JPH06507375A

JPH06507375A - Ｄｎａ及びウイルスを除去する方法及び装置

Info

Publication number: JPH06507375A
Application number: JP3512903A
Authority: JP
Inventors: グレン　スティーブン　ディー; ブッチコ　グレゴリー; オー　コンネル　エドワード; スマリガ　ポーレッテ
Original assignee: クールター　コーポレイション
Priority date: 1990-06-29
Filing date: 1991-06-20
Publication date: 1994-08-25
Also published as: DE69128249D1; AU8215091A; EP0536297B1; AU654669B2; WO1992000132A1; EP0536297A1; DE69128249T2; EP0536297A4; US5076933A; CA2084873A1; ATE160294T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ及びウィルスを除去する方法及び装置技術分野本発明は、生理的流体及びヒト及び動物に投与する薬剤溶液からＤＮＡ及びウィルスを除去する方法、及び該方法を実施するのに使用する装置に関するものである。特に、本発明は、生物学的薬剤溶液及び生物学的培地からのＤＮＡ、ウィルス及びエンドトキシンの除去、例えば、モノクローナル抗体溶液、緩衝液又はウシ血清アルブミン溶液からのＤＮＡ、ウィルス及びエンドトキシンの除去に特に有効である。

従来技術薬剤溶液、緩衝液、生命維持液、食塩溶液及び動物及びヒトに投与されるこのような他の溶液を製造する際の目的の一つは、宿主において有害な反応を起させる物質をできる限り含有しないようにすることである。ＤＮＡ、ウィルス及びエンドトキシンのような物質による汚染を零にする目的が常に探求されているが、実際には極微量の上記物質が混在していることがある。

食品医薬品局（ＦＤＡ）は、上記物質に対して越えてはならない基準を設けている。上記物質のレベルが高すぎる場合には１０ツトの薬剤が拒否されることがあることを常に留意している製造者は、これらの製品がＦＤＡ基準を越えないことを保証する新規な方法を絶えず探求している。従って、製造工程のすべての段階において、製造者は、最終生成物と同様に、製造の際に用いられる試薬の純粋性を確保することに努めている。多くの薬剤及び上述の他の製品は、水溶液として販売されているか、あるいは水性培地中で製造されている。その結果、製造者は、使用する水が確実にＤＮＡ、ウィルス及びエンドトキシンを含んでいないようにすることに努めている。

このような製造者が使用することの多い技術の一つに限外濾過がある。米国特許第４，４３１，５４５号（パル（Ｐａｉｌ）等）、同第４．８１６．１６２号（ロスコツ（Ｒｏｓｓｋｏｐｆ）等）及び第４．４２０，３９８号（カスティノ（Ｃａｓｔｉｎｏ））明細書は、水、血液及び血漿を包含する種々の流体から異物及び／又は毒物を除去するためのデュアルモジュール濾過を記載している。米国特許第４，４３１，５４５号明細書は、一つが正ゼータ電位を有し、一つが負ゼータ電位を有するデュアルモジュール濾過を使用して正又は負に帯電した粒子を濾別している。中性粒子は、開示されているように、０．０１ミクロン以上であるフィルター細孔サイズの縁側に従って除去される。米国特許第４，８１６．１６２号明細書は、血液、血漿又は血清からイムノブロジン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｇｉｎ）　、アルブミン及ヒリボ蛋白質を除去する装置を記載しているが、ＤＮＡ又はウィルスの除去については記載していない、この米国特許におけるフィルターは、外科手術中に血液を循環及び浄化するのに使用するのに適合している。

米国特許第４，４２０．３９８号明細書は、モノクローナル抗体を包含する細胞生成（ｃｅｌｌ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ）抗ウイルス物質を、これらの物質を生成する反応「肉汁（ｂｒｏｔｈ）　Ｊがら分離する濾過方法を記載している。この特許は、生成したものが、患者内で反応を起こすことのあるウィルス、エンドトキシン及びＤＮＡを含んでいないがどうかについては言及していない。

０．０４ミクロンの絶対細孔径フィルターを用いる多重濾過が０．０７５　ミクロンサイズのウィルスを除去するが、それより小さいウィルスを除去しないことは、従来知られている。例えば、０．０４ミクロンを通過するＭＳ２ファージ（０，０２４ミクロン）を含む子ウシ血清の濾過は、ウィルスを除去しない。ウィルスを除去できる状況下では、除去率は代表的な例ではフィルター１回通過当り９９．９〜９９．９９％である。本発明者等は、例えば、０．０４ミクロンフィルターを用いて、試料１ｍｌ当り１０”個のウィルス粒子を含む試料からすべての検出可能なレオウィルス０．０７５ミクロン）を除去した。ジェネティック・エンジニアリング・ニュース（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ）　（６頁）、　１９９０年４月号に発表されている雑文は、食品医薬品局（ＦＡＤ）が生物学的薬剤の製造に関してウィルス除去方式（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に対する強調を次第に強めていること、及びフィルター製造者によってより高度のウィルス除去を達成しようとする努力がなされていることについて説明している。

モノクローナル抗体のような生物学的薬剤中に存在する他の汚染物質はＤＮＡである。ＦＤＡが、モノクローナル抗体調剤において、モノクローナル抗体１回投与当たりＤＮＡｌ０ピコグラム未満のＤＮＡレベルを達成することを要求していることは、産業界において広く認識されている。

