SE178463C1 - - Google Patents

Description

KLASS 12 p:16 INT. KLASS C 07 c 4 PATENTTID FRAN DEN 12 SEPTEMBER 1955 BEVILJAT DEN 11 JANUAR! 1962 PUBLICERAT DEN 13 MARS 1962 Ans. 8143/1955 den 12/9 19 H B KLEVENS, PITTSBURGH, PENN., USA Sin aft isolera proteiner i ren och odenaturerad form Prioritet beglird Iran den 15 september 1954 (USA) Eireliggande uppfinning avser ett salt att isolera proteiner i mycket ren och -odenaturerad form samt en modifikation av sattet for fraktionerad separation av ett flertal proteiner i mycket ren och odenaturerad form fran en blandning air proteiner riled olika iso-elektriska punkter.

Det liar forut visats, att anjoner -av lagm-olekylara fettsyror utova en markbart -stabiliserande verkan pa proteiners koagulering vid uppvirmning, cm de aro narvarande i laga koncentrationer 1 losningar av seruanalburnin fran manniska. Det ,ar awn kant, latt denna verkan okar med okad kedjelangd pa fettsyTans anion, -och att maximal stabilisering er-halles vid koncentrationen 0,15 mol/liter med. salter -av fettsyror, som ha 7-8 kolatomer i kedjan. Over denna koncentration intrfider gelbildning -och under denna koncentration okar stabiliseringen med okning av kedjelangden upp till 12 kolatomer i kedjan, varefter derma verkan minskar med iikad koncentration. Den minskade verkan, som erhalles med salterna till h8gre fettsyror med mer an 8 kolatomer, ansags mojligen hero pa egen.skapen hos amnen med rengorande effekt att astadkomma denaturering av proteiner. Dodecylsulfat har visat sig fororsaka denature-ring av serumalbumin, men det har dock i lag koncentration en stabiliserande effekt, liknande den som erhalles med lauratjone-n. Allteftersom koncentrationen av fettsyrasalter okades med sju eller Hera kolatomer kedjan, nadde man en punkt, vid vilken icke flagon injOlkig fanning lingre erholls vid forhojd temperatur, utan man fick i stallet en klar gel. Det dr kant, -att de -omstandigheter, vilka skydda albumin fran denaturering vid .uppvarmning, icke verka pa samma ,satt for att skydda andra proteiner. Vamestabiliteten, matt med tiden fOr gelbildning, hos losningar av 10/20- gramprocent -globulin frail serum minskas genom tillsats av kaprylat eller mandelat. Difteritoxin, difteriantitoxin och papain gjordes Sven mindre varmebestandiga med kaprylat. I motsats till denim effekt hos anjoner visade sig katjoner med icke p0- ldraOka serumalbumins kanslighet for denaturering genom uppvarmning. Tillsatser av dodecylaminhydroklorid och hexyluminhydroklorid till losningar av 25 gram7procent albumin vid ett pH-varde av 7-8 minskar den temperatur, grumlingspunkten (cloud point temperature) vid vilken utflockfling sker, i proportion till aminens koncentration. 0,15 mol/liter ger minskningar pa 10° respektive 40° C.

Det har visat sig, att ytterligare karboxylgrupper minska den alifatiska syrans skyddsverkan. Salunda aro natriumsuccinat och -fumarat mycket mindre effektiva ian propiomat oeh lautyrat. Trikloraeetat, som i form av syra liar anvants som fallningsmedel for proteiner, visade sig Oka varmestabiliteten has albumin 'och dess effekt var -a-v -samma starleksordning som kapronats. Monokloracetat liar mycket mindre skyddande effekt an trikloracetat men dock storre an acetat.

Trifluorattiksyra -Sr ett nytt fallningsreagens I Or mucoider (muco) och andra proteiner.

Anjoniska rengoringsmedel forenade sig med proteiner, till -och med pa -den alkaliska .sidan ,orn den isoelektriska punkten, och det erhallna komplexets egen-skaper visade sig i -hog grad Tara beroende pa viktforhallandet rengoringsmedel/protein snarare An pa den absoluta koncentrationen av rengoringsmedel.

Sadana reng5ringsmedel ge upphov till en mycket djupgaen:de forandring i den molekylara strukturen, varigenom proteinerna denatureras. Ehuru utfallningen av proteiner anedelst rengoringsmedel visade sig Tara begransad till :omritden, mom vilka proteinet och rengoringsmedlet buro laddningar -av anotsatt tecken, bestd fOreningar av anj-oniska rengoringsmedel och protein pa den alkaliska sidan av den isoelektriska punkten. Den relativa effektiviteten av homologa serier av olika anjoniska rengoringsmedel studerades pa raggalbumin och fl-laktoglobulin. Sulfat.och sulfonatderivat, innehalla:nde mer an atta 2— kolatomer, visade sig darvid •utfalla proteiner, Elektroforetisk analys visade, att en alining med natriumdodecylsulfat endast astadkom partiell separering av komponenterna i en syntetisk blandning av renad albumin och globulin, buffrad mom det isoelektriska omradet. Journal of Biological Chemistry 153, 589 (1944); Journal of Biological Chemistry 159, 111 (1045); Journal of Biological Chemistry 162, 181 (1946); Journal of Biological Chemistry 167, 407 (1947); Advance in Protein Chemistry, Vol. IV, 1948, sidorna 79122 och Discussions of the Faraday Society, nr 13, sidan 251 (1953).

