CS212753B2 - Reagent for determining cholesterol - Google Patents
Reagent for determining cholesterol Download PDFInfo
- Publication number
- CS212753B2 CS212753B2 CS78443A CS44378A CS212753B2 CS 212753 B2 CS212753 B2 CS 212753B2 CS 78443 A CS78443 A CS 78443A CS 44378 A CS44378 A CS 44378A CS 212753 B2 CS212753 B2 CS 212753B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- esterase
- determination
- buffer
- oxidase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, které se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholesterolu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou systémem ze stanovení peroxidu vodíku peroxidáiza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.Cholesterol reagent which consists of cholesterol esterase microbial origin and system to determine free cholesterol, preferably cholesterol oxidase and a peroxide determination system hydrogen or a system to determine cholesterol, from cholesterol oxidase, z catalase, acetylacetone, methanol and buffer ammonium ions, or is preferably hydrogen peroxide determination system peroxidase, chromogen and buffer system for the determination of cholestenone is hydrazine a derivative reacting with keto groups after the formation of hydrazinone, for example 2,4-dinitrophenylhydrazine, and the agent preferably comprises a surfactant such as hydroxypolyethoxydodecane.
Description
Vynález se týká reakčního činidla stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.The invention relates to a reagent for the determination of cholesterol, both total and bound.
Cholesterol se vyskytuje v biologickétm materiálu, například v séru apod. částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí néjprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázahé formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některým ze známých způsobů, buď chemicky, nebo enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extinkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.Cholesterol is present in the biological material, for example in serum and the like, partly in free form and partly in bound form as ester. For the determination of bound cholesterol or total cholesterol, it is first necessary to release the cholesterol which is present in a binding form. This release has so far been carried out by saponification under alkaline conditions, for example with an alcoholic potassium hydroxide solution. After saponification, the released cholesterol can then be determined by any known method, either chemically or enzymatically. The chemical assay can be carried out, for example, by the method of Liebermann and Burchard, the enzymatic assay being carried out with cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase or cholesterol dehydrase. Since the cholesterol esters and free cholesterol respectively have different extinction coefficients when carrying out the chemical assay, it is necessary to convert the cholesterol esters by alkaline hydrolysis to free cholesterol.
V každém případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití reakčních složek k odbourání cholesterolu. K cábraně tohoto odbourání, které pak mění Výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.In any case, the saponification of bound cholesterol under alkaline conditions is a disruptive and time consuming step in the process. In addition, cholesterol may be degraded when the reactants are used. In order to prevent this degradation, which in turn alters the results of the assay, hydrolysis must be carried out under relatively mild conditions, further extending the time required to conduct the assay.
Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým Způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktlvaci enzymu, je zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyjseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.Particularly disadvantageous is the release of cholesterol under alkaline conditions when the cholesterol determination is to be carried out by an otherwise very advantageous enzymatic method. Since the enzyme is inactivated in a strongly alkaline environment, the pH of the hydrolyzate needs to be adjusted to 5 to 8 by adding acid in order to carry out the enzymatic assay. This further increases the time required to determine cholesterol.
Vynález si klade za cíl navrhnout reakční činidlo ke stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu, které je zbaveno svrchu uvedených nevýhod.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a reagent for the determination of total cholesterol or bound cholesterol which is free of the above disadvantages.
Reakční činidlo podle vynálezu se skládá z cholesterolesterázy a systému ke stanovení volného cholesterolu.The reagent of the invention consists of a cholesterol esterase and a system for determining free cholesterol.
Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativnímu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento postup je zvlášť výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo .cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje činidlo podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymaticky, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože stanovení je možno snadno provádět automaticky.Cholesterol esterase has been found to rapidly and quantitatively saponify bound cholesterol. This procedure is particularly advantageous if the subsequent determination of the released cholesterol is carried out in an enzymatic manner, for example by cholesterol oxidase or cholesterol dehydrase. In this case, the reagent of the invention only allows for the accurate determination of cholesterol enzymatically, which means a significant improvement in diagnostics, since the assay can be easily performed automatically.
Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu. (Biochimica et Biophysica Acta 270 [1972] 156—166.) Dále se nachází vázaný cholesterol v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitativní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.It is known that the pancreas, liver and Nocardia restrictus contain cholesterol esterase. However, it was not known that this enzyme could be used for rapid and complete saponification of cholesterol esters for quantitative determination because the achievement of the group was not quantitative but was at most 80% bound cholesterol. (Biochimica et Biophysica Acta 270 [1972] 156-166.) Further, bound cholesterol is found in the biological material in the form of esters with very different acids. For use in the analytical process, it is important that all the esters present are quantitatively cleaved approximately equally rapidly. Given the known properties of these enzymes, it is surprising that cholesterol esterases cause quantitative cleavage of all total cholesterol esters over a very short period of time. This is also surprising because known cholesterol esterases are known to exhibit substantial differences in potency relative to different cholesterol esters.
Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití bez izolace a čištění. To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesterolesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy, specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu.Furthermore, various microorganisms have been found to contain particularly effective cholesterol esterases and are therefore suitable for use without isolation and purification. This has, in addition to being readily available, the advantage that, by omitting the cholesterol esterase isolation steps, it is possible that certain enzymes specific for different types of cholesterol esters are not excluded from the cholesterol esterase mixture. By eliminating these types of esterases, it is difficult to achieve quantitative cleavage and determination of all types of ester-linked cholesterol.
Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.In addition, lipoid membrane-bound cholesterol esterase purification is very laborious and results in preparations that are expensive and therefore unsuitable for routine diagnosis in large batches.
Zvlášť dobrých vsýledků je možno dosáhnout při použití cholesterolesterázy z mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindracea) ATCC 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno užít Jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možno užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhodný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při použití následujících mikroorganismů:Particularly good results are obtained with cholesterol esterase from Candida rugosa (also known as cylindracea) ATCC 14830 or WS 90031 and from Spec. Aspergillus WS 90030. Both microorganisms can be used as such or after drying from an acetone emulsion. It is also possible to use an enriched preparation of cholesterol esterases from these microorganisms, which has the particular advantage that this enrichment is very easy to achieve. The above Candida rugosa microorganism can be produced on a technical scale and is very easy to carry out. Especially suitable is a formulation which is a substantially dried lactose stabilized acetone emulsion. Similar favorable results can be obtained using the following microorganisms:
Actinomycea aureoverticullium WS 90002Actinomycea aureoverticullium WS 90002
Aotinomyces cyaniofuscatus WS 90003Aotinomyces cyaniofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini WS 90004Actinomyces griseomycini WS 90004
Actinomyces longisporus-fl. WS 90005Actinomyces longisporus-fl. WS 90005
SWITH
212733212733
Při použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů dochází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.When cholesterol esterase preparations from microorganisms are used, the cholesterol is rapidly and quantitatively released from its esters. When using the above microorganisms, the pH and temperature can be used in a very small amount by direct addition of the microorganisms, which are then used in the enzymatic determination of cholesterol so that quantitative cholesterol release can be achieved in a few minutes. It has been found that the use of conventional carbohydrate-based stabilizing agents as used for similar microorganism preparations does not interfere with the enzymatic performance of the cholesterol assay.
Jak již bylo uvedeno, je možno užít také izolovaného a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází se suspenze mikroorganismu a acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu a tato suspenze se podrobí dialýze působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovýimi skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.As already mentioned, an isolated and enriched preparation of cholesterol esterase, preferably of microbial origin, may also be used. The preparation may be enriched, for example, by starting with a suspension of a microorganism and acetone or from a suspension of other biological material in acetone and subjecting the suspension to dialysis by a weakly basic anion exchanger or by fractionation with ammonium sulfate. In this way, 20 to 30-fold enrichment of cholesterol esterase is easily achieved. A weakly basic anion exchanger may be a carbohydrate modified with diethylaminoethanol groups. In the ammonium sulfate fractionation, in particular, the fractions obtained using a 1.8 to 2.4 molar ammonium sulfate solution are isolated. The enzymatic fractions thus obtained are then preferably chromatographed on the aforementioned ion exchangers.
Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu hebo směs těohto esterů užije jako jediný 'zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismů nebo· se užije ještě dalších uhlohydrátů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním Stupni se užije vhodného uhlohydrátů, například glycerinu, a v druhém stupni esteru cholesterolu, tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.Particularly favorable results can be obtained with microorganisms which can be grown in a cholesterol-containing culture medium in the form of an ester. The cholesterol ester or a mixture of these esters may be used as the sole source of carbohydrates during the cultivation of the microorganisms or other carbohydrates may be used. Particular preference is given to the use of microorganisms which can be grown in a multi-stage process using a suitable carbohydrate such as glycerin and a second cholesterol ester in the first step, as described, for example, in German Patent Application Nos. 2,224,133 and 2,307,518.
Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pHThe Cholesterol esterase from Candida rugosa ATCC 14830, which is preferably used, is very stable in a weakly acidic environment at pH 5 to 6.5. The optimum pH for the activity of this enzyme is 7.5. By using an enzyme, a very good catalytic reaction can be obtained with a relatively high salt content in the reaction medium. The process is preferably carried out at a buffer concentration of 0.2-0.8 M, in particular 0.4-0.6 M. The solution has a pH
4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Účinnost cholesterolesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přípravek hydroxypolyethoxydodekanu.4.5 to 7.5, preferably 5 to 6.5. Cholesterol esterase activity can be enhanced by the addition of surfactants, particularly preferred is hydroxypolyethoxydodecane.
V případě, že se enzymatická stanovení celkového nebo vázaného cholesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia -erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811, nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.When enzymatic determinations of total or bound cholesterol are carried out with cholesterol oxidase, the enzyme produced by Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia-erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811, or Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 is preferably used.
Předmětem vynálezu je tedy reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, vyznačující se tím, že se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, aoetylacetonu, methanolu a puifru s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou systémem ze stanovení peroxidu vodíku peroxidáza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.Accordingly, the present invention provides a cholesterol assay reagent comprising a cholesterol esterase of microbial origin and a system for determining free cholesterol, preferably cholesterol oxidase, and a hydrogen peroxide assay system or a cholestenone assay system for cholesterol oxidase, catalase , acetyl acetone, methanol, and ammonium-containing buffer, or preferably the hydrogen peroxide assay system is peroxidase, chromogen and buffer, the cholestenone assay system is a hydrazine derivative reacting with keto groups to form a hydrazinone, for example 2,4-dinitrophenylhydrazine, and an agent preferably it contains a surfactant, for example hydroxypolyethoxydodecane.
Ve zvláště výhodném provedení se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, •aoetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to jednotlivě nebo •ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrofnogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonové.In a particularly preferred embodiment, the reagent consists of cholesterol oxidase, a cholesterol esterase preparation from one of the above microorganisms, catalase, acetyl acetone, methanol and an ammonium ion buffer, individually or in a mixture. According to a further preferred embodiment of the invention, the agent consists of cholesterol oxidase, a preparation of one of the above-mentioned microorganisms having cholesterol esterase activity, peroxidase, chromogen and a buffer, individually or in a mixture. The chropnogen used is preferably 2,2 amin-aminobenzthiazolinesulfonic acid.
Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxi212753 dázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskupinami za vzniku hydrazoiu a popřípadě z pufru. Jako derivát hydrazinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazin.According to another preferred embodiment of the invention, the agent consists of a cholesterol oxidase12753 dase, a cholesterol oxidase preparation from one of the above microorganisms, and a hydrazine derivative capable of reacting with keto groups to form a hydrazole and optionally a buffer. Preferably, 2,4-dinitrophenylhydrazine is used as the hydrazine derivative.
Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodná rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo cholestenonu.The above-mentioned preferred reagent composition may preferably further comprise suitable solvents, stabilizers and / or surfactants as additional ingredients. All these possible additives are known to those skilled in the art for the use of a hydrogen peroxide or cholestenone assay system.
S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:Preferably, the above reagents contain the essential components in the following proportions:
1] 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 104 až 5 χ io5 jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a '2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxyipolyethoxydodekanu.1] 13 to 150 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin, 2 X 10 4 to 5 χ 5 units of catalase, 0.05 to 0.2 ml of acetylacetone and 2 to 10 ml of methanol in 100 ml of a buffer containing ammonium ions at pH 5-7 and optionally 0.02-0.3 ml of a surfactant, preferably hydroxyipolyethoxydodecane.
2] 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X IO2 až 1 X IO4 jednotek peroxídázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenthiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.2] 3 to 40 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin and 2 X 10 2 to 1 X 10 4 units of peroxidase, 50 to 200 mg of 2,2'-aminobenthiazolinesulfonic acid and optionally 0.05 to 0 5 ml of a surfactant, preferably hydroxypolyethoxydodecane, in 100 ml of a pH 6-8 buffer.
3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 mM roztoku3) 0.1 to 1 unit of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin, 1 to 5 ml of 1 mM solution
2,4-dinitrofenylhydrazlnu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 mililitrech pufru o pH 6 až 8.2,4-dinitrophenylhydrazine and optionally 0.005 to 0.1 ml surfactant in 10 ml of pH 6-8 buffer.