モノクローナル抗体のような生物学的薬剤の製造者は、これらの製品が基準を満たしていることを確めるための品質保証（ＱＡ）方法を確立することが要求されている。基準に適合していることを示すのに用いられる方法では、試料中のＤＮＡを、生物学的薬剤溶液から濃縮するか又は固相に形成する（固体形態で捕集する）必要がある。ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）フィルター膜を用いることにより、ＤＮＡを溶液から濃縮できるか、固相に形成できるか、又は除去できることは知られている。製造者の雑文（シュレイチャー及びシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｅｌｌ　）は、ＤＥＡＥフィルターが０．２ｕｇＤＮＡ／ｍｌを含む溶液から大腸菌ＤＮＡの９０％より多量を固相に形成することを示している。０．００１　μｇのＤＮＡ　（１ナノグラム）を含む一層希釈された溶液においては、８０％より多量のものが固相に形成される。ＤＥＡＥフィルターは、ＤＮＡのような蛋白質をフィルターに結合させることにより機能する。しかし、若干のモノクローナル抗体溶液についてＤＥＡＥフィルターを使用した場合には、大きな制約が生じる。例えば、マルトースのような成分を有する緩衝液を含有するモノクローナル抗体のＤＮＡを測定する場合には、誤った高いか低いＤＮＡ値が生じることがあることが分かった。ＤＮＡアッセイ値が正確であることを保証するには、これらの誤った読みを無くす必要がある。

最後に、ウィルス及びＤＮＡのほかに、エンドトキシンも生物学的薬剤中の重要な汚染物質である。若干の製造者は、モノクローナル抗体溶液のような蛋白質溶液からエンドトキシンを除去するのに有用なカラム充填材を提供しているが、このような充填材は、蛋白質溶液をカラムに通した後の生成物収率を低くすることが多い、上記フィルター膜もエンドトキシンを除去することが報告されている。

しかし、本発明者等はすべての供給源からエンドトキシンを除去するのに有効である膜を見い出していない。若干の例では、除去は高レベルであるが、他の点において低レベルである。この変動は、種々の試料中のエンドトキシン自体の構造上の変動によると信じられている０次に、エンドトキシンにおける変動は、エンドトキシン自体の供給源及び実施された化学処理に依存すると信じられている。

現在の技術を注意して研究した結果、本発明者等は、従来達成されているレベルより低いレベルまで、ウィルス、ＤＮＡ及び少なくとも若干のエンドトキシンを除去することができる単一濾過装置を開発した。

発明の開示本発明はＤＥＡＥ被覆フィルター膜及び絶対細孔フィルターを有する単一濾過装置を提供するものであり、この装置にはフィルター装置の２個のセクションに膜及び絶対細孔フィルターが設けられている。この装置の第１セクシヨンは、第１の０．２ミクロンフィルター、第１のＤＥＡＥフィルター、第２のＤＥＡＥフィルター及び第２の０．２　ミクロンフィルターを具えるＤＮＡフィルターセクションである。第２セクシヨンは、第１の０．１　ミクロンフィルター、第２の０．１　ミクロンフィルター、第１の０．０４ミクロンフィルター及び第２の０．０４ミクロンフィルターを具えるウィルスフィルターセクションである。これらのフィルターセクションは単一濾過装置内に設置できるが、あるいはまた、使用の際に、ＤＮＡフィルターセクションを有するハウジングを、ウィルスフィルターセクションを有するハウジングより前方に設置し、これらの２個のセクションを連結する場合には、これらのセクションを別個のシウジング内に設置することができる。単一装置によって与えられるレベルより一層高いレベルの濾過を達成するには、多重装置を直列に連結することができる。この装置は、薬剤溶液を製造又は包装する場合には大規模で使用することができ、あるいは患者に投与する場合には小規模で使用することができる。いずれの場合にも、患者に投与する場合のように圧力を使用して薬剤溶液を押してフィルター要素に通ずか、あるいはいくつかの製造方法におけるように、真空を使用して薬剤溶液を吸引してフィルター要素に通して薬剤溶液をＤＮＡフィルター及びウィルスフィルターに通ずことにより、ＤＮＡ及びウィルスを除去する。

本発明の一例の装置は、Ｃ型異種栄養性レトロウィルスによって例示されるように、少なくとも４．６Ｘ１０’又は約９９．９９５％、又は３Ｘ１０１０のバタテリオファージ（９９，９９９９９９９７％）の効率でウィルスを除去し；　５００ｍｇのモノクローナル抗体試料当り１０μｇのレベルからｌＯピコグラム未満のレベルまで、好ましくは試料（１００ｍｌの水又は溶液）当り１ピコグラム未満のレベルまでＤＮＡを除去し；若干の細菌ニドトキシンを少なくとも９７％除去する。更に、これらのフィルター支持体Ｉ・は、１０％未満の薬剤又は生物学的薬剤、最も多くは６％以下の上述の薬剤、特にモノクローナル抗体及びウシ血清アルブミンを吸着する。

