CS212753B2 - Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu - Google Patents
Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu Download PDFInfo
- Publication number
- CS212753B2 CS212753B2 CS78443A CS44378A CS212753B2 CS 212753 B2 CS212753 B2 CS 212753B2 CS 78443 A CS78443 A CS 78443A CS 44378 A CS44378 A CS 44378A CS 212753 B2 CS212753 B2 CS 212753B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- esterase
- determination
- buffer
- oxidase
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 117
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 58
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical group OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 6
- GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N cholest-5-en-3-one Chemical compound C1C=C2CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N 0.000 claims abstract description 6
- NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N cholestenone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N nitrous amide Chemical compound ON=N XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 15
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 claims description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 abstract description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 abstract 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000008620 Cholesterol Assay Methods 0.000 description 4
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 1-(diethylamino)ethanol Chemical group CCN(CC)C(C)O RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186311 Brevibacterium sterolicum Species 0.000 description 1
- 241000235556 Cunninghamella elegans Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241001251094 Formica Species 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000204087 Pseudonocardia autotrophica Species 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 241000520747 Streptomyces canescens Species 0.000 description 1
- 241000187130 Streptomyces chartreusis Species 0.000 description 1
- 241000936713 Streptomyces griseomycini Species 0.000 description 1
- 241000936729 Streptomyces hachijoensis Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 description 1
- 241000946767 Streptomyces toxytricini Species 0.000 description 1
- 241000946738 Streptomyces variabilis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu,
které se skládá z cholesterolesterázy
mikrobiálního původu a systému ke stanovení
volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy
a systému ke stanovení peroxidu
vodíku nebo systému ke stanovení
cholesterolu, a to z cholesteroloxidázy, z
katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru
s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou
systémem ze stanovení peroxidu vodíku
peroxidáiza, chromogen a pufr, systémem
ke stanovení cholestenonu je hydrazinový
derivát, reagující s ketoskupinami za
vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin,
a činidlo s výhodou obsahuje
povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.
Description
Vynález se týká reakčního činidla stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.
Cholesterol se vyskytuje v biologickétm materiálu, například v séru apod. částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí néjprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázahé formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některým ze známých způsobů, buď chemicky, nebo enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extinkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.
V každém případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití reakčních složek k odbourání cholesterolu. K cábraně tohoto odbourání, které pak mění Výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.
Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým Způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktlvaci enzymu, je zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyjseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.
Vynález si klade za cíl navrhnout reakční činidlo ke stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu, které je zbaveno svrchu uvedených nevýhod.
Reakční činidlo podle vynálezu se skládá z cholesterolesterázy a systému ke stanovení volného cholesterolu.
Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativnímu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento postup je zvlášť výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo .cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje činidlo podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymaticky, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože stanovení je možno snadno provádět automaticky.
Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu. (Biochimica et Biophysica Acta 270 [1972] 156—166.) Dále se nachází vázaný cholesterol v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitativní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.
Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití bez izolace a čištění. To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesterolesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy, specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu.
Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.
Zvlášť dobrých vsýledků je možno dosáhnout při použití cholesterolesterázy z mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindracea) ATCC 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno užít Jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možno užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhodný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při použití následujících mikroorganismů:
Actinomycea aureoverticullium WS 90002
Aotinomyces cyaniofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini WS 90004
Actinomyces longisporus-fl. WS 90005
S
212733
| Actinoímyces malachiticus | WS | 90006 |
| 'Actinoímyces roseolus | WS | 90007 |
| 'Actinomyces toxytricini | WS | 90008 |
| 'Actinomyces variabilis | WS | 90009 |
| 'Streptomyces spec. | WS | 90010 |
| Streptomyces autotrophicus | WS | 90011 |
| Streptomyces canescens | WS | 90012 |
| Streptomyces chartreusis | WS | 90013 |
| Streptomyces michiganensls | WS | 90014 |
| 'Streptomyces murinus | WS | 90015 |
| Streptomyces hachijoensis | WS | 90016 |
| Streptomyces caelestes | WS | 90017 |
| Streptomyces tendae | WS | 90018 |
| ‘Nocardia rubra | WS | 90019 |
| Candida mycorderma | WS | 90020 |
| Candida albicans | WS | 90021 |
| Candida albicans | WS | 90022 |
| Candida albicans | WS | 90023 |
| Candida spec. | WS | 90024 |
| Cunninghamella elegans | WS | 90025 |
| Mucor mucedo | WS | 90026 |
| Rhizopus spec. | WS | 90027 |
| 'Penicillium spec. | WS | 90028 |
| 'Aspergillus spec. | WS | 90029 |
Při použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů dochází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.