Sattet enligt uppfinningen kannetecknas darav, att en vattenlasning av minst ett proteinhaltigt amne forsattes med_ en minst fyra kolatomer innehallande, helt eller delvis fluorerad alifatisk syra, varvid syran bindes vid proteinet och en komplexforening av fluorerad syra och protein bildas, att pH-vardet i losnincr6en av komplexforeningen installes i huvudsak pa den isoelektriska punkten for proteinet, varigenom komplexforeningen ut-: att fallningen franskiljes, att komplexforeningen av fluorerad syra och protein spjalkas och att syran avlagsnas.

Sattet enligt uppfinningen genomf Ores lampligen sa, att en vattenlosning av minst ett proteinhaltigt amne forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, belt eller delvis fluorerad alifatisk syra, som har en icke -polar grupp bunden vid en anjonisk eller katjonisk grupp, varvid pH-vardet i den. erMina losningen skall ligga mom ett omrade, i vilket den fluorerade syran bar en laddning av samma tecken sem laddningen pa proteinet, varigenom syran bindes vid proteinet och en lOsning av en komplexforening av fluorerad syra och protein bildas, att lasningens pH-varde installes mom ett omrade, unrsefar fran proteinets isoelektriska punkt till ett pH-varde. vid -vilket syran bar en laddning av motsatt tecken till laddningen pa proteinet, varigenom komplexforeningen utf alles, att fallningen franskiljes, att komplexforeningen av fluorerad syra och protein spjalkas och att syran avlagsnas.

Enligt en modifikation av sattet enligt uppfinningen kan man isolera ett protein i myc- ket ren och odenaturerad form fran ett proteinhaltigt material, innehallande en i vat-ten olaslig fOrorening, genom att en vattenlosning av det protemhaltiga materialet forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, hell eller delvis fluorerad alifatisk syra, som bar en ieke polar grupp bunden vid en anjonisk eller katjonisk grupp, varvid pHvardet i den erhallna losningen skall ligga mom ett omrade, i vilket den fluorerade syran bar en laddning av samma tecken som laddningen ph proteinet, varigenom syran bindes vid proteinet och en losning av en. komplexforening av fluorerad syra och pro- tein bildas, att den i vatten .olosliga fororeningen avlagsnas .oeh att komplexforeningen av fluorerad syra och protein spjalkas °eh att syran avlagsnas, varigenom det fran fororeningar befriade proteinet erhalles i losning.

Enligt en annan modifikation av sattet enligt uppfinningen kan man fraktionerat separera ett flertal proteiner i mycket ren och odenaturerad form frail en blandning av pro- teiner med olika isoelektriska punkter dar- igenom, att en vattenlosning av en blandning av proteiner forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, hell eller delvis fluo- rerad alifatisk syra, som liar en iclie polar grupp bunden vid en anjonisk eller katjonisk grupp, varigenom den fluorerade syran bin- des -vid proteinerna och komplexforeningar av fluorerad syra och protein bildas, varvid pHvardet i den erhallna losningen skall Raga inom ett omrade, i vilket de bildade komplex- foreningarna aro losliga, att losningens pH-v-5"de upprepade ganger regleras till ett om- rade, mom vilket en komplexforening utf alles, att varje utfalld komplexforening avlagsnas separat, varje komplexfarening av fluorerad syra och protein spjalkas ,och att syran avlagsnas.

Den vid fOreliggande satt anvanda, helt eller delvis fluorerade alifatiska syran utgores fOretradesvis av perfluorkapronsyra, per- fluorkaprylsyra eller perfluorkaprinsyra. Lampliga aro liven perfluorsmorsyra, per- fluorlaurinsyra och motsvarande syror, i vilka ca-fluoratomen liar ersatts med en vale-atom.

Fluorforeningen kan avladsnas fran den fallda komplexforeningen eller fran en las- ning av komplexforeningen genom utspad- ning med en stor volym volt-en eller riled en lamplig vattenhaltig buffertlosning genom di- alys med Tanen eller en. lamplig buffertlOs- ning eller genom behandling av en lasning av komplexforeningen med en lamplig jonby- tare. Om en utfald komplexforening utspades eller dialyseras med en vattenlosning, som lir .buffrad vid ett pH, som Jigger Over eller under proteinets isoelektriska punkt, erhalles en proteinlosning, som är i huvudsak fri lean fluorforening.

Foljande exempel visar bildandet av en komplexfarening mellan en fullstandigt fluorerad alifatisk syra och albumin fran oxserum. Procent betecknar i foljande exempel viktprocent.