本発明の他の例では、ＤＥＡＥフィルター膜の代わりに、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ　（第四７ミノエチル塩）、ＱＡＭ（第四アミノメチル塩）、又は他の同様な第四塩で被覆した絶対細孔フィルターを使用する。例えば、第１及び第２のＤＥＡＥフィルターの代わりに、ＱＡＥ又はＱＡＭで被覆した０、０４ミロンフイルターを使用することができる。

本発明の他の例は、ＤＥＡＥ官能基、ＱＡＥ、ＱＡＭ、又は他の第四アミン官能基が０．２．０．１及び０．０４ミクロンの絶対細孔サイズフィルターのうちの１個以上に直接結合していて、これにより一層機能的になっている絶対細孔フィルターをＤＥＡＥセルロースフィルターの代りに使用する改良された装置である。

図面の簡単な説明図１は、本発明を例示するフィルター装置の単一ユニットの斜視図であり；図２は、図１に示す装置の分解図であり；図３は、本発明を例示する多重ユニットフィルター装置の斜視図であり；図４は、図３に示す装置の分解図である。

図１において、本発明はフィルター装置１２であり、この装置は二部片構成のハウジング部材からなり、該ハウジング部材は入口ポート１８を有する頂部部材１４、出口ポート２０を有する底部部材１６及び一連の内部要素（図示せず）を有し、前記頂部部材及び底部部材は、例えば、上述の２個の部材を螺合することにより、あるいはボール・ソケット差込により、あるいは他の手段により、漏れないように一体に結合されている。

図２は、本発明装置の分解図である。この装置は、上述のような可視外部部材１４．１６．１８及び２０及び内部要素を具え、前記内部要素は第１平坦フィルター支持体２４、第１密封部材２８、第２フイルターセクシヨン３０、フィルター支持体４０、第２平坦フィルター支持体４６、第２密封部材５０、第２フイルターセクシヨン６０、及び第３平坦フィルター支持体７０からなり、第１フィルター支持体２４は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６を有し；第１密封部材２８はフィルターハウジングの内壁から内方に成る横方向の距離にわたって延在し、第１フイルターセクシツン３０は全体にわたって一方から他方に逐次面と面とが接触した状態にあるフィルター要素３２．３４．３６及び３８を有し；フィルター支持体４０はフィルター要素３８の底面と接触している平坦な頂面４２、前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６及び前記支持体の底面の外側端縁における複数個の強固な脚４４を有し；第２平坦フィルター支持体４６は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６を有し、前記支持体の頂面４８は１４４と接触しており；第２フイルターセクシヨン６０は全体にわたって一方から他方に逐次面と面とが接触した状態にあるフィルター要素６２．６４．６６及び６８を有し；第３平坦フィルター支持体７０は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６を有し；前記内部要素の頂面対底面の接触は、２８対２４．３２対２８．３４対３２．３６対３４．３８対３６．４０対３８．５０対４６．６２対５０．６４対６２．６６対６４．８０対６６及び７０対６８であり；第１フィルター支持体２４の頂面は、頂部ハウジング１４の内部により支持され、第３フィルター支持体７０の底面は底部ハウジング１６の内部により支持されていて；前記頂部ハウジングと前記底部ハウジングとを連結して前記内部要素を密閉することにより、圧力を前記密封部材２８及び５０に作用させて、前記密封部材を前記ハウジングの壁に対して密封作用させ、これによりフィルターセクション３０及び６０の周囲の流れを防止し、前記流れを前記フィルターセクション内のみで生じさせる。

図３において、本発明の第２の例は２個のセクションを有する装置であって、この装置は連結手段８０により結合された第１のＤＮＡ除去フィルターユニット４と第２のウィルス除去フイルターユニット６を有する。

図４は、図３に示す２個のユニットを有するフィルター装置の分解図であり、前記装置は第１のＤＮＡ除去フィルターユニット４、第２のウィルス除去フィルターユニット６及び連結部材８０を具え、前記第１のＤＮＡ除去フィルター４は、入口ボート１８を有する底部フィルターハウジング部材１６及び内部壁に密接しかつ逐次互に面と面とが接触した状態にある内部要素を有し；前記内部要素は、第１平坦フィルター支持体２４、密封部材２８、ＤＮＡフィルターセクション３０、第２平坦フィルター支持体７２からなり、前記第１フィルター支持体２４は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６を有し；前記密封部材２８は前記ハウジングの内部側壁と接触し、かつ内壁から内方に成る横方向の距離にわたって延在し；前記ＤＮＡフィルターセクション３０はフィルター要素３２．３４．３６及び３８を有し；前記第２フィルター支持体７２は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路を有し；第２ウイルス除去フイルターユニツト６は、入口ボート１９を有する頂部フィルターハウジング部材１５、出口ポート２１を有する底部フィルターハウジング部材１７及び逐次互に面と面とが接触した状態にある内部部材を有し；前記内部部材は第１平坦フィルター支持体４６、第１密封部材５０、ウィルスフィルターセクション６０、及びフィルター支持体６２からなり、前記第１フィルター支持体４６は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路を有し；前記第１密封部材５０は前記ハウジングの内部側壁と接触しており、かつ前記内壁から内方にある横方向の距離にわたって延在し；前記ウィルスフィルターセクション６０はフィルター要素６２．６４．６６及び６８を有し；前記フィルター支持体６２は前記支持体の厚さを貫通する複数個の通路２６を有し；前記連結部材８゜は出口ボート２０と入口ボート１９とを連結することにより前記ＤＮＡフィルターユニット４と前記ウィルス除去フィルターユニット６とを結合しており；前記内部要素の頂面対底面の接触は、２８対２４．３２対２８．３４対３２．３６対３４．３８対３６．７２対３８．５０対４６．６２対５０．６４対６２．６６対６４．６８対６６．７０対６８であり；内部要素２４及び４６の頂面はそれぞれのハウジング１４及び１５の内部により支持され、内部要素７０及び７２の底面はそれぞれのハウジング１６及び１７の内部により支持され；前記頂部ハウジングと前記底部ハウジングとを連結することによって前記内部要素を密閉することにより圧力を前記密封部材に作用させ、これによりフィルターセクション３０及び６０の周囲の流れを防止し、前記流れが前記各フィルターセクション内のみで生じるようにし；前記第１のＤＮＡ除去フィルターユニットと前記第２のウィルス除去フィルターユニットとはポート１９及び２０に取付けた連結部材８０により結合されている。