Jak již bylo uvedeno, je možno užít také izolovaného a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází se suspenze mikroorganismu a acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu a tato suspenze se podrobí dialýze působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovýimi skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.
Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu hebo směs těohto esterů užije jako jediný 'zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismů nebo· se užije ještě dalších uhlohydrátů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním Stupni se užije vhodného uhlohydrátů, například glycerinu, a v druhém stupni esteru cholesterolu, tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.
Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pH
4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Účinnost cholesterolesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přípravek hydroxypolyethoxydodekanu.
V případě, že se enzymatická stanovení celkového nebo vázaného cholesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia -erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811, nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.
Předmětem vynálezu je tedy reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, vyznačující se tím, že se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, aoetylacetonu, methanolu a puifru s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou systémem ze stanovení peroxidu vodíku peroxidáza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.
Ve zvláště výhodném provedení se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, •aoetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to jednotlivě nebo •ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrofnogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonové.
Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxi212753 dázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskupinami za vzniku hydrazoiu a popřípadě z pufru. Jako derivát hydrazinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazin.
Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodná rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo cholestenonu.
S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:
1] 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 104 až 5 χ io5 jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a '2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxyipolyethoxydodekanu.
2] 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X IO2 až 1 X IO4 jednotek peroxídázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenthiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.
3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 mM roztoku
2,4-dinitrofenylhydrazlnu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 mililitrech pufru o pH 6 až 8.
4) 2 až 100 Jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního činidla (s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.
Při použití činidla podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesteroloxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Asperglllus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způeobeim podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224 132 jako 63 ,mg°/o (63 mg ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70° Celsia. Po· neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mig cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.
Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinuJ Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu. Příklad 2
Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění laktózy, která se užije ‘jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.
Takto získaný roztok se smísí s iontoměničelm na 'bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovými skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovýlm pufrem o pH 6,0. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.
Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se výsráží mezi 1,8 až 2,4 M sír.anu amonného, se oddělí. Tímto způsobem· se získá specifická účinnost cholesterolesterázy
2,5 jednotek/mg.
Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovém pufru o pH 6,0, dialyzuje Se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž aniontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek na miligram bílkoviny.
Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladu
1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.
Choleisterolesteráza z Candida rugosa *se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo firakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakeioneci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografii na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměničích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolovýich, srážení protaminsulfátem apod.
Příklad 3
K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubuje 40 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidá 0,25 ml tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Rěakgents. j
Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%’.
Příklad 4
0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 iminut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Eij při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevibacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného A4-cholesterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A4-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mg% celkového cholesterolu.
Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.
Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozpustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 105 jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní 100 ml směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 gramu hydroxypolyethoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotky cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027).
5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem. 200 mg% Cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotky cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometricky při 405 nm proti slepé zkoušce.
Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesiterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATOC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027) poskytovalo steíjné výsledky.