Exempel 1. 2 ml 1-procentig vattenlosning av oxserumalbumin, buffrad med en acetatbuffert vid pH 5,8 och med jonstyrkan 0,1, halides i en cellofanhylsa med diametern 1,3 om. Hylsan, i vilken proteinlosningen befann sig, placerades i 20 ml 0,5-procentig vattenlosning av perfluorkaprylsyra, buffrad med en acetatbuffert vid pH 5,8 och med jonstyrkan 0,1. Kolven holls vid en temp eratur av - -a 25° C .och skakades 2 timmar, vilken lid erfordrades for att jamvikten skulle stalla in sig. Dialysatet analyserades pa perfluorkaprylatj oner genom matning av ytspanningen, varvid skillnaden i fri och ursprunglig jonkoncentration utgor inangden perfluorkaprylatjoner, son' inghtt komplexforening flied ,oxserumalbuminen. 54 molekyler air perfluorkaprylatjonerna voro komplext bundna vid varje molekyl oxserumalbumin. Acetatbuffert med pH 4,3 ()eh jonstyrkan 0,1 tillsattes i erforderlig mangd till innehallet i cellofanhylsan for att nedsatta dess pH-varde till 4,8. En fanning air komplexforeningen bildades sd snart pHvardet sankts till 4,88, vilket ar ■oxserumalbuminens isoelektriska punkt. Cellofanhylsan, innehallande den utfallda komplexforeningen, dialyserades med 55 ml vattenl5sning air en acetatbuffert, som bade pH-vardet 5,8 och jonstyrkan 0,1, tills den var fri frail perfluorkaprylationer. Oxserumaibuminen var fullstandigt lOst och ett precipitinprov visade att den var ofOrandrad.

I systemet 1-procentig ,oxsernmalburninperfluorkaprylsyra, ar syrans eller dess salts bindning rued oxserumalbuminen oberoende av losningens pH-varde upp till 28-29 molekyler syra per molekyl protein. Bindning av mer On 28-29 molekyler perfluorkaprylsyra per molekyl oxserumalbumin at beroende av fluorforeningens koncentration, pH-vardet och losningens jonstyrka. Allteftersom lOsningens jonstyrka okar, minskar det antal bindningar, som finnes, om antalet molekyler - perfluorkaprylsyra Or mer an 28-29 per molekyl oxserumalbumin. Om antalet bundna perfluorkaprylsyramolekyler Overstiger 2829 per molekyl oxserumalbumin ininskas det markbart, nar losningens koncentration av protein okas. Del maximala antalet bundna molekyler perfluorkaprylsyra per molekyl oxsernmalbumin Or i en 1-procentig losning av proteinet .och vid jonstyrkan 0,1 cirka 40, nar losningens pH .ar hogst en enhet under den isoelektriska punkten, ,och cirka 80, nar losningens pH Or hogst en enhet Over den isoelektriska punkten.

I allmanhet Or bindningen med protein oberoende air pH vid lagre koncentrationer ay anjoniska fluorforeningar. Vid hogre koncentrationer av den anjoniska fluorforeningen dr molforhallandet fluorfOrening/protein sthrre, nar losningens pH ligger Over proteinets isoelektriska punkt On mar pH ligger under den isoelektriska punkten. PA liknande satt Or yid la.ga koncentrationer air fluorforeningen molforhallandet fluorforening/protein oberoende av jonstyrkan. Vid hogre koncentrationer ay fluorforeningen minskar molforhallaudet fluorforening/protein, nar jonstyrkan okar. Graden av bindning for en fluorfOrening med en protein Or i huvudsak ,Oberoende ay temperaturen mom det approximativa romradet 0-50° C.

FOljande fors& visar den verkan koncentrationen air perfluorkaprylsyra har ph forhallandet syra/protein i komplexforeningen.

Exempel 2. En serie eellofan:hylsor, vardera innehallande 2 ml av en 1-procentig vattenlosning av .oxserumalbumin buffrad vid pH 5,8 medelst en acetatbuffert .och med jonstyrkan 0,1, nedsanktes var for sig i 20 ml ay en vattenlosning, buffrad vid so-lima pH och innehallande perfluorkaprylsyra, mars koncentration varierades. Kolven med losning av fluorerad syra ,och (taxi nedsankt cellofanhylsa hölls vid en temperatur av 25° C ,och. skakades 2 timmar. Dialysatet i varje kolv ianalyserades p0 perfluorkaprylatjoner rue-deist .matning air ytspanningen. Resultaten av forsoken framgh av nedansta.ende tabell.

Syrans koncentration molar Molekyler syra bundna per molekyl protein 0,0227 69 0,176 66 0,011 56, 0,0088 49, 0,0066 37,0 0,0044 24,3 0,0022 12,7 0,001 4, Exempel 3. En serie cellofanhylsor, vardera innehallande 2 ml av en 1-procentig losning ay oxserumalbumin, buffrad vid ett pHvarde air 4,6 medelst en acetathuffert och med jonstyrkan 0,1, nedsanktes var for ,sig 20 ml air en vattenlosning, buffrad vid samma pH och med samma jonstyrka samt innehallande perfluorkaprylsyra, mars koncentration varierades i serien ay kolvar. Kolvarna med 15sningarna av fluorerade syror och dari nedsankta eellofanhylsor h011os vid en temperatur air 25° C och skakades 2 timmar. Dialysatet i varje kolv analyserades ph perfluorkaprylatjoner medelst matning ay ytspanningen. Resultaten av forsoken framga av nedanstaende tabell.

Syrans koncentration molar Mal ekyler syra bundna per molekyl protein 0,0148 38 0,011836 0,00889 37 0,00594 28 0,00296 16 0,00148 8, 0,00074 4,0 Exempel 4. 2 ml ay en 1-procentig oxserumalbuminliisning, buffrad vid pH 4,6 me-deist en acetatbuffert ,och med jonstyrkan 0,1 halides i en cellofanhylsa med diametern 1,3 cm. Hylsan nedsanktes i 20 nil av en vattenlOsning ay 0,5-procentig perfluorkaprylsyra, buffrad vid pH 4,6 medelst acetatbuffert och - - med en jonstyrka av 0,1. Kolven innehallande lOsningen av den fluorerade syran och eellofanhylsan bolls vid en temperatur av 25° C och skakades 2 tiramar. Den komplexa foreningen med oxserumalbuminen befann sig i cellofanhylsan i form av en fallning. Analys av dialysatet medelst matning av ytspanningen visade, att i komplexforeningen funnos 36 molekyler perfluorkaprylsyra per molekyl oxserumalbumin. Cellofanhylsan, innehallande den fallda komplexforeningen dialyserades med 50 ml i vatten lost acetatbuffert med ett pH-varde av 4,6 och med jonstyrkan 0,1. Under dialysens gang lostes oxserumalbuminen anyo. Ett precipitinprov visade, att ,oxserumalbuminen var oforandrad.

Oni komplexfareningen av fluorerad alifatisk syra och oxserumalbumin icke innehaller mer an 2-3 molekyler syra per molekyl oxserumalbumin sker icke nagon utfallning, nar pH-vardet for losningen av oxserumalbumin ligger under den isoelektriska punkten. Om antalet molekyler fluorerad syra ãr stk.- re an 2-3 per molekyl .oxserumalbumin, utBiles den komplexa foreningen, nar pH-vardet i oxserumalbuminen ligger under den isoelektriska punkten.

Vid ett pH, seal ligger under den isoelektriska punkten for del protein, som anvandes vid bildning av den komplexa foreningen, av fluorforening och protein, minskar den m.angd fluorerad alifatisk syra, ,som erfordras for att Ma den komplexa fOreningen med Rad molekylvikt hos syran.

Mangden bunden alifatisk fluarsyra i komplexforeningen iikar med en 5kning av kone.entrationen och minskar med en Caning av .syrans molekylvikt. Detta askadliggores i exempel 5.

Exempel 5. En serie dialysforsok utfi3rdes pa samma salt som i exempel 1, varvid man anvande en serie alifatiska perfluorsyror med olika koncentration, var och en buffrad vid pH 4,3 och med jonstyrkan 0,1 och en 1-procentig vattenlosning av oxserumalbumin, buffrad vid samma pH och med samma jonstyrka. Resultaten av forsoken framga av nedanstaende tabell, i vilken vardena i tredje spalten utgora det minimala molforhallandet syra-protein, som erfordras for utfallning air komplexforeningen.

Syrans Syrakoncentration molar Perfluorsmorsyra 0,08150-1 Perfluorkapronsyra 0,011 50-1 Perfluorkaprylsyra 0,006 (3-4)-1 Perfluorkaprinsyra 0,0002-1 Foljande exempel visar den verkan en okning av oxserumalbuminens koncentration har pa mingden bunden alifatisk perfluorsyra i komplexforeningen, och den verkan, som en okning i koncentrationen air alifatisk per fluorsyra bar pu andngden bunden syra i komplexforeningen.

Exempel 6. En serie cellofanhylsor med diametern 1,3 cm, var och en innehallande 2 ml losning av oxserumalbumin, buffrad medelst en. acetatbuffert vid pH 5,8 •och med jonstyrkan 0,1, nedsanktes var for sig i en holy med 20 ml lasning av perfluorkaprylsyraz buffrad vid pH 5,8 medelst en acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1. Kolven med syralosningen och cellofanhylsorna hölls vid en temperatur air 25° C och skakades 2 timmar. Dialysatet analyserades pa perfluorkaprylatjoner genom matning av ytspanningen, varvid skillnaden i fri jonkoncentratian och ursprunglig jonkoncentration i dialysatet utgor den mangd perfluorkaprylatjoner, som ingatt komplexfOrening med ,oxserumalbuminen. Resultaten av forsoken framga av nedanstaende tabell, i vilken anolforhallandet syraprotein komplexforeningen anges i spalt 3.

Syralosningens koncentration i yiktprocent Proteinkisningens koncentration i yiktpro cent 0,2 0,47-1 0,2 1,0 23-1 0,2 2,0 12-1 0,2 4,0 7-1 0,0,100-1 0,1,0 52-1 0,2,0 28-1 0,4,0 14-1 Andra proteiner, sasom ovalbumin, y-globulin fran axe, p-laktoglobulin, ureas, gelatin och serumalbumin Iran manniska ha an bindningskapacitet fiir fluorforeningar, som liknar den, som observerats lies oxserumalbumin, och denna likhet foreligger saval Over som under proteinets isoelektriska punkt.

For perfluorkaprylsyrans del 'Omar sig den maximala bindningen ett mattnadsvarde, sum dr en funktion air saval gransen for syrans loslighet, 1 viktprocent, som det speciella proteinets bindningskapacitet for syra. For en 1-procentig proteinlosning av oxserumalbumin, fl-laktoglobulin, ureas, gelatin, ovalhumin och serumalbumin fran manniska ar vid pH 5,8 och jonstyrkan 0,1 den maximala bindningen respektive 80, 25, 235, 30, 35 och 78 molekyler syra per molekyl protein. Den maximala bindningen for en 1-procentig losning av y-globulin Iran axe, buffrad vid pH 7,5 .och med jonstyrkan 0,1, är 145 molekyler perfluorkaprylsyra per molekyl y-globulin frail axe.

Perfluarforeningar, som aro fullstandigt blandbara med vatten, bilda komplexforeningar med proteiner ,och en jamvikt installer sig mellan den fluorforening, soma ar ,bunden vid proteinet, ioch den fria fluorfOreningen i vattenlOsningen. De forsta 80 molekylerna i sa.- dana fluorforeningar bundna yid en molekyl oxserumalbumin folja en typisk adsorptions- — —a isoterm, nar proteinets koncentration Sr 1 % och losningen liar pH-vardet 5,8 och jonstyrkan 0,1. Ytterligare bindning ager rum, men i mycket lagre grad, med okning i fluorforeningens koncentration. Vid tillsats air en 0,5- procentig vattenlosning av perfluorkapronsyra, en 1-procentig vattenlOsning av perfluorsmorsyra, en 2,2-procentig vattenlOsning air perfluorpropionsyra eller en 0,7-procentig vattenlosning av co-hydroperfluorvaleriansyra, var och en buffrad vid pH 5,8 medelst acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1, till en 1-procentig losning av oxserum-albumin i 'vatten, buffrad yid pH 5,8 medelst en acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1, bindas iner an 80 molekyler av fluorsyran yid en anolekyl av oxserumalbuminen. Den maximala bindningen ay perfluorkaprylsyra, perfluorkaprinsyra, perfluorlaurinsyra, co-hydro-pelargonsyra, cohydro-undecylsyra och co-hydro-tridecylsyra, som erhalles Yid tillsats av mattade vattenlOsningar air syrorna, buffrade vid pH 98 medelst en. acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1, till en 1-procentig vattenlosning air ofserumalbumin, buffrad yid pH 5,8 medelst en acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1, ,ar respektive 80, 10, 6, 33, 8 oeh 4 molekyler syra per molekyl oxserumalbumin.

Allteftersom kedjelangden pa fluorforeningen Mar, minskas markbart den totala mangd joner av fluorforeningen, som erfordras I Sr fullstandig utfallning ay proteinet. Verkan ay joner ay co-hydro-perfluorforeningar vid bindning och utfallning skiljer sig i huvudsak icke Wan verkan ay joner av fullstandigt fluorerade foreningar. Bindningen minskas, allteftersom fluoratomerna ersattas med yateatomer, och minskningen !ar sarskilt markbar, cm fluoratomerna narmast karb:oxylgruppen i fluorerade alifatiska syror ersattas med vateatomer. Bindningen med alkoholer, salter air alkoholer och alkoholderivat liknar bindningen vid de fluorerade syrorna och deras salter. En liknande bindning sker yid .alifatiska fluoraminer och deras salter forutom det, att fallningen av komplexforeningen, fluorforening-protein, sker vid den iosoelektriska punkten eller vid ett pH-varde over den isoelektriska punkten.

Foljande exempel askadliggor ett satt enligt uppfinningen att skilja proteiner fran marandra medelst fraktionerad utfallning av komplexforeningar av fluorforening och protein.

Exempel 7. 2 g ay vardera oxserumalbumin, fibrinogen ,och 7-globulin fran oxe lostes i 250 ml air en vattenlosning av en fosfatbuffert vid pH 7,55 och med jonstyrkan 0,2. Losningen av proteinerna dialyserades med 2 liter 0,5 %-ig vattenlOsning air perfluorkaprylsyra, buffrad med en fosfatbuffert vid pH 7,55 och med jonstyrkan 0,2. Dialysen fortsattes, tills jamvikt uppnaddes. Sma ,mangder ay en vattenlosning ay en acetatbuffert med ett pH-varde av 4,5 .och jonstyrkan 0,2 sattes till losningen ay proteinerna for att sanka pH-vardet. Vid pH-vardet 7,3 blev proteinlos,- ningen grumlig. Ytterligare acetatbuffert till sattes, tills pH-vardet blev 7,0. Den utfalt. da komplexforeningen, fluorforening-protein, centrifugerades ifran och fallningen lostes any° i en vattenlosning av en fosfatbuffert med pH 7,55. Pa samma salt bildades och aylagsnades ytterligare fallningar air komplexforeningar, fluorforening-protein, vid pH 5,2 och 4,8. Vane f alining avlagsnades genom centrifugering och lostes Any° i en vattenlosning ay en fosfatbuffert yid pH 7,55. Den lOsfling, som erholls vid den tredje centrifugeringen, gay yid tillsats av en Riming av acetatbuffert till pH 1,6 icke flagon ytterligare fallning ay proteinhaltiga .amnen. Var °eh en air de tre lOsningar, ,som erhallits vid aterupplosningen av fallningarna i losningar am fosfatbuffert, dialyserades med en vattenlosning ay en fosfatbuffert vid pH 7,55, tills proteinlOsningen blev fri Iran perfluorkaprylatjoner. Proteinerna i losningarna falldes genom tillsats av etanol, filtrerades och tvattades nog- . grant for avlagsnande ay kvarvarande buffertlosning och torkades slutligen i en vakuumugn vid 105° C. Matningar medelst papperselektrofores pa de ursprungliga proteinerna oeh de dialyserade, perfluorkaprylatjonfria proteiner, som erhallits genom fraktionerad utfallning, visade identiska monster. y-globulinet fran ,oxe erholls yid den forsta fallningen och vagde 2,0182 g, fibrinogenet erholls yid den andra fallningen och vagde 1,9943 g och oxserumalbuminet erholls yid den tredje fallningen och vagde 2,0053 g.

Exempel 8. pH-vardet och jonstyrkan 1100 ml normal plasma frail manniska justerades till respektive 7,7 och 0,2 genom tillsats am en vattenlOsning ay fosfatbuffert. Plasmalosningen dialyserades med 1 liter 0,5-procentig perfluorkaprylsyra, buffrad yid pH 7,7, med en fosfatbuffert lost i vatten och med jonstyrkan 0,2. Dialysen fortsattes, tills jamvikt uppnaddes. Sma mangder i vat-ten lost acetatbuffert med pH 4,3 och jonstyrkan 0,2 sattes till plasmalosningen. Komplexforeningen borjade utfallas, nar losningens pH var 7,30. Ytterligare acetatbuffert lost i vatten tillsattes, tills losningens pH var '6,80. Den fallning, ,som bildats yid detta pH, avskiljdes genom centrifugering. Nar proteinlosningens pH justerades ytterligare neat genom tillsats av acetatbuffert lost i vatten, erh011s proteinfallningar Yid pH '6,2, 5,65, 5,5, 5,35, 5,15 och 4,85. Varje fallning avlagsnades genom centrifugering och ytterligare acetatbuffert 18st i vatten sattes till den proteinlosning, som erholls mid vane centri- fugering. Efter avskiljande ay den ,sista fallningen justerades pH-vardet i den lOsning, som erholls fran denna centrifugering, till 4,7 genom tillsats ay acetatbuffert, lost i vat- 6— — ten. Icke flagon utfallning av proteiner erholls. De Ma erhallna fallningarna aterupplOstes var for sig 110 ml av en i vatten lost fosfatbuffert med pH 7,7 och jonstyrkan 0,2. Varje losning halides i den cellofanhylsa och dialyserades med 100 ml i vatten lost fosfatbuffert med pH 7,7 och jonstyrkan 0-,2. Losningen av den forst erhallna fallningen visade vid papperselektrofores ett monster, som liknade y-globulinets, och utgjorde 11,5 % av den totala mfingden utfallt protein. Den andra fallningen visade vid papperselektrofores ett monster, som liknade fl-globulinets, ,och utgjorde 3,3 % av den totala mangden utfallt protein. Den tredje fullningen utgjorde 2,8 % av den totala mangden utfallt protein och papperselektrofores visade, att detta protein var homogent. Den fjarde fallningen utgjorde 3,3 % av den totala mangden utfallt protein och papperselektrofores visade, att det var sammansatt av atminstone tva. kamponenter, troligen euglohuliner. Den femte f allningen utgjorde 0,25 % av den totala mangden fallt protein och papperselektrofores visade, att den var hamogen. Den spite f allningen utgjorde 10 % av den totala mangden fallt protein och elektrofores visade, att den var en blandning, troligen av lipoproteiner. Den sjunde ffillmngen utgjorde 4 % av den totala mangden fdllt protein. ,och papperselektrofores och precipitinprov visade, att den utgjordes av fibrinogen. Den attonde fSllningen utgjorde 55 % av den totala mingden protein, sam fanns i plasmalosningen. Precipitinprov visade att derma proteinfraktion var identisk med fran manniska medelst and-ma metoder erhallen serumalbumin.

Olika typer av fororeningar kunna avlagsnas fran proteiner, genom bildning av en komplexforening av proteinet med en fluorforening. Joner av perfluorforeningar ha sa star affinitet till en protein, att manga vid proteinet bundna fororeningar ersattas med joner av fluorfi3rening. Vattenlosliga fororefinger kunna skiljas fran proteiner genom att proteinlOsningen fOrsattes med joner av fluorforening under det att pH-vardet i proteinlosningen fir huffrat mom ett amrade, i vilket den bildade komplexforeningen, fluorforening-protein utfalles, eller mom ett omrade, i vilket komplexfOreningen Sr loslig. I delta senare fall sker darefter en pH-justering till ett omrade, mom vilket komplexforeningen utffilles. Den utfallda komplexforeningen kan skiljas Iran losningen av vattenlosliga fororeningar, tvattas for avlagsnande av inneslutna fororeningar ocli anyo upplOsas i en buffertlosning i vatten. Fluorforeningen kan franskiljas genom dialys, utspadning eller jonbyte. Det renade protein, som erhalles pa delta sat, Sr icke odenaturerat. Forfarandet fir sarskiIt anyandbart vid isolering av proteinerna i mukoproteiner oeh nukleproteiner. I vatten olOsliga fOroreningar kunna avlagsnas frail proteiner genom att proteinlOsningen forsattes med fluorforeningsjoner mom ett pH-omrade, i vilket kamplexf oreningen, fluarforening-protein, Sr loslig. Den vattenolosliga forareningen i proteinet undantrangdes av fluorforeningen och utfalldes. En Iran fororeningar fri losning av odenaturerat protein kan erhallas efter avlagsnande av de bundna jonema av fluorforening fran komplexforeningen av fluorforening ,och protein. Detta forfarande Sr sarskilt anvandbart vid rening av y-globuliner, enzymer, antitoxiner och virus.

Foljande exempel aska' dliggora rening av proteiner enligt uppfinningen.

Exempel 9. 10 ml 2-procentig vattenkisning av y-globulin Iran oxe, buffrad yid pH 5,8 med en i vatten lost acetatbuffert med jonstyrkan 0,1, halides i en cellofanhylsa med diameter. 1,3 cm. Hylsan nedsanktes i 200 nil vattenlosning av 0,1-procentig perfluorkapronsyra, buffrad vid pH 5,8 medelst acetatbuffert och med jonstyrkan 0,1. Kolven med losningen av perfluorkaprylsyra hells vid en temperatur av 25° C och skakades 2 timmar. Losningen av den bildade komplexforeningen halides ur eellofanhylsan och centrifugerades. Den erhallna centrifugerade losningen dialyserades med 500 ml i vatten lost acetatbuffert med ett pH-varde av 5,8 och jonstyrkan 0,1. rglobulinet fra.n oxe i los- ningen, som var fritt fran perfluorkaprylatjoner, bade vid elektrofores ett mycket skarpare mOnster An monstret av det ursprungliga y-globulinet fran,oxe.

Exempel 10. 0,1 g teknisk ureas lOstes 110 ml av en i vatten lost citratbuffert med pH 6,0. Den grumliga .enzymlosningen centrifugerades. Tillsats av karbamid till 1 ml av den centrifugerade losningen resulterade i en. utveckling av 8 mikromol koldioxid. En tillracklig mangd perfluorkaprylsyra sattes till 1 ml av ureaslosningen for att Ora syrakoneentrationen 1 viktprocent. Koldioxid utvecklades icke vid tillsatsen av karbamid till denna losning. Perfluorkaprylsyra sattes till 1 ml av den centrifugerade .och buffrade ureaslosningen, tills denna inneh011 0,1 viktproeent perfluorkaprylsyra. Losningen av den bildade komplexforeningen, perfluorkaprylsyra-ureas, centrifugerades. Den centrifugerade llisningen halides i en. eellofanhylsa ,och dialyserades med i vatten lost fosfatbuffert med pH 6,0. Den dialyserade ureaslosningen var fri fran perfluorkaprylatjoner och eentrifugerades till sist fiir avlagsnande av sma bottensatser efter dialysen. Tillsats av karbamid till den slutligen erhallna centrifugerade losningen resulterade I en. utveckling av 9,6 mikromol koldioxid.

Den mangd fluorerad alifatisk syra, som erfordras per enhetsmangd protein, for att inga komplexforening med och bilda fanning av komplexfOreningen, fluarerad alifatisk sy- — ra-protein, vid pH vid eller under proteinets isoelektriska punkt, minskar med okad langd pa kolkedja:n hos den fluorerade alifatiska syran. Nar den mangd fluorerad alifatisk syra, som finnes i proteinl5sningen, vars pH-varde ligger Yid eller under proteinets isoelektriska punkt, är .otillracklig for att ge fanning med den bildade komplexforeningen, fluorerad alifatisk syra-protein, är komplexforeningen kansligare for utflockning vid forhajd temperatur an protein, som ej ingatt komplexforening. Komplexforeningen utflockas i detta fall vid 'Ogre temperatur an temperaturen for flockbildning hos protein, som icke ingatt komplexforening. For forhallanden Indian alifatisk fluorsyra .och protein, vid vilka komplexforeningen icke uttalles, varvid losningens pH Jigger vid eller under proteinets isoelektriska punkt resulterar en 'okning i mangden fluorerad alifatisk syra, som Sr komplext bunden vid proteinet, i en minskning av flockningstemperaturen for komplexforeningen.

Foljande exempel visa den verkan, som en Okning i mangden perfluorkapronsyra liar pa 'flockningstemperaturen for .oxserumalbumin, nar syramangden Sr mindre an. vad som erfordras far att bilda en utfalld komplexforening.

Exempel 11. 'En sane cellofanhylsor med diametern 1,3 cm, var och en innehallande 2 ml vattenlosning av 1-procentig oxserumalbumin, buffrad medelst acetatbuffert vid pH 4,85 och med jonstyrkan 0,1, nedsanktes var for sig i en kolv med 20 ml vattenl5sning ay perfluorkapronsyra, buffrad yid pH 4,85 me-deist acetatbuffert -och med jonstyrkan 0,1. Koncentrationen pa syran 1 kolvarna 'Rade i serien. Kolvarna med syralosningar och cellofanhylsor hallos vid en temperatur av 25° C och skakades 2 timmar. Dialysatet analyserades pa perfluorkapronatjoner genom mat-fling av ytspanningen, varvid skillnaden i fri och ursprunglig jonkoncentration i dialysatet utgjorde mangden perfluorkapronatjoner, som ingatt komplexforening med oxseramalbuminet. Innehallet i varje cellofanhylsa halides i ett provror, varefter temperaturen pa losningen i varje provror gradvis hojdes och man observerade, nar flockning intraffade i lasningarna. Resultaten av forsaken framga av nedanstaende tabell.

Syrans koneentration i mol/liter Bunden syra-protein molforhallande Flocknings- temperatur 0,0029 18,2-1 70 0,0058 38,5-1 6 0,0116 79 —1 59 0,0174 111 —1 54 0,0232 143 —1 52 0,029 177 —1 Exempel 12. Serien forsak i exempel 11 upprepades med undantag av att losningarna av oxserumalbumin ,och perfluorkapronsyra buffrades vid pH 5,8. Resultaten av forsiiken I detta exempel framga av .nedanstaende ta bell.

SyransBunden • koncentrationsyra-protein i mol/litermolfOrhallande 0,0029 18,7-1 83 0,0058 39,5-1 86 0,0116 80 —1 90) 0,0174 119 —1 92 0,0232 157 —1 92• 0,029 182 —1 92' Det fenomen, som visas i exempel 11 och 12, kan anyandas for erhallande av protein 1 renad form genom avlagsnande av fororeningar av proteinhaltiga anmen, savida fororeningens isoelektriska punkt ligger hogre an det onskade proteinets. Salunda kan man till en lasning air fororenat protein satin en sâ stor mangd alifatiska perfluorsyror, foretradesvis med 4-6 kolatomer, att de icke racka till att bilda en Mild komplexforening av fororeningen, nar pH-vardet i proteinlosningen buffras vid ett varde, som Jigger under fororeningens isoelektriska punkt och -over det onskade proteinets isoelektriska punkt, ,och uppvarma losningen av proteinernas komplexforeningar, varvid fororeningens komplexforening utflockas. Det onskade proteinet, befriat frail fororeningar, kan sedan erhallas frail losningen efter avlagsnande av den utflockade komplexforeningen.

Claims (2)

Patentansprak: 1. Satt att isolera proteiner i mycket ren och 'odenaturerad form, kannetecknat &ray, att en vattenlosning av minst ett proteinhaltigt amne forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, helt eller delvis fluorerad alifatisk syra, varvid syran bindes vid proteinet och en komplexforening av fluorerad syra ,och protein bildas, att pH-varclet i losningen av komplexforeningen installes huvudsak pa den isoelektriska punkten for proteinet, varigenom komplexforeningen uttalles, .att fallningen franskiljes, att komplexforeningen av fluorerad syra ,och protein spjalkas och att syran avlagsnas. 2. Sat enligt patentanspraket 1 att isolera proteiner i mycket ren och ,odenaturerad form, kannetecknat darav, att en vattenlosning av minst ett proteinhaltigt amne forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, halt eller delvis fluorerad alifatisk syra, sum har en icke polar grupp bunden vid en anjonisk eller katjonisk grupp, varvid pllyardet i den erhallna lasningen skall ligga inom ett omrade, i vilket den fluorerade syran bar en laddning av samma tecken som ladd- Flocknings- temperatur- — ningen pa proteinet, varigenom syran bindes vid proteinet och en losning av en komplexforening av fluorerad syra och protein bildas, att lbsningens pH-varde installes Mom ett .omrade, ungefar fran proteinets isoelektriska punkt till ett pH-varde, vid vilket syran bar en laddning av motsatt tecken till laddningen pa proteinet, varigenom komplexforeningen utfalles, att fallningen franskiljes, att komplexforeningen av fluorerad syra och protein spjalkas och att syran avlagsnas. 3. Modifikation av sattet enligt patentanspraket 1 att isolera ett protein 3. mycket Ten och odenaturerad form frail ett proteinhaltigt material, innehallande en i vatten oloslig fororening, kanneteeknad darav, att en vattenlosning av dot proteinhaltiga materialet forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, hell eller delvis fluorerad alifatisk syra, som har en icke polar grupp bunden vid en anjorisk eller katjonisk grupp, varvid pHVardet i den erhallna lOsningen skall ligga inom ett omrade, i vilket den fluorerade syran bar en laddning ay samma tecken S0111 laddringen pa proteinet, varigenom syran bindes vid proteinet .och en losning av en komplexforening ay fluorerad syra och protein bildas, att den i vatten olosliga fororeningen avTagsnas och alt komplexf5reningen ay fluorerad syra och protein spjalkas och att syran avlagsnas, varigenom del fran fororeningar befriade proteinet erhalles i losning.

1. Modifikation av sattet enligt patentanspraket 1 att fraktionerat separera ett flertal proteiner i mycket ren och odenaturerad form fran en blandning am proteiner med olika isoelektriska punkter, kanrteteckna:d darav, att en vattenl5sning ay en blandning am proteiner forsattes med en minst fyra kolatomer innehallande, helt eller delvis fluorerad alifatisk syra, som bar en icke polar grupp bunden vid en anjonisk eller katjonisk grupp, varigenom den fluorerade syran bindes vid proteinerna och komplexforeningar am fluorerad syra och protein bildas, varvid pH-vardet i den erhallna 15sningen shall ligga mom ett omrade, i vilket de bildade komplexforeningarna aro losliga, att losningens pH-varde upprepade ganger regleras till ett ,omrade, mom vilket en komplexforening utfalles, att varje utfalld komplexforening avlagsnas separat, varje komplexforening av fluorerad syra .och protein spjalkas och att syran avlagsnas. 4. Salt enligt patentanspraket 1, 2; 3 eller 4, kannetecknat darav' att den fluorerade syran utgores ay perfluorkapronsyra. 5. Satt enligt patentanspraket 1, 2, 3 eller 4, kannetecknat darav, att den fluorerade syran utgores av perfluorkaprylsyra. 6. Salt enligt patentanspraket 1, 2 eller 3, kannetecknat darav, att den fluorerade syran utgores av perfluorkaprinsyra. AnfOrda publikationer: Stockholm 196

2. Kungl, Boktr. P. A. Norstedt dc Seiner. 620089