4) 2 až 100 Jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního činidla (s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.4) 2 to 100 units of cholesterol oxidase, 0.05 to 0.5 mg of cholesterol esterase of microbial origin and optionally 0.1 to 2.0 ml of a surfactant (preferably hydroxypolyethoxydodecane) in 50 ml of a buffer of pH 5-9, preferably in 0.5 m of sodium phosphate buffer pH 7.5.
Při použití činidla podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesteroloxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Asperglllus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.By using the agent of the invention, exceptionally rapid and complete saponification of the bound cholesterol can be achieved. For example, quantitative cleavage of bound cholesterol can be achieved by cholesterol oxidase over 1 to 3 minutes when Candida rugosa ATCC 14830 or Asperglllus sp. WS 90030 in the form of a dried acetone suspension in an amount of 0.1 to 0.3 mg.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.The invention will be illustrated by the following examples.
Příklad 1Example 1
Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způeobeim podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224 132 jako 63 ,mg°/o (63 mg ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70° Celsia. Po· neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mig cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.The free cholesterol content in the serum was determined as 63 .mu.g / ml (63 mg in 100 ml) according to Example 1 of NSR 2,224,132. For the determination of bound cholesterol, use a comparative serum sample, treated with an alcoholic potassium hydroxide solution at 70 ° C for 30 minutes. After neutralization and repeated measurement of free cholesterol, a total amount of 181 mg / L of cholesterol was obtained, indicating that the sample initially contained 118 mig of cholesterol per 100 ml of sample in bound form.
Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinuJ Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu. Příklad 2The procedure is repeated with the raw sample, but 0.3 mg (based on protein Candida rugosa ATCC 14830 as a dried acetone suspension) is added to the sample at the start of the assay, and after 3 minutes 183 mg / total total cholesterol is determined by polarographic assay. 2
Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění laktózy, která se užije ‘jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.To increase cholesterol esterase activity, the acetone suspension of Candida rugosa ATCC 14830 was dissolved after drying in potassium phosphate buffer at pH 6.0 and then dialyzed against the same buffer. After removal of the lactose, which is used as a stabilizing agent, a specific cholesterol esterase activity of 0.3 units / mg protein is obtained in the dialyzed solution.
Takto získaný roztok se smísí s iontoměničelm na 'bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovými skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovýlm pufrem o pH 6,0. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.The solution thus obtained is mixed with a dextran-based ion exchanger which has been modified with diethylaminoethanol groups. The ion exchanger was separated and eluted with 0.2 M phosphate buffer pH 6.0. The cholesterol esterase activity in the eluate is 1.2 units / mg.
Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se výsráží mezi 1,8 až 2,4 M sír.anu amonného, se oddělí. Tímto způsobem· se získá specifická účinnost cholesterolesterázyThe solution thus obtained was subjected to ammonium sulfate fractionation. The protein fraction which precipitated between 1.8 to 2.4 M ammonium sulfate was separated. In this way, the specific activity of cholesterol esterase is obtained
2,5 jednotek/mg.2.5 units / mg.
Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovém pufru o pH 6,0, dialyzuje Se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž aniontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek na miligram bílkoviny.The product obtained is redissolved in phosphate buffer pH 6.0, dialyzed against the same buffer until free of salts, and then passed through a column filled with the same anion exchanger used as above. Elution is carried out with 0.2 M phosphate buffer pH 6.0. In the cholesterol esterase-containing fraction, the specific activity of this enzyme is 7 units per milligram of protein.
Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladuThe enriched cholesterol esterase preparation thus obtained is used in the cholesterol assay according to the example
1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.However, the amount used is 0.001 mg, based on protein. The results correspond to those of Example 1.
Choleisterolesteráza z Candida rugosa *se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo firakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakeioneci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografii na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměničích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolovýich, srážení protaminsulfátem apod.Candida rugosa® choleisterol esterase is further purified by conventional enzyme purification methods. Instead of the above enrichment step, other purification processes may be used, such as precipitation or firing with polyethyleneimine, fractionation with organic solvents or salts, chromatography on molecular sieves or weak anion exchangers with groups different from diethylaminoethanol groups, protamine sulfate precipitation, and the like.
