JPH02167068A - 微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有試料中の不溶性画分の処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本鍛明は、微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有
試料中の不溶性画分の処理法に関するものである。

（従来の技術とその課題） 近年、有用な生理活性物質等を見い出す目的で又は遺伝
子組換技術により目的蛋白質を製造する目的で微生物菌
体を培養する機会が増加している。

例えば、目的とする物質等（新規な有用物質の探索にお
いては未知の物質）が培養液に可溶性の形態で放出され
る場合には、培養液から微生物菌体及びその膜断片等の
不溶性画分を分離する必要がある。また例えば、借地に
放出された目的物質が不溶性の場合、培養液から該物質
を不溶性画分として回収する必要がある。更には、遺伝
子組換菌で目的蛋白質を製造する場合、該蛋白質が菌体
内で不溶性凝集塊を形成することがあるが、この場合に
は、菌体を破砕した後、菌体破砕物等と共に不溶性画分
として目的蛋白質を回収する必要がある。

従来からの前記の様な要望に対し、これを解決する手段
として例えば濾過又は遠心分離による不溶性画分の分離
又は回収方法が用いられている。

しかしながら、特に微生物菌体の膜断片等の不溶性画分
はその粒子径が極めて小さいため、目的物質が培養液中
に可溶性の形態で放出される場合にはその分離が困難で
ある等の課題がある。また、目的物質自体が不溶性の形
態である場合、即ち該物質自体を不溶性画分として回収
する場合にも回収は困難であり、収率等が悪化するとい
う課題がある。

以上の様な状況にあって、本発明者らは従来の課題を解
決した微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有試料
中の不溶性画分の処理法について鋭意検討した結果本発
明を完成するに至った。

本発明は、微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有
試料に亜鉛化合物を添加し次いで不溶性画分凝集物を分
離することを特徴とする微生物菌体及び／又は微生物菌
体破砕物含有試料中の不溶性両分の処理法であり、また
、微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有試料中の
不溶性画分の処理法であって、 （ａ）試料に亜鉛化合物を添加する工程、（ｂ）不溶性
画分凝集物を分離する工程、（ｃ）凝集物を懸濁する工
程、 （ｄ）前記工程（ｃ）と同時に又はその後、凝集物にキ
レート剤を接触させる工程、 からなる方法である。以下本発明の詳細な説明する。

（課題を解決するための手段） 本発明において、微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕
物含有試料（以下試料と略す）とは、例えば微生物菌体
を培養した培養派若しくは該培養液から公知の方法で菌
体を除去した培養液又は微生物菌体を例えば超音波処理
等で破砕した菌内破砕物懸濁液である。また、本発明の
処理法は、それを使用する者の意図するところにより、
試料からの不溶性画分の分離（除去）のための処理法で
あり、試料からの不溶性画分の回収のための処理法であ
る。ここで不溶性画分とは、菌体それ自体又は菌体に由
来する膜断片等及び不溶性の形態で培養液中に放出され
た若しくは不溶性凝集塊等として菌体内に蓄積された目
的とする蛋白質を意味する。

本発明の方法で使用する亜鉛化合物としては特別の制限
はないが例えば塩化亜鉛、酢酸亜鉛等が例示できる。

本発明の方法では、前記した亜鉛化合物を試料に添加し
、次いで不溶性画分凝集物を分離する。

分離は例えば遠心分離、濾過等の通常の処理方法に従っ
て処理することにより達成される。大量の処理を要する
場合には、濾過１摸の目づまり等の観点から遠心分離処
理を採用することが好ましい。

本発明の方法を実施する場合の亜鉛化合物の試料への添
加量は、試料中の不溶性画分量及び採用する分離のため
の手段の詳細を考慮して適宜決定すれば良い、採用する
分離のための手段の詳細とは、例えば該手段として遠心
分離を採用する場合には、遠心時間１回転数等の諸条件
を意味する。

以上の様な本発明の方法により、試料中の不溶性画分を
分離することができる。この方法は、目的物質が可溶性
の形態で存在する試料にあっては目的物質の精製のため
の手段として、目的物質が不溶性の形態で存在する場合
にはその回収又は濃縮の手段として有用である。

本発明の方法で得られる不溶性画分凝集物には、その理
由は定かでないが、可溶性物質が混入する場合がある０
本発明者らの知見によれば、添加する亜鉛の量が多いほ
どその量は増加する。