Příklad 6
K 0,02 ml séra se přidá 2,0 ml 0,4 M pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,7, pufr obsahuje v 1 litru 10 mmolů fenolu a 1 m!mol 4-aminofenazonu a mimoto 0,4 %', hydroxypolyethoxydodekanu, reakce se provádí s 0,02 ml (0,5 jednotek) cholesterolesterázy, 0,02 ml (0,2 jednotek) cholesteroloxidázy a 0,02 iml (0,1 jednotky) peroxidázy. Po 30 minutách se měří extinkce spektrálním fotometrem při 546 nm proti slepé fekoušce, která obsahuje místo krevního séra vodu. Koncentrace cholesterolu se přepočítává s ohledem na standard.
Při zkoušce s typickým vzorkem byla získána hodnota 193 mg% celkového cholesterolu.
Srovnávací stanovení způsobem podle Lieberraanna a Burcharda poskytlo výsledek 213 mg% celkového cholesterolu.
Příklad 7 díl séra se zředí 9 díly vody.
0,2 ml takto zředěného séra se smísí s 0,05 ml 20% roztoku hydroxypolyethoxydotíekanu, přidá se 0,15 jednotek cholesterolOxidázy a 0,5 jednotek cholesterolesterázy a po 15 minutách se přidají ještě 2 ml roztoku, obsahujícího 1 mmol 2,4-nitrofenylhyd•razinu v 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po dalších 30 minutách se přidají 4 ‘mililitry vody a vzniklý hydrazon se měří fotometrem při 405 nm. Vyhodnocení se provádí pomocí standardní křivky s ohledem na výsledek slepé zkoušky.
Měřením typického vzorku se získá hodnota 156 mg celkového cholesterolu na 100 mililitrů séra.
Při srovnávacím stanovení způsobem podle Liebermanna a Burcharda se získá výsledek 170 mg celkového cholesterolu ve '100 ml séra.
Claims (2)
- Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, vyznačující se tím, že se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke 'stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, neVYNÁLEZU ho je s výhodou systémem ke stanovení peroxidu vodíku peroxidáza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu 'je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například
- 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (cs) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2315501A DE2315501C3 (de) | 1973-03-28 | 1973-03-28 | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| CS224374A CS212752B2 (cs) | 1973-04-03 | 1974-03-28 | Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu |
| CS78443A CS212753B2 (cs) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS212753B2 true CS212753B2 (cs) | 1982-03-26 |
Family
ID=25745590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (cs) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS212753B2 (cs) |
-
1978
- 1978-01-23 CS CS78443A patent/CS212753B2/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3925164A (en) | Method for the determination of cholesterol | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| US4378429A (en) | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum | |
| US3862009A (en) | Determination of triglycerides | |
| CA1054907A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
| US4259440A (en) | Hydrolysis and assay of triglycerides | |
| SU664536A3 (ru) | Реактив дл определени холестерина | |
| EP0010296B1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| US4181575A (en) | Composition and method for the determination of cholesterol | |
| EP0024578A1 (en) | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor | |
| Van Kempen et al. | Quantitative determination of phenolsulfotransferase using 4-methylumbelliferone | |
| US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
| JPS6134800B2 (cs) | ||
| JPS5948098A (ja) | リパ−ゼの測定方法 | |
| Tsuge et al. | Studies on the Molecular Complex of Flavins: IV. Activity and FAD-fluorescence Change Caused by the Chemical Modification of Tryptophyl and Tyrosyl Residues in Glucose Oxidase | |
| Bigelis et al. | Yeast alpha-isopropylmalate isomerase. Factors affecting stability and enzyme activity. | |
| Takegawa et al. | Enzymatic Synthesis of a Neoglycoconjugate by Transglycosylation withArthrobacterEndo-β-N-acetylglucosaminidase: A Substrate for Colorimetric Detection of Endo-β-N-acetylglucosaminidase Activity | |
| US4409326A (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| CS212753B2 (cs) | Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu | |
| EP0044432B1 (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| Center et al. | A cyclic phosphodiesterase with 3'-nucleotidase activity from Proteus mirabilis | |
| CS212752B2 (cs) | Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu | |
| US4042461A (en) | Method for purifying cholesterol esterase | |
| JP2647684B2 (ja) | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 |