JPS626693B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血清中のγ―グロブリンとアルブミ
ンを分離する方法に関するものである。更に詳述
すれば、血清蛋白質を含む溶液を半透膜を用いて
過することにより、γ―グロブリンとアルブミ
ンとに分離する方法に関するものである。ヒト、
その他哺乳動物の血清蛋白質は主としてアルブミ
ン（分子量約７×10⁴）及びγ―グロブリン（分子
量約1.6×10⁵）で構成されており、この二種で全
血清蛋白質中の70％以上を占めている。これらの
成分は分画され、例えば、ヒト血清蛋白分画物は
医療用に供されている。これら血清蛋白質の分画
法には従来より塩析法、冷エタノール法、ポリエ
チレングリコール法等があり、最近では、ゲル
過法あるいはイオン交換クロマトグラフイー法等
が開発されている。しかし、前三法は血清蛋白質
の変性の恐れや、分離に手間がかかる等の問題が
あり、また、後二法は大量分画に適さない。 本発明者らは、半透膜による分離法の適用を考
え、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達した。 従来、半透膜を用いた分離は、例えば、巨大分
子と低分子との分離の場合のように、分子量の大
きく異なつた分子間では容易であり、例えば半透
膜を用いての透析は古くから行なわれている。 最近、比較的性能の良い非対称膜が開発され、
通常の過と同様に圧力を駆動力とした半透膜の
利用が急速に広がつている。しかし、この場合も
巨大分子間の分離は、たとえそれらの分子量がか
なり異なつていても、一般には困難とされてい
る。その理由として通常、膜の孔径分布の広さが
考えられている。しかしながら、膜透過を決定す
る因子は分子量のみではなく、実際に溶解してい
る蛋白分子は、その雰囲気、例えば、共存する異
種蛋白、緩衝液の水素イオン濃度あるいは塩濃度
によりその透過性は著しく変化する。例えば、ヒ
ト血清のγ―グロブリンとアルブミンについて酢
酸セルロース膜を用いて相互に分離したことが報
告されている（Ossら、J.E.Flinn編、メンブレ
ンサイエンスアンドテクノロジー146ページ
（1970））。 しかしながら、この方法では純粋なアルブミン
と二量体を含むγ―グロブリンの人工的混合溶液
よりの分離には成功しているものの、全血清から
これらを分離することはできなかつた。 本発明者らは、血清蛋白質の膜透過挙動に対す
る水素イオン濃度及び塩濃度の影響について研究
中、特定の条件下でアルブミンがγ―グロブリン
に比べて極めて膜を通過し易いことを見出し、本
発明を完成した。 即ち、本発明は、半透膜を用いて血清蛋白混合
物溶液中のアルブミンとγ―グロブリンとを分離
する方法において、血清蛋白混合物溶液の全蛋白
濃度及び塩濃度をそれぞれ4g／dl以下及び0.6モ
ル／以下、液性をPH3.8ないし4.7とし、半透膜
として分画分子量約10万で式

【式】または で示される繰り返し単位を持つ芳香族ポリエーテ
ルスルフオン（式中R₁，R₂は水素原子あるいは
炭素数１〜２のアルキル基である。）によつて構
成される膜を用いて限外濾過を行うことを特徴と
する血清蛋白質の分離方法を提供するものであ
る。 半透膜の分画分子量は分画される分子の形状、
その分子のおかれた雰囲気等によつて変り得るの
で、必ずしも精密に決定し得るものではないが、
本発明で云う分画分子量約10万の半透膜とは、一
般に分画分子量10万と公称して市販されている膜
の様に、蛋白質の様な球状高分子の分子量５又は
６万ないし同14又は15万程度のものを分画できる
半透膜を意味する。 本発明で使用する半透膜の厚さは、限定的では
ないが、通常一般の半透膜による過分離の場合
と同様、約40ないし約400μｍ程度のものを用い
る。 本発明の半透膜を調製するために用いる芳香族
ポリエーテルスルフオンの重合度は、限定的では
ないが通常一般の芳香族ポリエーテルスルフオン
の場合と同様、約500ないし約10000程度のものを
用いる。 本発明の方法では、過は通常の半透膜を用い
る過の場合と同様にして行うことができる。例
えば流量約0.1ないし約20／m²・hrであるが、
