CS212753B2 - Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu - Google Patents

Abstract

Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, které se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholesterolu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou systémem ze stanovení peroxidu vodíku peroxidáiza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.

Description

Vynález se týká reakčního činidla stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.

Cholesterol se vyskytuje v biologickétm materiálu, například v séru apod. částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí néjprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázahé formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některým ze známých způsobů, buď chemicky, nebo enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extinkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.

V každém případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití reakčních složek k odbourání cholesterolu. K cábraně tohoto odbourání, které pak mění Výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.

Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým Způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktlvaci enzymu, je zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyjseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.

Vynález si klade za cíl navrhnout reakční činidlo ke stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu, které je zbaveno svrchu uvedených nevýhod.

Reakční činidlo podle vynálezu se skládá z cholesterolesterázy a systému ke stanovení volného cholesterolu.

Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativnímu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento postup je zvlášť výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo .cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje činidlo podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymaticky, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože stanovení je možno snadno provádět automaticky.

Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu. (Biochimica et Biophysica Acta 270 [1972] 156—166.) Dále se nachází vázaný cholesterol v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitativní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.

Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití bez izolace a čištění. To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesterolesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy, specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu.

Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.

Zvlášť dobrých vsýledků je možno dosáhnout při použití cholesterolesterázy z mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindracea) ATCC 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno užít Jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možno užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhodný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při použití následujících mikroorganismů:

Actinomycea aureoverticullium WS 90002

Aotinomyces cyaniofuscatus WS 90003

Actinomyces griseomycini WS 90004

Actinomyces longisporus-fl. WS 90005

S

212733

Actinoímyces malachiticus	WS	90006
'Actinoímyces roseolus	WS	90007
'Actinomyces toxytricini	WS	90008
'Actinomyces variabilis	WS	90009
'Streptomyces spec.	WS	90010
Streptomyces autotrophicus	WS	90011
Streptomyces canescens	WS	90012
Streptomyces chartreusis	WS	90013
Streptomyces michiganensls	WS	90014
'Streptomyces murinus	WS	90015
Streptomyces hachijoensis	WS	90016
Streptomyces caelestes	WS	90017
Streptomyces tendae	WS	90018
‘Nocardia rubra	WS	90019
Candida mycorderma	WS	90020
Candida albicans	WS	90021
Candida albicans	WS	90022
Candida albicans	WS	90023
Candida spec.	WS	90024
Cunninghamella elegans	WS	90025
Mucor mucedo	WS	90026
Rhizopus spec.	WS	90027
'Penicillium spec.	WS	90028
'Aspergillus spec.	WS	90029

Při použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů dochází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.

Jak již bylo uvedeno, je možno užít také izolovaného a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází se suspenze mikroorganismu a acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu a tato suspenze se podrobí dialýze působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovýimi skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.

Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu hebo směs těohto esterů užije jako jediný 'zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismů nebo· se užije ještě dalších uhlohydrátů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním Stupni se užije vhodného uhlohydrátů, například glycerinu, a v druhém stupni esteru cholesterolu, tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.

Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pH

4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Účinnost cholesterolesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přípravek hydroxypolyethoxydodekanu.

V případě, že se enzymatická stanovení celkového nebo vázaného cholesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia -erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811, nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.

Předmětem vynálezu je tedy reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, vyznačující se tím, že se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, aoetylacetonu, methanolu a puifru s obsahem amonných iontů, nebo je s výhodou systémem ze stanovení peroxidu vodíku peroxidáza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.

Ve zvláště výhodném provedení se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, •aoetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to jednotlivě nebo •ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrofnogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonové.

Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxi212753 dázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskupinami za vzniku hydrazoiu a popřípadě z pufru. Jako derivát hydrazinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazin.

Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodná rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo cholestenonu.

S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:

1] 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 10⁴ až 5 χ io⁵ jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a '2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxyipolyethoxydodekanu.

2] 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X IO² až 1 X IO⁴ jednotek peroxídázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenthiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.

3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 mM roztoku

2,4-dinitrofenylhydrazlnu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 mililitrech pufru o pH 6 až 8.