Příklad 3Example 3
K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubuje 40 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidá 0,25 ml tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Rěakgents. jTo 0.5 ml of serum or cholesterol standard is added 1.0 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer pH 7.5 containing 0.4% hydroxypolyethoxydodecane and 2.5 units of cholesterol esterase according to Example 2. This reaction mixture was incubated for 40 minutes at 37 ° C. Then 0.25 ml of this solution is added to 3 ml of cholesterol reagent containing 2 parts of acetic acid, 3 parts of acetic anhydride and 1 part of sulfuric acid. (Liebermann-Burchardt Réakgents. J
Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%’.Using a reference standard, approximately 170 mg% of total cholesterol was obtained in typical samples. The comparative determination of the saponification of cholesterol esters with alcoholic potassium hydroxide solution yielded values of 165 mg% '.
Příklad 4Example 4
0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 iminut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Eij při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevibacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného A4-cholesterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A4-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mg% celkového cholesterolu.0.02 ml of serum is mixed with 10 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer containing 0.4% hydroxypolyethoxydodecane and 0.2 units of cholesterol esterase according to Example 2. The reaction solution is incubated for 60 min at 37 ° C. Then subtract absorbance (eij at 240 nm on a suitable spectrophotometer and a reaction with 0.1 units steroldehydrázy Brevibacterium sterolicum. After 15 minutes the extinction is measured again (Ez). A concentration of formed -cholesterononu 4 and thus cholesterol is obtained from the difference between the first and second readings with respect to the molar extinction coefficient for 4 4 -cholesteronone at 240 nm, measuring a typical sample yielding 183 mg% of total cholesterol.
Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.Comparative determination with cholesterol oxidase from Nocardia erythropolis instead of steroldehydrase yields 181 mg% of total cholesterol.
Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozpustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 105 jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní 100 ml směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 gramu hydroxypolyethoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotky cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027).EXAMPLE 5 g of ammonium phosphate is dissolved in 100 ml of water and the pH of the solution is adjusted to 7.0 with 85% phosphoric acid. Then 10 5 units of catalase are added. 100 ml of a mixture of 0.2 ml of acetylacetone, 10 ml of methanol and 0.1 g of hydroxypolyethoxydodecane are added to the solution thus obtained. To this solution was added 2.5 units of cholesterol esterase from Rhlzopus spec. (WS 90027).
5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem. 200 mg% Cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotky cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometricky při 405 nm proti slepé zkoušce.5.0 ml of the solution thus obtained are mixed with 0.02 ml of serum and 0.2 ml of standard cholesterol solution, respectively. 200 mg% Cholesterol. Aliquots of serum or standard cholesterol assay were mixed with 0.1 units of cholesterol oxidase and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Then, the color formed is measured photometrically at 405 nm against a blank test.
Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesiterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATOC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027) poskytovalo steíjné výsledky.The serum cholesterol content was determined using the standard as 154 mg% of total cholesiterol. In a control assay using cholesterol esterase from Candida rugosa ATOC 14830 instead of cholesterol esterase from Rhlzopus spec. (WS 90027) provided sting results.
Příklad 6Example 6
K 0,02 ml séra se přidá 2,0 ml 0,4 M pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,7, pufr obsahuje v 1 litru 10 mmolů fenolu a 1 m!mol 4-aminofenazonu a mimoto 0,4 %', hydroxypolyethoxydodekanu, reakce se provádí s 0,02 ml (0,5 jednotek) cholesterolesterázy, 0,02 ml (0,2 jednotek) cholesteroloxidázy a 0,02 iml (0,1 jednotky) peroxidázy. Po 30 minutách se měří extinkce spektrálním fotometrem při 546 nm proti slepé fekoušce, která obsahuje místo krevního séra vodu. Koncentrace cholesterolu se přepočítává s ohledem na standard.To 0.02 ml of serum, add 2.0 ml of 0.4 M potassium phosphate buffer, pH 7.7, containing 10 mmol of phenol and 1 ml of 4-aminophenazone in 1 liter and, in addition, 0.4%. hydroxypolyethoxydodecane, the reaction is carried out with 0.02 ml (0.5 units) cholesterol esterase, 0.02 ml (0.2 units) cholesterol oxidase and 0.02 µl (0.1 units) peroxidase. After 30 minutes, extinction is measured with a spectral photometer at 546 nm against a blank containing water instead of blood serum. The cholesterol concentration is recalculated according to the standard.