この値はなんら限定的でない。過圧は、好まし
くは0.1ないし５Kg／cm²程度である。 本発明では、分離すべき血清アルブミンとγ―
グロブリンとを含む溶液の全蛋白濃度は約4g／
dl以下に調節される。これを越えた場合、膜の目
詰りが生ずる場合があり分離が困難となる。 溶液の液性はPH約3.8ないし約4.7、好ましくは
PH3.9ないし4.3に調整される。PH約4.7を越えると
アルブミンの膜透過率が非常に低くなり、効率の
良い分離はできない。また、PH約3.8よりも低い
溶液ではアルブミンの変性が生ずる恐れがある。
また、溶液の塩濃度は約0.6モル／以下に調整
される。これを越える濃度では分離は期待できな
い。塩濃度は蛋白質が溶解している限り低ければ
低い程良い。通常0.001モル／以上である。 塩の種類としては、塩化ナトリウムなどの生理
的に許容される塩および血清中に本来存在する塩
である。 本発明の方法は、アルブミンとγ―グロブリン
を含む血清蛋白溶液の種々の状態のものに適用で
きる。例えば、全血清を純水あるいは緩衝液等で
希釈したもの等、溶液中にアルブミンとγ―グロ
ブリンとを含有しているものであれば良い。ま
た、本発明の方法は、ヒト血清に限らず、ウシ、
ウマ、ブタ等の血清蛋白質の分離にも適用でき
る。 本発明によれば、公知技術では効果的に行うこ
とが困難であつた全血清中のアルブミンとγ―グ
ロブリン、その他の分画とを容易に分離すること
ができる。また、アルブミンとγ―グロブリンと
の分離に当つて、γ―グロブリンの二量体の共存
を必要とすることもない。更にまた、従来の血清
蛋白質の分画法と比較して操作が簡便で分離が正
確であり、大量処理に適するものである。しか
も、透過条件を調節することにより、アルブミン
及びγ―グロブリンを所望の純度及び濃度の溶液
として、かつ所望により連続的に目的物を得るこ
とができる。 以下、実施例により更に詳しく説明するが、本
発明はこれらの例に限られるものではない。実施
例中、血清蛋白質溶液の液体クロマトグラムは東
洋曹達工業(株)製の液体クロマトグラフ、HLC―
802UR（商標）を用いて得た。 使用カラムはＧ―3000SW（東洋曹達工業(株)
製）を用い、溶離液には１／15Mリン酸塩緩衝液
（PH6.8）、検出には波長254nmの紫外吸収を見
た。また、阻止率Ｒは次式で定義する。 Ｒ＝（１−液濃度／原液濃度）×100（％） 実施例 １ 繰り返し単位 を持つポリエーテルスルフオン（ユニオンカーバ
イド社製Ｐ―1700）15gをＮ―メチル―２―ピロ
リドン100mlに溶解し、これをポリエチレン不織
布上に厚さ約200μｍに流延し、15℃の水中に浸
漬して凝固させ、非対称ポリエーテルスルフオン
膜を得た。この膜の分画分子量は約10万であり、
また、PH6.8、１／15Mリン酸塩緩衝液に濃度0.1
％で溶解したウシ血清アルブミンに対して阻止率
約80％を示した。 遠心分離して巨大な不溶物を除いたウシ血清を
純水で約５倍に希釈し、蛋白濃度を約1.5％、塩
濃度を約0.03モル／とし、これに酢酸を添加
し、PH4.1に調整した。この溶液50mlを直径43mm
の上記ポリエーテルスルフオン膜を装着した撹拌
型限外過セルに入れ、圧力0.5Kg重／cm²で、セ
ル内の溶液量が10mlになるまで過した。フイー
ド液及び得られた液を液体クロマトグラフイに
より分析した。得られたクロマトグラムを第１図
に示す。同図Ａはフイード液の、Ｂは液のクロ
マトグラムを示す。また、クロマトグラム中ａは
γ―グロブリンのピーク、ｂはアルブミンのピー
クを示す。液にはγ―グロブリンがほぼ存在し
ないことがわかる。また、セル内に残つた10mlの
液にPH4.1の酢酸緩衝液（塩濃度0.2モル／）40
mlを加え、再び加圧して10mlの溶液量まで濃縮す
るという操作を計５回行なつた。最終的に膜上に
保持された溶液の液体クロマトグラフイによるク
ロマトグラムを同じく第１図Ｃに示す。アルブミ
ンはほぼ除去されていることが明らかである。 実施例 ２ 実施例１に用いた膜とほぼ同性能を持つ同材質
の膜を用い、実施例１で用いたのと同じウシ血清
について、その液性及び塩濃度を変化させたとき
の膜に対する透過挙動を見た。第２図にPHの影響