4) 2 až 100 Jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního činidla (s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.

Při použití činidla podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesteroloxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Asperglllus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způeobeim podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224 132 jako 63 ,mg°/o (63 mg ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70° Celsia. Po· neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mig cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.

Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinuJ Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu. Příklad 2

Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění laktózy, která se užije ‘jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.

Takto získaný roztok se smísí s iontoměničelm na 'bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovými skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovýlm pufrem o pH 6,0. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.

Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se výsráží mezi 1,8 až 2,4 M sír.anu amonného, se oddělí. Tímto způsobem· se získá specifická účinnost cholesterolesterázy

2,5 jednotek/mg.

Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovém pufru o pH 6,0, dialyzuje Se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž aniontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek na miligram bílkoviny.

Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladu

1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.

Choleisterolesteráza z Candida rugosa *se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo firakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakeioneci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografii na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměničích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolovýich, srážení protaminsulfátem apod.

Příklad 3

K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubuje 40 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidá 0,25 ml tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Rěakgents. j

Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%’.

Příklad 4

0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 iminut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Eij při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevibacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného A⁴-cholesterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A⁴-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mg% celkového cholesterolu.

Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.

Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozpustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 10⁵ jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní 100 ml směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 gramu hydroxypolyethoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotky cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027).

5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem. 200 mg% Cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotky cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometricky při 405 nm proti slepé zkoušce.

Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesiterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATOC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhlzopus spec. (WS 90027) poskytovalo steíjné výsledky.

Příklad 6

K 0,02 ml séra se přidá 2,0 ml 0,4 M pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,7, pufr obsahuje v 1 litru 10 mmolů fenolu a 1 m!mol 4-aminofenazonu a mimoto 0,4 %', hydroxypolyethoxydodekanu, reakce se provádí s 0,02 ml (0,5 jednotek) cholesterolesterázy, 0,02 ml (0,2 jednotek) cholesteroloxidázy a 0,02 iml (0,1 jednotky) peroxidázy. Po 30 minutách se měří extinkce spektrálním fotometrem při 546 nm proti slepé fekoušce, která obsahuje místo krevního séra vodu. Koncentrace cholesterolu se přepočítává s ohledem na standard.

Při zkoušce s typickým vzorkem byla získána hodnota 193 mg% celkového cholesterolu.

Srovnávací stanovení způsobem podle Lieberraanna a Burcharda poskytlo výsledek 213 mg% celkového cholesterolu.

Příklad 7 díl séra se zředí 9 díly vody.

0,2 ml takto zředěného séra se smísí s 0,05 ml 20% roztoku hydroxypolyethoxydotíekanu, přidá se 0,15 jednotek cholesterolOxidázy a 0,5 jednotek cholesterolesterázy a po 15 minutách se přidají ještě 2 ml roztoku, obsahujícího 1 mmol 2,4-nitrofenylhyd•razinu v 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po dalších 30 minutách se přidají 4 ‘mililitry vody a vzniklý hydrazon se měří fotometrem při 405 nm. Vyhodnocení se provádí pomocí standardní křivky s ohledem na výsledek slepé zkoušky.

Měřením typického vzorku se získá hodnota 156 mg celkového cholesterolu na 100 mililitrů séra.

Při srovnávacím stanovení způsobem podle Liebermanna a Burcharda se získá výsledek 170 mg celkového cholesterolu ve '100 ml séra.

Claims (2)

1. Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu, vyznačující se tím, že se skládá z cholesterolesterázy mikrobiálního původu a systému ke stanovení volného cholesterolu, s výhodou cholesteroloxidázy a systému ke 'stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu, a to z cholesteroloxidázy, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, neVYNÁLEZU ho je s výhodou systémem ke stanovení peroxidu vodíku peroxidáza, chromogen a pufr, systémem ke stanovení cholestenonu 'je hydrazinový derivát, reagující s ketoskupinami za vzniku hydrazinonu, například
2. 2,4-dinitrofenylhydrazin, a činidlo s výhodou obsahuje povrchově aktivní činidlo, například hydroxypolyethoxydodekan.