上述のフィルターユニットは、可能などのようなサイズ及び形状−円筒形、正方形、長方形−でもよく、フィルターセクション３０及び６０に用いるフィルター材料のサイズ及び形状に関する入手可能性によってのみ限定される。フィルターユニ７）は、緩衝液、薬剤、薬剤溶液等の製造及び調製に使用するのに有用な量の水を商業的に取り扱うことができるサイズにすることができる。フィルターは、新しい水性材料を加える製造プロセスのいずれの点においても使用することができ、製造プロセスの終りの包装工程でＤＮＡ、ウィルス及びエンドトキシンを除去するのに特に有用である。更に、本発明のフィルター装置は、生理的溶液又は薬剤溶液を患者に投与する装置と組み合わせて使用することができ；例えば、本発明のフィルター装置は、皮下注射器に組み込むか、あるいは配置することができる。すべての使用例において、濾過される溶液は、ＤＮＡ除去フィルターセクションを通り、次いでウィルス除去フィルターセクションを通る。

上述のフィルター装置のフィルター要素は、ジエチルアミノエチルセルロースフィルタと絶対細孔フィルターとの組合せである０本発明の装置に使用する場合には、これらのフィルターは４．６　ＸＩＯ’以上の効率で０．１　ミクロンのＣ型レトロウィルスを除去し、ＤＮＡを１０マイクログラム／ｍｌのレベルから１ピコグラム／ｍ１未満のレベルまでを除去し、若干の細菌エンドトキシンを約９７％除去する。更に、本発明のフィルター要素は、処理中の溶液、例えば、モノクローナル抗体溶液又はウシ血清アルブミン溶液から６％以下の蛋白質を吸着する０本発明の好ましい例では、要素３２及び３８は０．２　ミクロン絶対細孔フィルターであり；要素３４及び３６は、例えば、シュレイチャー及びシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｅｌｌ　）のＮＡ４５フイルターのようなりＥＡＥ被覆フィルターであり；要素６２及び６４は０．１　ミクロン絶対細孔フィルターであり；要素６６及び６８は０．０４ミクロン絶対細孔フィルターである。

本発明の好ましい例においては、約０．１０８　ミクロンサイズの感染性ウィルス粒子を、濾過装置１回通過当り少なくとも９９．９９％の効率で除去することができる。一層高い効率は、２個以上のフィルター装置を直列に用いることにより、達成することができる。

本発明の好ましいフィルター装置は、上述のように、フィルター要素の使用時に相乗効果を発揮する０本発明の最小絶対細孔フィルターは０．０４ミクロンである。ＤＥＡＥフィルターに関する製造者の雑文は、細孔サイズが０．４５ミクロンであることを記載している。しかし、上述のように、また以下の実施例に示すように、０．０１８　ミクロン（最小ウィルス粒子サイズ）程度の小さいウィルスを除去することができる。相乗効果の正確な性質は知られていないが、最小細孔サイズフィルター要素より５５％小さいウィルスの完全な除去は、予期されていなかった。

本発明の装置を使用する方法では、水、緩衝水溶液及び生物学的薬剤溶液を包含する薬剤溶液は、３〜９の範囲のｐｉを有する。更に、これらの溶液は、０．５モル未満の特定塩含有量をし、前記特定塩は、ホスフェート、クロライド、ブロマイド、イオダイド、サルフェート及びアセテート陰イオンのリチウム、ナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩よりなる群から選択された１種以上の塩である０本発明の装置を使用する場合には、溶液は、始めにＤＮＡ除去セクションに通し、次いでウィルス除去セクションに通す。以下の実施例は、本発明の詳細な説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。

実施例１　ウィルスの除去本発明のフィルターユニットの内部要素は、順次に０．２　ミクロン、ＤＥＡＥ、ＤＥＡＥ、０．２　ミクロン、０．１　ミクロン、０．１ミクロン、０．０４ミクロン及び０．０４ミクロンの８個のフィルター要素を用いて組み立てたものであった。０．２．０．１及び０．０４ミクロンの要素は絶対細孔フィルターであり、ＤＥＡＥ要素はＮＡ４５フイルター（シュレイチャー及びシュエル）であった。これらのフィルターユニットを、オートクレーブ処理可能な注射器中に封入し、標準的方法を使用してオートクレーブ滅菌又はガス滅菌した。これらのフィルター要素を収容する滅菌注射器を、Ｃ型レトロウィルスと類似したサイズのマウス異種栄養性レトロウィルス（それぞれ、０．１０４　ミクロン対０．１　ミクロン）でスパイクされたモノクローナル抗体溶液を使用して評価するために、米国２０８５メリーランド州、ロックビル、プルツクウェル９９００　所在のマイクロバイオロジカル・アソシエーツ・インク、　（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、　）に送付した。各注射器のフィルター装置を、レトロウィルスでスパイクされたモノクローナル抗体試料１個について評価した。Ｓ＋Ｌ−アッセイニより、これらの試料は、４．３７Ｘ１０’ 、　５．６Ｘ１０’及び４．１ｘｉｏ’　Ｆ　Ｆ　Ｕ／ｍｌを含んでいた。

（ＦＦＵ７’＋１＝平均フォーカス数／シャーレ×容積／シャーレ　希釈度注射器のフィルターユニットに試験試料を通した後に、濾液をレトロウィルスについて３回再分析した。３個のモノクローナル抗体濾液のいずれにもレトロウィルスは存在しなかった。

抗体回収率は９０％より大きかった。

実施例２　ＤＮＡ／ウィルス除去フィルターによるバクテリオファージの除去達成可能な異種栄養性レトロウィルスの最大濃度は約１０”　ＦＦＵ／ｍｌであった。本発明のＤＮＡ／ウィルス除去フィルターの一層高いウィルス粒子除去効率を確認するために、バクテリオファージＴ４（約０．１　ミクロン）を第２モデルウイルスとして選択した。バクテリオファージＴ４濃度についてのアッセイは、大腸菌Ｂ　（ＡＴＣＣ１１３０３）のローン（ｌａｗｎ）　）上でのプラーク形成（ＰＦＵ）によって行った。バクテリオファージＴ４を、最大濃度（９，９ｘｉｏ”ｐ　Ｆ　Ｕ／１ｍ１）まで増殖させ、未希釈バクテリオファージ溶液を３個のアリコートに分けた。各アリコートを、別個のＤＮＡ／ウィルス除去フィルター装置に通して濾過した。濾液中のハタテリオファージＴ４濃度は希釈し、大腸菌を入れたシャーレでプラークを形成させること（ｐｌａｔｉｎｇ）によりアッセイした。３個の濾液のいずれにも生存可能なウィルスは含まれていなかった。アッセイの結果３．３ＦＦＵであったが、はっきりしなかった。これらの結果は、本発明のＤＮＡ／ウィルス除去フィルター装置が、０．１　ミクロンバクテリオファージの濃度を少なくとも３．ＯＸｌｏＩＯ倍（９９，９９９９９９９７％）まで減少することができることを示す、同様な結果は、Ｃ型レトロウィルスのような同様なサイズ（約０．１　ミクロン）のウィルスの場合に得ることができた。Ｃ型レトロウィルスは、モノクローナル抗体薬剤のための調製原料中の汚染物質であることが知られている。本発明者等の知るところでは、いずれのフィルターを１回通過させただけでは、このレベルのウィルス除去は従来達成されていなかった。本発明のフィルター装置を使用した場合には、調製原料中のＣ型レトロウィルス濃度は少なくとも３Ｘ１０”倍まで減少した。従って、１０７程度の公称ウィルス数を含む溶液を、１０００倍の安全率で検知不能なウィルスレベルまで濾別できた。溶液のウィルス含有量が１０７を、：える高さの場合には、前記溶液を２回以上濾過して検知不能なウィルスレベルを有する溶液を得ることができた。２個の本発明のフィルター装置を直列に用いた場合には、約１３１７〜１０１１１個／■ｌ〔（３ＸＩＯ”）　Ｘ　（３ＸＩＯ”／１０００＝　９　ＸＩＯ”）。

実施例３　スパイクされた抗体溶液からのＤＮＡの除去それぞれ４００１ｍｇの抗体及びＤＮＡを含むモノクローナル抗体溶液を、本発明のＤＮＡ／ウィルス除去フィルターユニットに通して濾過した。濾過前後のＤＮＡ分析は、濾過前にそれぞれ７２７ｐｇ／試料及び４４２ｐｇ／試料のＤＮＡであり、濾過後にそれぞれ５　ｐ　ｇ／ｌＪ、料及びｌｐｇ／試料のＤＮＡであった（除去率９９．３％及び９９．８％）。

実施例４　市販の抗体溶液からのＤＮＡの除去市販のモノクローナル抗体溶液の分析結果は、著しいＤＮＡ汚染が存在することを示した９分析は、ナイロン６６１１Ｊ−で同相に形成されたＤＮＡを検出するために１、アッセイキット（米国メイン化　ロックランド所在のＦＭＣバイオプロダクツ（Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔ、ｓ）　（Ｆ　Ｍ　Ｃアッセイ）を用いて行った。ＤＮＡを含むモノクローナル抗体溶液の５個のロッｌを、本発明のフィルター装置を通して濾過する前後に、ＤＮＡについて分析した。濾過された溶液のすべてが抗体用量当り１０ピコグラム未満のＤＮＡを有し、その内の２個が抗体用量当たり１ピコグラム未満を示した。これらの結果を表１に示す。

表１　抗体生成物からのＤＮＡの除去のまとめ生成物　濾過前の平均ＤＮＡ　濾過後の濃度番号　ＤＮＡｐｇ／Ｍａｂｓ＋ｇ：　ＤＮＡｐｇ／用量　ＤＮＡｐｇ／用量１　０．６５　２６０　２．６２　０．３０　１２０　０．４３　０．３４　３．４　２．６４　０．１３　１．３　３．１５　０．１４　１４０　０実施例５　ＤＮＡ除去の確認商業的目的でＤＮＡ除去をｆＩ認するため、ＤＮＡ／ウィルス除去フィルターを、ハイブリドーマ生成りＮＡ１００マイクログラムでスパイクされた緩衝液中の薬剤グレードのモノクローナル抗体（Ｂ１）試料５００ｓｉｇで試験した。確認に使用したＤＮＡは、モノクローナル抗体を生成するのに用いたと同じ細胞培地から精製し、抗体生成の際に実際に見い出されたＤＮＡとできるだけ類似したものとした。３個の抗体溶液をＤＮＡでスパイクした。２個の未スパイク抗体溶液、ＤＮＡを含まない２個の緩衝液（これのみ）、及び１００マイクログラムのＤＮＡでスパイクした２個の緩衝液（これのみ）を、コントロールとして使用した。スパイクされた溶液中のＤＮＡの実際のレベルは、蛍光ＤＮＡアッセイ技術により測定した。スパイクされた抗体溶液は８１．９２及び７４マイクログラム試料の実際のＤＮＡレベルを有していることが分かった。スパイクされた緩衝液は８９及び９６マイクログラム試料の実際のＤＮＡレベルを有していることが分かった。すべての溶液試料は等容積であった。

各試験溶液（全体で９個の溶液）を、別個の２５＋＋ｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／ウィルス除去フィルター装置に通して濾過した。各濾液中の残留ＤＮＡを、濃縮し、固相に形成し、標準ＦＭＣ−ＤＮＡアッセイ技術を用いて２回定量した。各アッセイにおけるＤＮＡ量は、同じアッセイにおける精製したハイブリドーマＤＮＡの標準曲線からめた。標準曲線については、計器の反射濃度針によって測定した試料のバンドの色濃度（ｃｏｌｏｒ　１ｎｔｅｎｓｉｔｙ）をピーク高さくｃｍ）として測定した。標準曲線データを、ピーク高さが添加標準ＤＮＡのピコグラムのｌｏ　ｇ対１ｏｇｉｔ　（最高発色及びブランクを与える標準に対して）に転換されるｌｏｇ−ｌｏｇｉｔ変換により直線に変換した。次いで、試験試料をＤＮＡの標準曲線から色強度まで内挿した。これらの結果は表２に示されており、ＤＮＡ／ウィルス除去フィルター１回通過の場合に、ＤＮＡレベルを５００ｍｇのモノクローナル抗体当たり約１０ヒコグラムのＤＮＡ（平均＝１２．３ｐ　ｇのＤ　Ｎ　Ａ　／　５００ｍｇの抗体）まで約１０７倍まで減少できたことを示す。等容積のスパイクされていない緩衝液（これのみ）の場合の平均値は６．２ μｇであった。従って、濾過され、スパイクされた抗体溶液中に検出された正味の平均ＤＮＡ１ｉは、６．ｉｐｇのＤ　Ｎ　Ａ　／　５００＋ｗｇの抗体であった。

表２Ｂｌ　５００　請ｇ　１００μｇ　８１μｇ　９８．９χ　１６．５　ｐｇＢｌ　５００　ｍｇ　１００．ｃｚｇ　９２ｕｇ　９８．０χ　８．６　ｐｇ　１２．３　ｐｇＢｌ　５００謡ｇ１００μｇ　７４μｇ　９６．７χ　１１．７　ｐｇＢｌ　５００ａ＋ｇ　０　０　９＆、３χ　３．３　ｐｇＢｌ　５０（１＋＋ｇ　０　０　９２．８χ　３．２　ｐｇ　３．２　ｐｇ緩衝液　１００μｇ　８９μｇ　Ｎ／Ａ　Ｉ６．９　ｐｇ〃１００μｇ　９６ｕｇ　Ｎ／Ａ　３．３　ｐｇ　１０．１　ｐｇ緩衝液　０　０　Ｎ／Ａ　９．８μｇ　＝−ｓ　０　０　Ｎ／Ａ　２．６μｇ６．２μｇ実施例６　エンドトキシンの除去ＤＮＡ及びエンドトキシンで汚染された１０％マルトース−ホスフェート緩衝液中の５０ｍｇ／■ｌのウシ血清アルブミン１００　ｍｌ溶液を、４７ｍ５ＤＮＡ／ウイルス除去フイルター装置に通して濾過した。出発溶液は、２４８　ｐ　ｇ　／ｍｌのＤＮＡ及び１９６６単位／１のエンドトキシン（ＥＵ／ｍｌ）を含んでいた。

最初、中間及び最後の２０１濾液部分を集め、分析した０分析したいずれの濾液部分中にもＤＮＡは検出されなかった。エンドトキシンレベルは、最初＝３０．７２　ＥＵ／ｍｌ、中間＝３０．７２　ＥＵ／ｍｌ及び最後−６１，４４ＥＵ／ ■ｌであった。最後の試料におけるエンドトキシン除去率は、９６．９％であった。溶液回収率は９５％（９５ｍｌで、蛋白質濃度に変化はなかった。

平成４年１２月２８日−

Claims

【特許請求の範囲】１．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液から、ＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去するに当たり前記緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液のうちの一つを第１ＤＮＡフィルターセクション及び第２ウイルスフィルターセクションに通して、前記ＤＮＡ、ウイルス及びエンドトキシンを著しく除去し、前記緩衝水溶液、薬剤水溶液又は生物学的薬剤水溶液を集め、この際前記第１ＤＮＡフィルターセクションには、（ｉ）第１絶対細孔フィルター、（ｉｉ）（ａ）ＤＥＡＥセルロースフィルター膜及び（ｂ）ＤＥＡＥセルロース、第四アミノエチル塩及び第四アミノメチル塩のうちの少なくとも１種で被覆された絶縁細孔フィルターのいずれかより選択された第１及び第２のフィルター、及び（ｉｉｉ）第２絶対細孔フィルターを設け；かつ前記第２ウイルスフィルターセクションには、ＤＮＡフィルターセクションにおける絶対細孔フィルターより細孔径の小さい絶対細孔フィルターを設けることを特徴とするＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する方法。２．濾過された溶液中の薬剤又は生物学的薬剤の収率が、出発溶液と比較して９０％以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。３．ウイルス除去率はウイルスが０．１００ミクロン以上の大きさである場合に９９．９９９９９９７％以上であり、濾過された溶液中の薬剤又は生物学的薬剤の収率は出発溶液と比較して９０％以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。４．濾過された溶液中の前記ＤＮＡが、溶液１００ｍｌ当たり１０ピコグラム未満であることを特徴とする請求項１記載の方法。５．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液が、３〜９の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項１記載の方法。６．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液がそれぞれ０．５モル未満の特定塩含有量を有し、前記特定塩が、ホスフェート、クロライド、ブロマイド、イオダイド、サルフェート及びアセテート陰イオンのリチウム、ナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩よりなる群より選択された少なくとも一つであることを特徴とする請求項１記載の方法。７．濾過された溶液中の前記ＤＮＡが、溶液１００ｍｌ当たり１ピコグラム未満であることを特徴とする請求項１記載の方法。８．薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液からＤＮＡ及びウイルスを除去するに当り前記溶液のいずれか一つを第１ＤＮＡフィルターセクション及び第２ウイルスフィルターセクションに通して、著しく減少したＤＮＡ及びウイルスのレベルを有する濾過された薬剤水溶液又は濾過された生物学的薬剤水溶液を得；この際前記溶液を（ａ）第１の０．２ミクロン絶対細孔フィルター、第１のジエチルアミノエチルセルロースフィルター、第２のジエチルアミノエチルセルロースフィルター及び第２の０．２ミクロン絶対細孔フィルターを具える第１ＤＮＡフィルターセクション、及び（ｂ）第１の０．１ミクロン絶対細孔フィルター、第２の０．１ミクロン絶対細孔フィルター、第１の０．１４ミクロン絶対細孔フィルター及び第２の０．０４ミクロン絶対細孔フィルターを具える第２ウイルスフィルタセクションに通し；濾過された溶液を集めることを特徴とするＤＮＡ及びウイルスを除去する方法。９．濾過された溶液中の薬剤又は生物学的薬剤の収率が９０％以上であることを特徴とする請求項８記載の方法。１０．ウイルス除去率はウイルスが０．１００ミクロン以上の大きさである場合に９９．９９９９９９９７％以上であり、濾過された溶液中の薬剤又は生物学的薬剤の収率は９０％以上であることを特徴とする請求項８記載の方法。１１．濾過された薬剤及び生物学的薬剤溶液中の前記ＤＮＡを、溶液１００ｍｌ当たり１０ピコグラム未満まで減少することを特徴とする請求項８記載の方法。１２．薬剤溶液又は生物学的薬剤溶液が６〜８の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項８記載の方法。１３．薬剤又は生物学的薬剤が、薬剤又は生物学的薬剤のほかに、０．５モル未満の特定塩含有量を有し、前記特定塩が、ホスフェート、クロライド、ブロマイド、イオダイド、サルフェート及びアセテート陰イオンのリチウム、ナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩よりなる群より選択された少なくとも一つであることを特徴とする請求項８記載の方法。１４．前記緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液を、真空手段又は加圧手段により、前記ＤＮＡフィルターセクション及び前記ウイルスフィルターセクションに通すことを特徴とする請求項１又は８記載の方法。１５．濾過された薬剤溶液又は生物学的薬剤溶液中の前記ＤＮＡを、溶液１００ｍｌ当たり１ピコグラム未満まで減少することを特徴とする請求項８記載の方法。１６．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液からＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置において、前記装置は、適当な入口／出口手段を有するハウジング、内部ガスケット及びフィルター支持体並びに内部フィルターを具え、さらに第１ＤＮＡフィルターセクション及び第２ウイルスフィルターセクションを具え；前記第１ＤＮＡフィルターセクションは、流入側から流出側の方向に、第１の０．２ミクロンフィルター、第１のジエチルアミノエチルセルロースフィルター、第２のジエチルアミノエチルセルロースフィルター及び第２の０．２ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触しており；前記第２ウイルスフィルターセクションは、流入側から流出側の方向に、第１の０．１ミクロンフィルター、第２の０．１ミクロンフィルター、第１の０．０４ミクロンフィルター及び第２の０．０４ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触していることを特徴とするＤＮＡ、エンドトキシソ及びウイルスを除去する装置。１７．前記０．２、０．１及び０．０４フィルターが絶対細孔フィルターであることを特徴とする請求項１６記載の装置。１８．前記装置が、溶液１００ｍｌ当たり１０ピコグラム未満のレベルまでＤＮＡを除去することできることを特徴とする請求項１６記載の装置。１９．前記装置が０．１００ミクロン以上の大きさのウイルスの９９．９９９９９９７％を除去することができることを特徴とする請求項１６記載の装置。２０．前記装置が、濾過された溶液中の薬剤又は生物学的薬剤について、濾過されていない溶液と比較して９０％以上の収率を与えることを特徴とする請求項１６記載の装置。２１．濾過しようとする溶液を、加圧手段又は真空手段により、前記装置に通すことを特徴とする請求項１６記載の装置。２２．前記装置が、前記緩衝水溶液、薬剤水溶液又は生物学的薬剤水溶液を患者へ投与する手段であり、その手段が前記ＤＮＡフィルターセクション及びウイルスフィルターセクションを具えることを特徴とする請求項１６記載の装置。２３．前記装置が、前記ＤＮＡ除去フィルター及びウイルス除去フィルターを具える注射器濾過装置であることを特徴とする請求項１６記載の装置。２４．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液からＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置において、前記装置は、適当な入口／出口手段を有するハウジング、内部ガスケット及びフィルター支持体並びに内部フィルターを具え、さらに第１ＤＮＡフィルターセクション及び第２ウイルスフィルターセクションを具え；前記第１ＤＮＡフィルターセクションは、流入側から流出側の方向に、第１の０．２ミクロンフィルター、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ、ＱＡＭ及び他の第四アンモニウム塩よりなる群より選択された少なくとも一つで被覆された第１及び第２の絶対細孔フィルター及び第２の０．２ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触しており；前記第２ウイルスフィルターセクションは、法入側から流出側の方向に、第１の０．１ミクロンフィルター、第２の０．１ミクロンフィルター、第１の０．０４ミクロンフィルター及び第２の０．０４ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触していることを特徴とするＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置。２５．前記装置が、溶液ｍｌ当たり１ピコグラム未満のレベルまでＤＮＡを除去することができることを特徴とする請求項１４記載の装置。２６．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液からＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置において、前記装置は、適当な入口／出口手段を有するハウジング、内部ガスケット及びフィルター支持体並びに内部フィルターを具え、さらに第１ＤＮＡフィルターセクション及び第２ウイルスフィルターセクションを具え；前記第１ＤＮＡフィルターセクションは、流入側から流出側の方向に、第１の０．２ミクロンフィルター、及び第２の０．２ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触しており；前記第２ウイルスフィルターセクションは、流入側から流出側の方向に、第１の０．１ミクロンフィルター、第２の０．１ミクロンフィルター、第１の０．０４ミクロンフィルター及び第２の０．０４ミクロンフィルターを具え、これらのフィルターは面と面とが接触しており、前記絶対細孔フィルターの少なくとも一つがＤＥＡＥ、ＱＡＥ、ＱＡＭ及び他の第四アンモニウム塩よりなる群のうちの少なくとも一つで被覆されていることを特徴とするＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置。２７．緩衝水溶液、薬剤水溶液及び生物学的薬剤水溶液からＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置において、これらの溶液の入口手段及び出口手段を有するハウジング、フィルターセクションの積み上げた組立体及び前記フィルターセクションのための内部ガスケット手段及び支持手段を具え、前記組立物はＤＮＡフィルターセクション及びウイルスフィルターセクションを有し、これらのフィルターセクションはここを通過する上述の溶液からＤＮＡ、ウイルス及びエンドトキシンを著しく除去するように構成及び配置されており、さらに上述のようにしてＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去した後に前記溶液を集めるための手段を具えることを特徴とするＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスを除去する装置。２８．前記ＤＮＡフィルターセクションは、（ｉ）第１絶対細孔フィルター、（ｉｉ）（ａ）ＤＥＡＥセルロースフィルター膜及び（ｂ）ＤＥＡＥセルロース、第四アミノエチル塩及び第四アミノメチル塩のうちの少なくとも一つで被覆された絶対細孔フィルター、及び（ｉｉｉ）第２絶対細孔フィルターを具え、前記ウイルスフィルターセクションは、ＤＮＡフィルターセクションにおける絶対細孔フィルターより小さい孔径の絶対細孔フィルタ、を具えることを特徴とする請求項２７記載の装置。