（塩濃度0.2モル／）、第３図に塩濃度の影響
（PH4.1での）を示す。添加塩はNaClである。こ
れ等の結果により、PHが3.8〜4.7特に3.8〜4.3
で、また、塩濃度が約0.6モル／以下の場合、
良い分離が得られることがわかる。 実施例 ３ 繰り返し単位 を持つ芳香族ポリエーテルスルフオン16gを100
mlのジメチルアセトアミドに溶解し、ポリエチレ
ン不織布上に厚さ200μｍに流延し、これを水中
に浸漬して凝固させて、限外過膜を得た。この
膜の分画分子量は約10万であり、またPH6.8、1/1
５モルリン酸塩緩衝液に0.2％の濃度で溶解した卵
白アルブミン溶液に対する阻止率55％を示した。
この膜を実施例１と同じ装置を用い、酢酸により
PH4.2に調節したヒト血清の30倍希釈物（塩濃度
0.01モル／）の分離に供した。分離は実施例１
と同様にして行なつた。透過液のアルブミン濃度
はフイード液のアルブミン濃度の30％、γ―グロ
ブリンの透過は認められなかつた。 比較例 １ 市販の分画分子量10万のアクリロニトリルと塩
化ビニルとの共重合体よりなる膜（アミコン社製
XM―100）を用いて実施例１と全く同様の操作
及び分析を行なつた。 透過液にはフイード液の約５％のアルブミンが
含まれていた。しかし過時間の経過とともに透
過流量が低下した。 実施例 ４ ヒト血清をPH4.2の酢酸緩衝液（塩濃度0.2モ
ル／）で５倍に希釈し（塩濃度0.2モル／と
なつた）これを紙及び孔径0.45μｍのミクロフ
イルターで過した。得られた血清溶液を実施例
１で使用した半透膜と同材質の市販膜（公称分画
分子量10万）を用いて分離した。50mlの血清溶液
を圧力0.5Kg重／cm²で５倍濃縮しては40mlの緩衝
液を加えるという操作を６回行なつた結果、膜面
残留液中のアルブミンは当初の８％、γ―グロブ
リンは98％であつた。 実施例 ５ ポリエチレングリコール法（A.Polsonら．，
Biochim.Biophys.Acta.，82，463（1964）によ
る）で得たヒト血清第二分画物の0.5％酢酸緩衝
液（塩濃度0.2モル／、PH4.0）を調製した。こ
の溶液の液体クロマトグラフイによるクロマトグ
ラムを第４図Ａに示す。この分画物の主成分はγ
―グロブリン（フラクシヨンａ）であるが、高分
子量物及びアルブミン（フラクシヨンｂ）が多量
に混在していた。 この溶液について、実施例３で用いた半透膜と
同種の直径９cmの膜を薄層流路型セル（アミコン
社製TC―10）に装着したセルを用いて、500mlの
定量過を行なつた。即ち、セル内に常に液と
同量の0.5％酢酸緩衝液（塩濃度0.2モル／、PH
4.0）を補充し、セル内の溶液量500mlを保持し
た。約５時間の連続操作で1.5の液が得られ
た。セル内の溶液の液体クロマトグラフイによる
クロマトグラムを第４図Ｂに示す。アルブミンが
大部分除去されているのがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例で用いた血清蛋白
溶液およびこれを本発明によつて分画した蛋白溶
液の液体クロマトグラフイによるクロマトグラム
を示す図であり、第２図および第３図はそれぞれ
本発明で血清蛋白溶液の分画を行なう際の水素イ
オン濃度および塩濃度の影響を説明する図であ
る。第４図は本発明の別の一実施例で用いた血清
蛋白溶液およびこれを本発明によつて分画して得
た蛋白溶液の液体クロマトグラフイによるクロマ
トグラムを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 半透膜を用いて血清蛋白混合物溶液中のアル
   ブミンとγ―グロブリンとを分離する方法におい
   て、血清蛋白混合物溶液の全蛋白濃度及び塩濃度
   をそれぞれ4g／d1以下及び0.6モル／１以下、液
   性をPH3.8ないし4.7とし、半透膜として分画分子
   量約10万で式【式】または で表わされる繰り返し単位（式中R₁及びR₂は水
   素又は炭素数１または２のアルキル基である）を
   持つ芳香族ポリエーテルスルフオンからなる限外
   濾過膜を用いて限外濾過を行うことを特徴とする
   血清蛋白質の分離方法。