本発明は、分離された不溶性画分凝集物を懸潤し、該凝
集物にキレート剤を接触させる方法をも提供する。前記
した様に、不溶性画分凝集物には可溶性物質が含まれて
いる場合がある。従って、本発明の方法では、凝集物か
らの可溶性物質の回収又は不溶性画分の精製等に有用で
ある。

本発明の方法で使用するキレート剤としては特別の制限
はないが、例えばＥＤＡ、ＥＧＴＡ等の通常のキレート
剤が例示できる。接触量は、得られた凝集物の量及び先
に添加した亜鉛化合物の量を考慮して決定すれば良い。

キレート剤の接触は、例えは懸濁の工程で使用する＃ｌ
ｌ液液に予め添加しておくことで懸濁の工程と同時に行
っても良いし、懸濁工程の終了後に行っても良い。

キレート剤の接触により、凝集物中の可溶性物質を懸澗
ン夜上清に得ることができる。

（発明の効果） 本発明の方法により、試料中の不溶性画分を簡便に分離
することかできる。従来は、不溶性画分でありながら極
めて微小であるため、その分離に例えば強力な遠心操作
を長時間に渡って実施することが必要であったが、本発
明の方法では、例えは微弱な遠心操作を短時間行うのみ
で実施可能である。

以上の事実は、既存の工業設備及びプロセス等の大幅な
変更を必要とせずに、例えば強力な遠心操作を行うため
にローターを高速で回転させる等の危険な工程を必要と
せず、従って安全に実施でき、また消費するエネルギー
等を減少させることを可能とする。

以下本発明を更に詳細に説明するなめ実施例を記載する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例） 実施例１ プロウロキナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミ
ドで形質転換された大腸菌（この大腸菌は微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、微工研
条寄第９７０号として寄託されている）を通常の培養液
中で培養し、プロウロキナーゼを製造した。プロウロキ
ナーゼは培養液中には放出されず、菌体内に蓄積された
。

培養液中の菌体濁度が６００ｎｍの吸光度で４０となっ
た時点で、培養液に対しそれぞれ０〜０．５重量％の塩
化亜鉛を添加し、２２００〜６０００ｘｇで２分間の遠
心分離操作を行った。

なお、対照として、塩化亜鉛を添加せず、遠心分離を行
なわないもの等を用意した。

６００　ｎｍの吸光度を測定し、それぞれの試料につい
ての遠心操作後の上清濁度を調査した。結果を表１に示
す。

表１ 以上の様に、塩化亜鉛を添加した場合には無添加の場合
に比較して小さい遠心力により菌体を回収することがで
きる。

分離操作により回収した０回収した大腸菌をゴーリンホ
モジナイザーで破砕し、国体破砕物溶液を得た。該溶液
に０〜０．５重量％の塩化亜鉛を添加し、２２００〜１
１２００ｘｇで２分間の遠心分離操作を行った。温菌体
１ｇから得られた不溶性画分凝集物を２５０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸ニナトリウム塩）
溶液に懸濁し可溶性物質を除去した後、凝集物中のプロ
ウロキナーゼを特開昭５９−１６１３２１号に記載され
た方法で再武活化した。大酒化されたプロウロキナーゼ
について１０テアーゼ処理を行いウロキナーゼに変換し
た後ウロキナーゼの特異的基質として知られるピログル
タミル・グリシル・アルギニルパラニトロアニリド塩酸
塩を用いてその比活性を測定した。結果を表２に示す。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた大腸菌を、遠心表２ 以上の様に画体中の不溶性のプロウロキナーゼを回収す
る場合においても、塩化亜鉛を添加することで、無添加
の場合に比較して小さい遠心力より不溶性画分を回収す
ることができる。

特許出願人　　東ソー株式・会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有試料
   に亜鉛化合物を添加し次いで不溶性画分凝集物を分離す
   ることを特徴とする微生物菌体及び／又は微生物菌体破
   砕物含有試料中の不溶性画分の処理法。
2. （２）微生物菌体及び／又は微生物菌体破砕物含有試料
   中の不溶性画分の処理法であって、 （ａ）試料に亜鉛化合物を添加する工程、 （ｂ）不溶性画分凝集物を分離する工程、 （ｃ）凝集物を懸濁する工程、 （ｄ）前記工程（ｃ）と同時に又はその後、凝集物にキ
   レート剤を接触させる工程、 からなる方法。