Při zkoušce s typickým vzorkem byla získána hodnota 193 mg% celkového cholesterolu.In a typical sample test, 193 mg% of total cholesterol was obtained.
Srovnávací stanovení způsobem podle Lieberraanna a Burcharda poskytlo výsledek 213 mg% celkového cholesterolu.Comparative determinations according to Lieberraann and Burchard yielded 213 mg% of total cholesterol.
Příklad 7 díl séra se zředí 9 díly vody.Example 7 Dilute serum with 9 parts water.
0,2 ml takto zředěného séra se smísí s 0,05 ml 20% roztoku hydroxypolyethoxydotíekanu, přidá se 0,15 jednotek cholesterolOxidázy a 0,5 jednotek cholesterolesterázy a po 15 minutách se přidají ještě 2 ml roztoku, obsahujícího 1 mmol 2,4-nitrofenylhyd•razinu v 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po dalších 30 minutách se přidají 4 ‘mililitry vody a vzniklý hydrazon se měří fotometrem při 405 nm. Vyhodnocení se provádí pomocí standardní křivky s ohledem na výsledek slepé zkoušky.0.2 ml of this diluted serum is mixed with 0.05 ml of a 20% hydroxypolyethoxydotecane solution, 0.15 units of cholesterol oxidase and 0.5 units of cholesterol esterase are added, and after 15 minutes 2 ml of a solution containing 1 mmol of 2,4- nitrophenylhydrazine in 1 N hydrochloric acid solution. After a further 30 minutes, 4 ilit ml of water are added and the resulting hydrazone is measured with a photometer at 405 nm. Evaluation is performed using a standard curve with respect to the blank test result.
Měřením typického vzorku se získá hodnota 156 mg celkového cholesterolu na 100 mililitrů séra.Measurement of a typical sample yields 156 mg total cholesterol per 100 milliliters of serum.
Při srovnávacím stanovení způsobem podle Liebermanna a Burcharda se získá výsledek 170 mg celkového cholesterolu ve '100 ml séra.A comparative determination according to Liebermann and Burchard yields 170 mg of total cholesterol in 100 ml of serum.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (en) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reagent for determining cholesterol |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2315501A DE2315501C3 (en) | 1973-03-28 | 1973-03-28 | Method for the determination of cholesterol |
| CS224374A CS212752B2 (en) | 1973-04-03 | 1974-03-28 | Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol |
| CS78443A CS212753B2 (en) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reagent for determining cholesterol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS212753B2 true CS212753B2 (en) | 1982-03-26 |
Family
ID=25745590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (en) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reagent for determining cholesterol |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS212753B2 (en) |
-
1978
- 1978-01-23 CS CS78443A patent/CS212753B2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3925164A (en) | Method for the determination of cholesterol | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| US4378429A (en) | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum | |
| US3862009A (en) | Determination of triglycerides | |
| US4259440A (en) | Hydrolysis and assay of triglycerides | |
| SU664536A3 (en) | Reagent for determining cholesterin | |
| EP0010296B1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
| US4181575A (en) | Composition and method for the determination of cholesterol | |
| Kobashi et al. | A novel type of aryl sulfotransferase obtained from an anaerobic bacterium of human intestine | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| EP0024578A1 (en) | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor | |
| US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
| Van Kempen et al. | Quantitative determination of phenolsulfotransferase using 4-methylumbelliferone | |
| JPS6134800B2 (en) | ||
| Tsuge et al. | Studies on the Molecular Complex of Flavins: IV. Activity and FAD-fluorescence Change Caused by the Chemical Modification of Tryptophyl and Tyrosyl Residues in Glucose Oxidase | |
| Takegawa et al. | Enzymatic Synthesis of a Neoglycoconjugate by Transglycosylation withArthrobacterEndo-β-N-acetylglucosaminidase: A Substrate for Colorimetric Detection of Endo-β-N-acetylglucosaminidase Activity | |
| US4409326A (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| CS212753B2 (en) | Reagent for determining cholesterol | |
| EP0044432B1 (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| CS212752B2 (en) | Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol | |
| US4042461A (en) | Method for purifying cholesterol esterase | |
| JP2647684B2 (en) | Triglyceride analysis reagent and analysis method | |
| Dahlqvist et al. | Accurate assay of low intestinal lactase activity with a fluorometric method | |
| O'Flaherty et al. | A kinetic locking-on strategy for bioaffinity purification: Further studies with alcohol dehydrogenase | |
| US5091305A (en) | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid |