FI101151B - Menetelmä proteiinin puhdistamiseksi - Google Patents

Description

101151

Menetelmä proteiinin puhdistamiseksi - Ett sätt att rengöra proteiner Tämä keksintö koskee menetelmää proteiinin puhdistamiseksi siihen sitoutuneista 5 moniarvoisista metalli-ioneista.

Monet biologisesti aktiiviset proteiinit ovat saavuttaneet laajaa käyttöä tärkeinä lääkkeinä. Johtuen pääasiassa erilaisista puhdistusmenetelmistä nämä proteiinit ovat taipuvaisia sisältämään suhteellisen suuria määriä erilaisia metalleja. Tutkimus me-10 tallien määristä eri biologisissa tuotteissa julkaistiin vuonna 1986 (6) ja tästä tutkimuksesta käy ilmi, että metallien määrät esimerkiksi ihmisen seerumialbumiinissa voivat saavuttaa arvot, jotka ovat haitallisia potilaille.

Metallit ovat normaalisti peräisin eri lisäaineista, joita käytetään jalostettaessa ja 15 puhdistettaessa proteiineja. Esimerkiksi näihin prosesseihin liittyy normaalisti suo-datusapuaineiden ja suodattimien käyttö, joissa on suhteellisen suuri määrä suoda-tusapuaineita, tarkoituksena suodattaa liuoksia kirkkaiksi eri prosessivaiheissa. Näiden suodatusapuaineiden on havaittu usein sisältävän metalleja, jotka kykenevät sitoutumaan proteiiniin ionimuodossa. Nämä ongelmat voidaan välttää käyttämällä 20 muita suodatusmenetelmiä käyttäen meriteihin materiaaleihin perustuvia suodattimia. Tällaiset suodattimet ovat kuitenkin tällä hetkellä erityisen kalliita verrattuna tavanomaisesti käytettyihin suodatinmateriaaleihin.

Monien proteiinien kyseessä ollen moniarvoisia metalli-ioneja on sitoutunut lujasti 25 proteiiniin todennäköisesti johtuen kelatiinimuodostuksesta ja ionivaihtovaikutuksis-ta.

Ponnisteluja on myös tehty sitoutuneiden metalli-ionien poistamiseksi käsittelemällä niitä eri kompleksinmuodostajilla, kuten EDTA:lla tai sitraatti-ioneilla. Metalli-ionit 30 ovat kuitenkin sitoutuneet niin vahvasti proteiineihin, etteivät nämä ponnistelut ole saavuttaneet menestystä.

Proteiineissa epäpuhtautena olevat moniarvoiset metalli-ionit saattavat koostua esimerkiksi yhdestä tai useammasta seuraavasta metallista: alumiini, kromi, lyijy, elo-35 hopea, rauta, nikkeli, kupari ja magnesium. Näistä metalli-ioneista alumiinin, raudan ja lyijyn poisto on kaikkein tärkeintä.

101151 2

Alumiinin, joka on yleisin metalli maankuoressa, on oletettu muodostavan syyopilli-sen tekijän lukuisissa kliinisissä sairaustiloissa, kuten Alzheimer-tyyppisessä van-huudentylsistymisessä (1,2) ja dialyysiaivotaudissa (3,4,5) jne. On selvästi vahvistettu, että alumiinia kertyy kudoksiin ja sillä on myrkyllinen vaikutus potilaisiin, 5 jotka kärsivät munuaistoiminnan häiriöistä.

Muiden metallien, kuten raudan, kromin, nikkelin ja lyijyn vahingollinen vaikutus on aikaisemmin tunnettu johtuen joko niiden normaalista myrkyllisyydestä tai niiden kyvystä esimerkiksi edistää allergioita.

10

Edellä mainitut haitat vältetään tämän keksinnön avulla, joka kohdistuu menetelmään puhdistaa proteiinit niihin sitoutuneista moniarvoisista metalli-ioneista niin, että lopputuotteena saadaan yksi tai useampia proteiineja, joissa vahvasti sitoutuneiden moniarvoisten metalli-ionien määrä on suuresti vähentynyt.

15 Tämän keksinnön mukaisesti proteiini puhdistetaan siihen sitoutuneista moniarvoisista metalli-ioneista vapauttamalla moniarvoiset metalli-ionit vaihtamalla mainitut moniarvoiset ionit yksiarvoisiin metalli-ioneihin ja poistamalla korvatut moniarvoiset metalli-ionit. Tämän keksinnön erikoistoteutusmuodon mukaisesti yksiarvoiset 20 metalli-ionit poistetaan myös tämän jälkeen.

Yksiarvoiset metalli-ionit, joita käytetään moniarvoisten metalli-ionien korvaamiseen, ovat pääasiassa alkalimetallikationeja ja tällöin erityisesti natrium- tai kalium-kationeja tai ammoniumkationeja.

25

Liitteenä oleva piirros on juoksukaavio vastasuodatusprosessista, joka muodostaa tämän keksinnön erään toteutusmuodon ja jota kuvataan yksityiskohtaisemmin seu-raavissa esimerkeissä.

30 Proteiiniin sitoutuneet moniarvoiset metalli-ionit vaihdetaan yksiarvoisiin metalli-ioneihin käsittelemällä proteiiniliuosta suuriväkevyyksisellä yksiarvoisen metalli-ionin suolan liuoksella. Tämä prosessi siirtää tasapainoa niin, että yksiarvoiset kationit syrjäyttävät moniarvoiset kationit. Vapautuneet moniarvoiset metallikationit voidaan sitten poistaa yhden tai useamman tunnetun prosessin avulla. Prosesseja, 35 jotka on havaittu erityisen toimintakykyisiksi kummassakin vaihtovaiheessa, ovat vastasuodatus ja geelisuodatus.

101151 3

Vastasuodatuksen kyseessä ollen suodatettava neste pannaan virtaamaan yhdensuuntaisesti suodattimen pinnan kanssa ja suodattuneen kohdistetaan painegradientti. Suodattimen huokoskoko valitaan puhdistettavan proteiinin molekyylikoon mukaan niin, että proteiinimolekyylit jäävät suodattimelle, kun taas metalli-ionit kulkevat 5 suodattimen läpi. Huokosten koko on normaalisti nanometrien luokkaa. Suuriväke-vyistä yksiarvoisten metalli-ionien suolan liuosta lisätään proteiiniliuokseen, ennen kuin liuos johdetaan suodatinpinnan yli. Tämä saa sitoutuneet moniarvoiset metalli-ionit syrjäytymään proteiinista ja korvautumaan yksiarvoisilla metalli-ioneilla ja moniarvoiset metalli-ionit kulkevat sitten suodattimen läpi suodoksessa. Yksiarvoi-10 sen metallin suolan lisäliuos, jonka määrä vastaa poistettua suodosta, lisätään sitten saatuun proteiiniliuoskonsentraattiin ja liuos kierrätetään lisäsuodatukseen ja tätä prosessia jatketaan, kunnes moniarvoisten metalli-ionien sisältö on laskenut haluttuun arvoon.

15 Haluttaessa vastasuodatusprosessia voidaan sitten jatkaa lisäämällä vettä suolaliuoksen sijasta yksiarvoisten metalli-ionien syrjäytyessä proteiinimolekyylistä ja poistuessa suodattimen läpi.

Samoja periaatteita voidaan soveltaa geelisuodatuksessa käyttäen jotakin tunnettua 20 geelisuodatusmateriaalia, esim. silloitettua dekstraanigeeliä, kuten SephadexR G 10 tai G 25. Geelisuodatusmateriaali valitaan niin, että sillä on asianmukainen huokoskoko, joka on sopusoinnussa puhdistettavan proteiinin molekyylikoon kanssa. Gee-lisuodatusprosessi suoritetaan pitäen proteiinia puskuriliuoksessa, joka sisältää suuren määrän yksiarvoista metallisuolaa, sitoutuneiden moniarvoisten metalli-ionien 25 syrjäyttämiseksi. Haluttu puhdistusvaikutus voidaan saavuttaa useimmissa tapauksissa lisäämällä riittävä määrä yksiarvoisen metallin suolaa geelisuodatettavaan näytteeseen. Kun geelisuodatinmateriaalin huokoskoko on oikein sovitettu, proteiini virtaa suodatinväliaineen läpi samalla, kun moniarvoiset metalli-ionit jäävät jälkeen, mikä tekee mahdolliseksi mainittujen moniarvoisten metalli-ionien eristämisen pro-30 teiinista.

Yksiarvoisen metallisuolan määrä liuoksessa, jota käytetään moniarvoisten metalli-ionien syrjäyttämiseen proteiinista vastasuodatus- tai geelisuodatusprosessissa, voi vaihdella suhteellisen laajoissa rajoissa. Tämän alueen absoluuttisesti alimman rajan 35 määrää fysiologinen suolasisältö, siis 0,9 % paino/tilavuus tai 0,15-M. Ylärajan määrää periaatteessa kyseisen suolan kyllästyspitoisuus ko. liuoksessa, vaikka muillakin tekijöillä voi olla merkitystä. Esimerkiksi suuret suolapitoisuudet voivat 101151 4 pilata eräitä proteiineja. Tähän alaan perehtyneellä henkilöllä ei ole kuitenkaan mitään vaikeutta löytää toimivaa suolapitoisuutta yksinkertaisten kokeiden perusteella.

Erityisesti erityyppisiä proteiineja voidaan puhdistaa tämän keksinnön menetelmän 5 avulla. Menetelmän on havaittu olevan erityisen hyödyllinen albumiinin, kuten ihmisen seerumialbumiinin ja gammaglobuliinin puhdistamisessa. Tämä keksintö ei kuitenkaan rajoitu pelkästään näiden proteiinien puhdistamiseen.

Keksintöä kuvataan nyt tarkemmin viitaten seuraaviin esimerkkeihin.

10

Esimerkki 1 5 1 ihmisen seerumialbumiinin (HSA) 10-prosenttista liuosta vastasuodatettiin 15 litraa vastaan 1 -M natriumkloridiliuosta. Menetelmän toteuttamiseen käytetty laitteisto 15 on esitetty kaavamaisesti liitteenä olevassa piirroksessa.

Laitteisto sisältää veden varastosäiliön 1 ja 1-M natriumkloridiliuoksen syöttösäiliön 2. Varastosäiliöt on yhdistetty yhteiseen putkeen 7, joka johtaa alumiiniliuoksen varastosäiliöön 8 poistoputkien 3 ja 5 ja venttiilien 4 ja 6 kautta samassa järjestykses-20 sä. Albumiiniliuos johdetaan säiliöstä 8 putken 9 läpi ultrasuodatuslaitteeseen 10, jonka suodattimen huokoisuus on 10 000 ("katkaisu"-moolimassa). Suodos poistetaan suodatinlaitteesta 10 putken 11 läpi ja konsentraatti kierrätetään takaisin putken 12 läpi varastosäiliöön 8. Poistetun suodoksen tilavuus on F( ja yhtä suuri tilavuus Fi vettä tai suolaliuosta johdetaan varastosäiliöön 8 putken 7 läpi tilavuuden pitämi-25 seksi vakiona.

Suodatusprosessin aikana venttiili 4 suljetaan ja venttiili 6 avataan aluksi ja suolaliuos johdetaan varastosäiliöstä 2 varastosäiliöön 8 moniarvoisten metalli-ionien syrjäyttämiseksi proteiinista ja nämä moniarvoiset metalli-ionit poistetaan sitten 30 suodoksen mukana putken 11 läpi. Kun suodatusprosessi on jatkunut niin pitkän ajan, että moniarvoisten metalli-ionien määrä proteiinissa on laskenut haluttuun arvoon, venttiili 6 suljetaan ja venttiili 4 avataan ja suodatusprosessissa jatketaan lisäämällä puhdasta vettä yksiarvoisten metalli-ionien syrjäyttämiseksi vuorostaan proteiinista ja mainittujen yksiarvoisten ionien poistamiseksi suodoksen mukana 35 putken 11 läpi. Suodatusta puhdasta vettä lisäten jatketaan sitten, kunnes yksiarvoisten metalli-ionien määrä on laskenut haluttuun arvoon.

101151 5

Kuvatussa esimerkissä 15 1 1-M natriumkloridiliuosta lisätään jatkuvasti albumiini-liuokseen suodatusprosessin aikana, minkä avulla albumiiniliuoksessa olevien moniarvoisten metalli-ionien, esim. alumiini-ionien määrä laskee arvoon alle 30 pg/l. Metallipitoisuuden syöttöarvot ovat normaalisti välillä 200-1500 μg/l. Epämieluis-5 ten moniarvoisten metalli-ionien määrän pieneneminen proteiinissa on näin ollen erittäin huomattavaa.

Fe:n, Pb:n ja Cr:n määrät syöttöalbumiiniliuoksessa olivat 3,2, 0,36 ja 0,6 mg/1 samassa järjestyksessä. Käsittelyn jälkeen näiden määrien havaittiin laskeneen arvoi-10 hin 0,3, 0,08 ja 0,02 mg/1 samassa järjestyksessä.

Esimerkki 2

Plasman etanolifraktioinnista saatua epäpuhdasta albumiinia (Fr.V) liuotettiin noin 15 10 %:n pitoisuudeksi veteen. Liuos suodatettiin ja pH säädettiin arvoon 7,0.

Vastasuodatus suoritettiin sitten natriumkloridiliuosta vastaan, joka sisälsi 2 mol/1 NaCl. Kaikkiaan käytettiin 135 1 tätä liuosta. Jokaista lisättyä 45 litraa kohti otettiin näytteet alumiinipitoisuuden määrittämistä varten. Käytettiin ultrasuodattimia, joi-20 den "katkaisu"-moolimassa oli 10 000. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Vastasuodatusliuosta lisätty Al-pitoisuus, mg/1 0 0,35 45 0,16 90 0,11 135 0,04 25 Natriumpitoisuuden pienentämisen jälkeen alumiinipitoisuuden havaittiin olevan 0,01 mg/1.

Esimerkki 3 30 Esimerkin 2 mukaista epäpuhdasta albumiinia liuotettiin tislattuun veteen noin 10%:n pitoisuudeksi. Liuos suodatettiin ja suodoksen pH säädettiin arvoon 7,0.

101 Ib Ί 6

Kokonaistilavuus oli 3 litraa. Kiinteää natriumkloridia lisättiin liuokseen 2 mol/l.n pitoisuudeksi ja liuoksen alumiinipitoisuuden määritettiin olevan 0,86 mg/1. Liuos vastasuodatettiin sitten 9 litraa vastaan NaCl-liuosta, jonka pitoisuus oli 2 mol/1. Käytetty vastasuodattimen "katkaisu"-moolimassa oli 10 000. Albumiiniliuoksen ja 5 läpäisseen liuoksen alumiinipitoisuudet määritettiin sen jälkeen, kun annetut määrät NaCl-liuosta oli lisätty. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2

Vastasuodatetun liuok- Albumiiniliuoksen AI- Läpäisseen liuoksen sen tilavuus, 1 pitoisuus, mg/1 AI- pit., mg/1 1.5 0,41 0,56 3 0,32 0,31 4.5 0,23 0,24 6 0,16 0,16 9 0,09 0,10 10

Albumiiniliuos vastasuodatettiin sitten 30 litraa vastaan tislattua vettä suolanpoisto-tarkoituksessa ja liuoksen alumiinipitoisuus määritettiin suolanpoistoprosessin aika na. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 34.

15 Taulukko 3

Tilavuus, 1 Alumiiniliuoksen Al-pitoisuus, mg/1 2 0,02 4 <0,01 6 <0,01 8 <0,01 10 <0,01

Liuos väkevöitiin 20 %:n albumiinisisältöön suolanpoistoprosessin jälkeen, minkä jälkeen alumiinipitoisuudeksi mitattiin 0,02 mg/1.

20 101151 7

Esimerkki 4 41,4 kg 10-prosenttista albumiiniliuosta säädettiin pH-arvoon 7,0 ja natriumkloridia kiinteässä muodossa lisättiin 2 mol/l:n pitoisuuteen. Näyte liuoksesta analysoitiin « 5 sen AI-, Fe-, Cr-ja Mg-pitoisuuden suhteen.

Liuos vastasuodatettiin 125 litralla natriumkloridiliuosta, jonka pitoisuus oli 2 mol/1. Liuoksesta poistettiin sitten suolaa tislatulla vedellä, kunnes natriumpitoisuuus oli alle 0,7 mg/ml. Tämä taso saavutettiin, kun oli lisätty 250 litraa tislattua vettä.

10

Liuoksen suolanpoiston jälkeen liuos väkevöitiin 20 %:n albumiinipitoisuuteen ja suodatettiin steriilisti ja annosteltiin pulloihin (100 ml) lämpökäsiteltäväksi 60 °C:ssa 10 tunnin ajan. Edellä mainittujen metallien määrät liuoksessa määritettiin ennen suolanpoistoprosessia ja pullojen lämpökäsittelyn jälkeen ja saadut analyysi-15 tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 4.

Taulukko 4 mg/1 AI Fe Cr Mg Lähtöaine laskettu 20 %:n alumiinipitoisuuteen 0,47 4,34 0,08 2,51

Vastasuodatuksesta saatu konsentraatti 0,02 0,7 0,03 0,1

Pulloissa lämpökäsittelyn jälkeen 0,02 0,3 <0,01 0,1 20 Tämä keksintö saa näin ollen aikaan yksinkertaisen ja sopivan menetelmän proteiiniin sitoutuneiden epämieluisten moniarvoisten metalli-ionien poistamiseksi. Menetelmää voidaan soveltaa yleisesti proteiinien puhdistamiseen, eikä se rajoitu pelkästään tässä asiakirjassa kuvattuihin esimerkkeihin. Havaitaan myös, että lisävaihtelut ja -muunnokset tähän keksintöön ovat mahdollisia seuraavien patenttivaatimusten 25 suojapiirin puitteissa. Proteiinit voidaan esimerkiksi puhdistaa ultrasuodatuksella, vaikka tämä menetelmä ei ole yhtä rationaalinen kuin kuvattu menetelmä, koska tällöin on välttämätöntä lisätä enemmän suolaliuosta tai vettä. Keksinnön periaatteet pysyvät kuitenkin muuttumattomina.

101151 8

Kirjallisuusviitteet: 1. Crapper D.R., Kishnan S.S., Quittat S. Aluminium, neurofibrillary degeneration and Alzheimer's disease. Brain 1976, 99, 67-80.

5 2. Crapper D.R., Quittat S., Krishnan S.S. et al.: Intranuclear aluminium content in Alzheimer's disease, dialysis encephalo-Acta Neuropath 1980, 50, 19-24.

3. Alffey A.C., Le Gendre G.R., Kaehny W.D.: The dialysis encephaplopathy 10 syndrome. Possible aluminium intoxication. N. Eng. Med. 1976, 294, 184-188.

4. Alffey A.C., Hegg A., Craswell P.: Metabolism and toxicity of aluminium in renal failure. Am. J. Clin. Nutr. 1980, 33, 1509-1516.

15 5. Per D.P., Gajdusek D.C., Garruto R.M. et al.: Intraneuronal aluminium accumu lation in amyothropic lateral sclerosis and Parkinson-dementia of Guam. Science 1982, 217, 1053-1055.

6. May J.C., Rains T.C., Maienthal F.J. et al.: A survey of the concentrations of ele-20 ven metals in vaccins, allergenic extracts, toxoids, blood, blood derivatives and other biological products. J. Biol. Stand. 1986, 14, 363-375.

Claims (6)

101151

1. Menetelmä proteiinin puhdistamiseksi siihen sitoutuneista moniarvoisista metalli-ioneista, tunnettu siitä, että moniarvoiset metalli-ionit vapautetaan proteiinista 5 korvaamalla ne yksiarvoisilla metalli-ioneilla, jotka koostuvat alkalimetalli- tai am-moniumioneista saattamalla proteiini siihen sitoutuneine moniarvoisine metalli-ioneineen vastasuodatusprosessiin vesiliuosta vastaan, joka sisältää yksiarvoisia metalli-ioneja noin 0,15-M väkevyydestä kyllästysväkevyyteen asti siten, että mainitut moniarvoiset metalli-ionit syrjäytyvät proteiinista ja saadaan suodokseen, tai 10 saattamalla proteiini siihen sitoutuneine moniarvoisine metalli-ioneineen geelisuoda-tukseen yksiarvoisten metalli-ionien vesiliuoksessa, jonka väkevyys vaihtelee noin 0,15-M:stä kyllästysväkevyyteen siten, että moniarvoiset metalli-ionit syrjäytyvät proteiinista ja jäävät jälkeen suodatuksessa, minkä jälkeen proteiinista vapautetut moniarvoiset metalli-ionit poistetaan vanhastaan tunnetulla tavalla. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen jälkeen, kun moniarvoiset metalli-ionit on korvattu yksiarvoisilla metalli-ioneilla, mainitut yksiarvoiset metalli-ionit poistetaan proteiinista saattamalla mainittu proteiini uuteen vastasuodatukseen liuosta vastaan, joka ei sisällä olennaisesti mitään metalli- 20 ioneja, tai saattamalla mainittu proteiini uuteen geelisuodatukseen liuoksessa, joka ei sisällä olennaisesti mitään metalli-ioneja.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut moniarvoiset metalli-ionit koostuvat yhdestä tai useammasta alumiini-, rauta- ja lyi- 25 jymetallista.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut yksiarvoiset metalli-ionit koostuvat natrium-, kalium- tai ammoniumio-neista. 30

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on albumiini tai gammaglobuliini.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on 35 albumiini ja moniarvoinen metalli-ioni on alumiini-ioni. 101151