jako 83 mg °/o (63 miligramů ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70 °C. Po neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mg cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.The serum free cholesterol content was determined by the method of Example 1 of NSR 222232 as 83 mg / ml (63 milligrams in 100 ml). For the determination of bound cholesterol, use a standard serum sample, treated with an alcoholic potassium hydroxide solution at 70 ° C for 30 minutes. After neutralization and repeated measurement of free cholesterol, a total amount of 181 mg / L of cholesterol was obtained, indicating that the sample initially contained 118 mg of cholesterol per 100 ml of sample in bound form.
Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinu} Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu.The procedure is repeated with the raw sample but 0.3 mg (based on protein) of Candida rugosa ATCC 14830 in the form of a dried acetone suspension is added to the sample at the beginning of the assay, and after 3 minutes a total cholesterol level of 183 mg / l is determined.
Příklad 2Example 2
Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění lalktózy, která se užije jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 'jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.To increase cholesterol esterase activity, the acetone suspension of Candida rugosa ATCC 14830 was dissolved after drying in potassium phosphate buffer at pH 6.0 and then dialyzed against the same buffer. After removal of the lactose, which is used as a stabilizing agent, a specific cholesterol esterase activity of 0.3 units / mg protein is obtained in the dialyzed solution.
Takto získaný roztok se smísí s iontoměničem na bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovýml skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,10. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.The solution thus obtained is mixed with a dextran-based ion exchanger which has been modified with diethylaminoethanol groups. The ion exchanger was separated and eluted with 0.2 M phosphate buffer pH 6.10. The cholesterol esterase activity in the eluate is 1.2 units / mg.
Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se vysráží mezi 1,8 až 2,4 M síranu amonného, se oddělí. Tímto způsobem se získá .specifická účinnost cholesterolesterázy 2,5 jednotek/mg.The solution thus obtained was subjected to ammonium sulfate fractionation. The protein fraction which precipitated between 1.8 to 2.4 M ammonium sulfate was separated. In this way, a specific cholesterol esterase activity of 2.5 units / mg is obtained.
Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovéim pufru o pH 6,0, dialyzuje se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí, a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž iontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek/ /mg bílkoviny.The product obtained is redissolved in phosphate buffer pH 6.0, dialyzed against the same buffer until it is free of salts, and then passed through a column filled with the same ion exchanger used above. Elution is carried out with 0.2 M phosphate buffer pH 6.0. In the cholesterol esterase-containing fraction a specific activity of this enzyme of 7 units / mg protein is obtained.
Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladu 1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.The enriched cholesterol esterase preparation thus obtained is used in the cholesterol assay as described in Example 1. However, the amount used is 0.001 mg, based on protein. The results correspond to those of Example 1.
Cholesterolesteráza z Candida rugosa se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo· svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo frakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakcionaci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografií na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměnlčích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolových, srážení protaminsulfátem apod.Cholesterol esterase from Candida rugosa is further purified by conventional enzyme purification methods. Instead of the above enrichment step, other purification processes may also be used, such as precipitation or fractionation with polyethyleneimine, fractionation with organic solvents or salts, chromatography on molecular sieves or weak anion exchangers with groups other than diethylaminoethanol groups, protamine sulfate precipitation, and the like.
Příklad 3Example 3
K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 °/o hydroxypolyethoxydodeka212752To 0.5 ml of serum or cholesterol standard is added 1.0 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer pH 7.5 containing 0.4% hydroxypolyethoxydodeca212752
10 nu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubujje 40 minut při teplo-tě 37 °C. Pak se přidá 0,25 mililitru tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového- činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Reakgents.)The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 40 minutes. 0.25 ml of this solution is then added to 3 ml of cholesterol reagent containing 2 parts of acetic acid, 3 parts of acetic anhydride and 1 part of sulfuric acid. (Liebermann-Burchard's Reagents.)
Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%. PřikládáUsing a reference standard, approximately 170 mg% of total cholesterol was obtained in typical samples. Comparative determinations of saponification of cholesterol esters with alcoholic potassium hydroxide solution gave values of 165 mg%. He attaches
0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 minut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Ei) při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevihacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného Δ4-choleisterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A4-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mgi% celkového cholesterolu.0.02 ml of serum is mixed with 10 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer containing 0.4% hydroxypolyethoxydodecane and 0.2 units of cholesterol esterase according to Example 2. The reaction solution is incubated for 60 minutes at 37 ° C. The extinction (Ei) at 240 nm is then read on a suitable spectral photometer and reacted with 0.1 units of steroldehydrase from Brevihacterium sterolicum. After 15 minutes the extinction (Ez) is measured again. Concentration formed Δ 4 -choleisterononu and thus cholesterol is obtained from the difference between the first and second subtraction with respect to the molar extinction coefficient for the A-4 -cholesteronon at 240 nm. Measuring a typical sample yields 183 mgi% of total cholesterol.
Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.Comparative determination with cholesterol oxidase from Nocardia erythropolis instead of steroldehydrase yields 181 mg% of total cholesterol.
Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozipustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 105 jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní na 100 mililitrů směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 g hydroxypolyéthoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotek cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027).EXAMPLE 5 g of ammonium phosphate are dissolved in 100 ml of water and the pH of the solution is adjusted to 7.0 with 85% phosphoric acid. Then 10 5 units of catalase are added. A solution of 0.2 ml of acetylacetone, 10 ml of methanol and 0.1 g of hydroxypolyethoxydodecane is made up to 100 ml with the solution thus obtained. To this solution was added 2.5 units of cholesterol esterase from Rhizopus spec. (WS 90027).
5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem 200 mg% cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotkou cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometrieky při 405 nm proti slepé zkoušce.5.0 ml of the solution thus obtained are mixed with 0.02 ml of serum or 0.2 ml of a standard cholesterol solution containing 200 mg of cholesterol. Aliquots of serum or standard cholesterol solutions are mixed with 0.1 unit cholesterol oxidase and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Then, the color formed is measured by photometry at 405 nm against a blank test.
Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATCC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027) poskytovalo stejné výsledky.The serum cholesterol content was determined using the standard as 154 mg% of total cholesterol. In a control assay using cholesterol esterase from Candida rugosa ATCC 14830 instead of cholesterol esterase from Rhizopus spec. (WS 90027) gave the same results.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (en) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reagent for determining cholesterol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2316637A DE2316637A1 (en) | 1973-03-28 | 1973-04-03 | METHOD FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS212752B2 true CS212752B2 (en) | 1982-03-26 |
Family
ID=5876875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS224374A CS212752B2 (en) | 1973-03-28 | 1974-03-28 | Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS212752B2 (en) |
-
1974
- 1974-03-28 CS CS224374A patent/CS212752B2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3925164A (en) | Method for the determination of cholesterol | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| Moellering et al. | Determination of citrate with citrate lyase | |
| US4378429A (en) | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum | |
| US3862009A (en) | Determination of triglycerides | |
| CA1054907A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
| SU664536A3 (en) | Reagent for determining cholesterin | |
| EP0019253B1 (en) | Test device, composition and method for the determination of triglycerides | |
| IL38235A (en) | Triglyceride hydrolysis and assay | |
| EP0010296B1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
| Kobashi et al. | A novel type of aryl sulfotransferase obtained from an anaerobic bacterium of human intestine | |
| US4181575A (en) | Composition and method for the determination of cholesterol | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| EP0024578B1 (en) | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor | |
| US4338395A (en) | Method for the analysis of triglycerides | |
| US4186052A (en) | NADH Peroxidase for hydrogen peroxide determination | |
| US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
| Van Kempen et al. | Quantitative determination of phenolsulfotransferase using 4-methylumbelliferone | |
| US4309502A (en) | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein | |
| JPS5948098A (en) | Measurement of lipase | |
| JPS6134800B2 (en) | ||
| US4409326A (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| EP0089210B1 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| EP0044432B1 (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| CS212752B2 (en) | Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol |